黃靖妍，楊　曦

(1.北華大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 吉林　132011；2.吉林市龍?zhí)秴^(qū)婦幼保健院，吉林 吉林　132021)

?

rHEPO對(duì)大鼠急性視網(wǎng)膜光損傷的保護(hù)作用及時(shí)效性研究

黃靖妍1，楊曦2

(1.北華大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 吉林132011；2.吉林市龍?zhí)秴^(qū)婦幼保健院，吉林 吉林132021)

目的探討重組人促紅細(xì)胞生成素(rHEPO)對(duì)大鼠急性視網(wǎng)膜光損傷的保護(hù)作用及時(shí)效性.方法選取4周齡雄性SD大鼠48只，隨機(jī)分成5組：正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、模型治療1、2、3組，其中正常對(duì)照組8只，其余各組均為10只，應(yīng)用手術(shù)顯微鏡(光照強(qiáng)度為(22 000±1 000) lux)對(duì)模型各組造模.模型治療1、2、3組：分別在光照前4 h、光照后立即、光照后3 d按照5 000 IU/kg腹腔注射rHEPO 1次.模型對(duì)照組：光照前后均未給予藥物干預(yù).7 d后處死所有大鼠，摘取眼球，應(yīng)用蘇木精-伊紅(HE)染色觀察視網(wǎng)膜的變化；應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法檢測Caspase-3的表達(dá).結(jié)果1)HE染色：正常對(duì)照組中大鼠視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)完整，層次分明，排列整齊，細(xì)胞核形態(tài)規(guī)整，染色均勻.模型對(duì)照組中大鼠視網(wǎng)膜光感受器內(nèi)、外節(jié)排列紊亂，有空泡形成，部分?jǐn)嗔?；外核層較正常對(duì)照組明顯變薄(P<0.05)，核間隙加大，部分有碎核現(xiàn)象.模型治療各組大鼠視網(wǎng)膜光感受器內(nèi)、外節(jié)排列紊亂，有小空泡形成；外核層較正常對(duì)照組有不同程度變薄(P<0.05)，模型治療1、2組好于模型對(duì)照組(P<0.05)，且1組優(yōu)于2組(P<0.05)，模型治療3組與模型對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.2)Caspase-3表達(dá)：與正常對(duì)照組相比，模型各組的Caspase-3表達(dá)均有所增強(qiáng)(P<0.05)；模型治療1、2、3組表達(dá)依次增強(qiáng)，兩兩比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；模型對(duì)照組與模型治療3組表達(dá)最強(qiáng)，二者之間無差異(P>0.05).結(jié)論rHEPO對(duì)視網(wǎng)膜光損傷具有保護(hù)作用，并具有一定的時(shí)效性，早期用藥效果好，其中光損傷前4 h預(yù)用藥優(yōu)于光損傷后立即用藥.

重組人促紅細(xì)胞生成素；視網(wǎng)膜光損傷；Caspase-3；細(xì)胞凋亡

【引用格式】黃靖妍，楊曦.rHEPO對(duì)大鼠急性視網(wǎng)膜光損傷的保護(hù)作用及時(shí)效性研究[J].北華大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2016，17(5)：628-631.

隨著科技的發(fā)展、環(huán)境的改變，各種光污染導(dǎo)致的視網(wǎng)膜光損傷問題逐步引起人們的重視.迄今為止，視網(wǎng)膜光損傷的機(jī)制還不十分清楚，多年來的研究發(fā)現(xiàn)其病理特征主要為視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞的凋亡[1].促紅細(xì)胞生成素(EPO)是具有多種能力的生長因子，具有抗凋亡[2]、抗氧化[3]等作用.Grimm等[4]還發(fā)現(xiàn)：對(duì)于光損傷導(dǎo)致的視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的變性凋亡，采用缺氧預(yù)處理提高內(nèi)源性EPO濃度，能夠減少感光細(xì)胞的凋亡.但有關(guān)EPO對(duì)于視網(wǎng)膜光損傷時(shí)效性的研究報(bào)道較少.本實(shí)驗(yàn)通過手術(shù)顯微鏡光源制備大鼠急性視網(wǎng)膜光損傷模型，在不同時(shí)間點(diǎn)應(yīng)用rHEPO進(jìn)行干預(yù)治療，觀察視網(wǎng)膜組織形態(tài)的變化及Caspase-3蛋白表達(dá)情況，探討rHEPO對(duì)大鼠急性視網(wǎng)膜光損傷的作用以及時(shí)效性.

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

選取4周齡SD大鼠48只，雄性，體質(zhì)量180～270 g，隨機(jī)分成5組：正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、模型治療1、2、3組，其中正常對(duì)照組8只，其余各組均為10只.動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)使用條件符合國家科學(xué)技術(shù)委員會(huì)的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》，大鼠在標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)房內(nèi)進(jìn)行喂養(yǎng)(室溫調(diào)節(jié)在21～24 ℃之間，空氣流通，相對(duì)濕度55.0%)，晝夜明暗交替光環(huán)境適應(yīng)1周.

1.2主要儀器和藥品

手術(shù)顯微鏡(日本TOPCON OMS-50)；照度計(jì)(臺(tái)灣泰仕TES-1339)；Caspas-3兔抗鼠多克隆抗體、免疫組化試劑盒(SP法)、濃縮型DAB試劑盒 (北京中杉生物工程有限公司)；多聚甲醛(常州市玉宇化工有限公司)；水合氯醛(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，產(chǎn)品批號(hào)：20131128)；烏拉坦(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，產(chǎn)品批號(hào)：20130715)；復(fù)方托比卡胺滴眼液(瑞眸舒，5 mL/支，長春迪瑞制藥有限公司，產(chǎn)品批號(hào)：140602)；重組人促紅素注射液(賽博爾，1.0 mL/3 000 IU/支，深圳賽保爾生物藥業(yè)有限公司，產(chǎn)品批號(hào)：201408029)

1.3麻醉藥及其配制

取水合氯醛10 g溶解于100 mL的生理鹽水中，配制成10%的水合氯醛溶液，劑量為0.4 g/kg；取12.5 g烏拉坦溶解于50 mL的生理鹽水，配制成25%的烏拉坦溶液；取50 mL 10%水合氯醛溶液與配制好的烏拉坦溶液50 mL 1∶1混合在一起，搖勻，混合液最終濃度水合氯醛為5%，烏拉坦為12.5%.剩余50 mL 10%水合氯醛溶液留作追加劑量時(shí)使用，每次實(shí)驗(yàn)前麻藥均新鮮配制.

1.4造模及給藥

對(duì)模型對(duì)照組及模型治療組給予造模處理.光照前充分暗適應(yīng)24 h，大鼠按5 mL/kg抽取上述1∶1混合麻藥腹腔注射全麻，雙眼用復(fù)方托吡卡胺滴眼液充分散瞳后置于手術(shù)平臺(tái)上，垂直照射右眼(照射右眼時(shí)，左眼遮蓋)，光照強(qiáng)度為(22 000±1 000) lux，距角膜距離為(150±3) mm，垂直照射大鼠瞳孔，照射時(shí)間為1 h，光照過程中確保角膜完全暴露，角膜間斷滴生理鹽水保持眼球表面的濕潤.右眼照射結(jié)束后照射左眼，遮蓋右眼.中途大鼠若有蘇醒，用10%水合氯醛按4 mL/kg追加劑量1次,室溫控制在21～24 ℃左右.全部照射完成后送入暗房暗適應(yīng)24 h，最后送入標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)房內(nèi)正常喂養(yǎng).模型治療1、2、3組分別在光照前4 h、光照后立即、光照后3 d按照5 000 IU/kg腹腔注射rHEPO 1次,模型對(duì)照組無任何藥物干預(yù)治療.

1.5組織病理切片的制作及圖像采集分析

光照后7 d處死動(dòng)物，速取眼球，用4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，采用石蠟切片機(jī)(萊卡2245)平行于角膜至視盤的矢狀位連續(xù)切片，厚度4 μm.取通過視盤中央的切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色，中性樹膠封片，觀察視網(wǎng)膜各層的改變,并應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法檢測Caspase-3蛋白在視網(wǎng)膜中的表達(dá).采用OLYMPUS BX51獲取顯微圖像，應(yīng)用Simple PCI圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析.

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用方差分析的方法對(duì)計(jì)量資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，取α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn).

2　結(jié)　　果

2.1HE染色結(jié)果

正常對(duì)照組：正常大鼠視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)層次分明，排列整齊，光感受器細(xì)胞內(nèi)、外節(jié)界限清晰，內(nèi)、外核層排列緊密，細(xì)胞核形態(tài)規(guī)整，染色均勻.模型對(duì)照組：視網(wǎng)膜光感受器內(nèi)、外節(jié)排列紊亂，有空泡形成，部分?jǐn)嗔?；外核層較正常對(duì)照組明顯變薄，核間隙加大，部分有碎核現(xiàn)象；內(nèi)核層也有部分碎核現(xiàn)象，厚度較正常對(duì)照組輕度變薄.模型治療各組：視網(wǎng)膜光感受器內(nèi)、外節(jié)排列紊亂，有小空泡形成；外核層較正常對(duì)照組有不同程度變薄，但好于模型對(duì)照組；內(nèi)核層形態(tài)尚好，與正常對(duì)照組比較厚度無明顯變化.見圖1.各組外核層厚度見表1.

2.2Caspase-3表達(dá)結(jié)果

Caspase-3表達(dá)陽性表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有黃色或棕黃色顆粒.正常對(duì)照組視網(wǎng)膜內(nèi)、外核層的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見少許表達(dá)陽性的細(xì)胞；而模型對(duì)照組Caspase-3表達(dá)陽性的細(xì)胞在視網(wǎng)膜外核層的細(xì)胞質(zhì)中呈彌漫分布，內(nèi)核層也有部分棕黃色顆粒，較正常對(duì)照組表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.05)；模型治療1、2、3組表達(dá)強(qiáng)度介于兩者之間，且表達(dá)強(qiáng)度依次增強(qiáng).應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行平均吸光度測定，將切片的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)轉(zhuǎn)化為數(shù)字定量.見表1.

表1各組外核層厚度及Caspase-3的平均吸光度值

注：與正常對(duì)照組比較，*：P<0.05；與模型對(duì)照組比較，#：P<0.05；與模型治療1組比較，&：P<0.05

3　討　　論

多年來的研究表明：視網(wǎng)膜光損傷的機(jī)制主要包括熱損傷、機(jī)械損傷和光化學(xué)損傷，其中光化學(xué)損傷是最常見的一種類型.大自然中的紫外線、可見光、日常用的燈及電子設(shè)備的熒光屏、眼科光學(xué)診療器械的光源等均可能引起視網(wǎng)膜光化學(xué)損傷.隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)其主要的病理表現(xiàn)為視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的凋亡.劉學(xué)政等[5]研究發(fā)現(xiàn)：視網(wǎng)膜外核層的面積和視細(xì)胞凋亡的變化規(guī)律具有相關(guān)性，視細(xì)胞凋亡的越多，外核層的面積越小.光損傷啟動(dòng)了視細(xì)胞的凋亡，后者導(dǎo)致外核層細(xì)胞核的丟失.本研究中模型各組的外核層厚度較正常對(duì)照組有不同程度的減少，也驗(yàn)證了這個(gè)結(jié)論.

細(xì)胞凋亡的發(fā)生與許多基因調(diào)控與表達(dá)有關(guān)，如bcl家族、P53基因、C-myc基因、Fas/Fas-L、半胱氨酸蛋白酶家族(Caspase)、凋亡前體Apaf-1、活性氧自由基ROS等，其中Caspase家族是細(xì)胞凋亡下游的關(guān)鍵酶，通常以無活性的蛋白酶原形式存在于細(xì)胞內(nèi).在氧化損傷、缺血低氧等誘導(dǎo)凋亡信號(hào)的刺激下，酶原被活化，并形成活化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，通過次序激活Caspase蛋白，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡.Caspase-3是下游的Caspase蛋白，大多數(shù)觸發(fā)細(xì)胞凋亡的因素最終均需要通過Caspase-3介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑來實(shí)現(xiàn)[6].因此，Caspase-3是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行因子.Cong等[7]的研究發(fā)現(xiàn)：在視網(wǎng)膜光照60 min后，Caspase-3的表達(dá)增加，視網(wǎng)膜細(xì)胞表現(xiàn)出光毒性損害.

rHEPO是利用基因工程技術(shù)將人的紅細(xì)胞生成素基因轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，高效表達(dá)的rHEPO能刺激紅細(xì)胞生成一種酸性糖蛋白，與人體內(nèi)天然分離的促紅細(xì)胞生成素(EPO)相比，具有完全相同氨基酸排列序列，且與體內(nèi)、外生物學(xué)活性基本一致[8].EPO主要通過促進(jìn)骨髓中紅系祖細(xì)胞的存活、增殖和分化以調(diào)控紅細(xì)胞的生成，改善人體的缺氧狀態(tài)，臨床上主要用于治療腎性貧血.此外，EPO對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和視網(wǎng)膜具有顯著的神經(jīng)保護(hù)和修復(fù)作用.Rex TS等[9]在對(duì)視網(wǎng)膜色素變性大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)：EPO能夠減少神經(jīng)元凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用.王紅云等[10]用自制光照箱(光照強(qiáng)度(6 000.0 ±106.9) lux)對(duì)大鼠視網(wǎng)膜進(jìn)行光損傷制模，并通過腹腔注射rHEPO的方法進(jìn)行治療，通過觀察發(fā)現(xiàn)：腹腔注射rHEPO對(duì)小鼠視網(wǎng)膜光損傷具有保護(hù)作用.

本研究中模型治療1、2組的視網(wǎng)膜組織切片形態(tài)、外核層厚度以及Caspase-3表達(dá)雖然比正常對(duì)照組差，但較模型對(duì)照組均有不同程度的改善，而模型治療3組與模型對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明rHEPO對(duì)視網(wǎng)膜光損傷具有保護(hù)作用，并具有一定的時(shí)效性，早期用藥效果好，其中光損傷前4 h預(yù)用藥優(yōu)于光損傷后立即用藥.本研究結(jié)果顯示：rHEPO對(duì)視網(wǎng)膜光損傷的保護(hù)機(jī)制可能與抑制Caspase-3的表達(dá)、減少細(xì)胞凋亡有關(guān).

[1] Abler A S，Chang C J，F(xiàn)ul J.Photic injury triggers apo- ptosis of photoreceptor cells[J].Res Common Molp- harmacol，1996，92(2)：177-189.

[2] Bartesaghi S，Marinovich M，Corsini E，etal.Erythropo- ietin:a novel neuroprotective cytokine[J].Neurotoxi- ncology，2005，26(5):923-928.

[3] Gawad A E，Schlichting L，Strauss O，etal.Antiapoptotic properties of erythropoietin:novel strategies for protection of retinal pigment epithelial cells[J].Eye(Lond)，2009，23(12):2245-2250.

[4] Grimm C，Wenzel A，Stanescu D，etal.Constitutive over expression of human erythropoietin protects the mouse retina against induced but not inherited retinal degene- ration[J].J Neurosci，2004，24(25)：5651-5658.

[5] 劉學(xué)政，高顯會(huì)，蕭鴻，等.實(shí)驗(yàn)性大鼠視網(wǎng)膜光損傷與視細(xì)胞凋亡的關(guān)系[J].眼視光學(xué)雜志，2002，4(4):217-221.

[6] Woo M，Hakem R，Soengas M S，etal.Essential contr- ibution of caspase-3/CPP32 to apoptosis and its associ- ated nuclear changes[J].Genes Dev，1998，12(6):806-819.

[7] Cong Y，Qiu Y，Song Z，etal.Effects of single intravitreal rhEPO injection on light-induced retinal injury in rats[J].Curr Eye Res，2011，36(8):739-746.[8] Egrie J C，Strick land T W，Lane J，etal.Characterization and biological effects of recombinant human erythropoietin[J].Immunobiology，1986，172:213-224.[9] Rex T S，Wong Y，Kodali K，etal.Neuroprotection of photoreceptors by direct delivery of erythropoietin to the retina of the retinal degeneration slow mouse[J].Exp Eye Res，2009，89(5):735-740.

[10] 王紅云，牛膺筠，王培嵩，等.重組人促紅細(xì)胞生成素對(duì)小鼠視網(wǎng)膜光損傷的防護(hù)作用[J].中華眼科雜志，2005，41(5):434-438.

【責(zé)任編輯：陳麗華】

Protective Effect and Timeliness of Recombinant Human Erythropoietin on Acute Retinal Light Injury in Rats

Huang Jingyan1,Yang Xi2

(1.Affiliated Hospital of Beihua University，Jilin 132011，China；2.LongtanDistrictMaternalandChildHealthHospital，Jilin132021，China)

Objective To observe the protective effect and timeliness of Recombinant Human Erythropoietin(rHEPO) on retinal light damage in rats.Method 48 rats with 4-week-old SD were randomly divided into 5 groups:normal control group，model control group，model treatment group 1，2，3；8 rats in normal control group and 10 rats in other groups.We used the light of surgical microscope to continuously irradiate the retina of SD rats in model groups to form the model of retinal light damage.RHEPO were given by peritoneal injection to model treatment group 1，2，3 according to the following time successively:4 hours before irradiation，immediately after irradiation，3 d after irradiation.All the rats were killed 7 days later and the eyes were excised.Hematoxylin eosin (HE) staining were applied to observe retinal changes.Immunohistochemistry methods were used to detect the expression of Caspase-3.Results Histology analysis:In normal control group，the retinal structure was complete and regular，and the staining was uniform.In model control group，the inner and outer segments of photoreceptor were arranged in disorder，the phenomenon of vacuolation and fracture were seen in outer segments.The outer nuclear layer became thinner(P<0.05),nuclear became denser and nuclear clearance became larger.rHEPO groups showed less damage than the model control group.There was significant difference between two groups except model treatment group 3 and model control group.Conclusion rHEPO is effective on repairing retinal light damage，but it has certain timeliness.Early intervention is more effective than later treatment，especially in 4 hours before light injury.

Recombinant Human Erythropoietin；retinal light damage；Caspase-3；apoptosis

1009-4822(2016)05-0628-04

10.11713/j.issn.1009-4822.2016.05.015

2016-07-10

吉林市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(201339028).

黃靖妍(1972-)，女，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事兒童斜弱視、屈光不正臨床研究，E-mail：jccddn@163.com.

R775.9

A