謝有科　黃丁平

廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院腫瘤科，南寧530011

康萊特對(duì)晚期乳腺癌患者外周血CD4及PD-1陽(yáng)性T細(xì)胞的影響△

謝有科#黃丁平

廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院腫瘤科，南寧530011

目的檢測(cè)康萊特（KLT）對(duì)晚期乳腺癌患者外周血CD4+及程序性死亡分子1（PD-1）陽(yáng)性T細(xì)胞比例的影響，探討KLT在乳腺癌患者中誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的作用。方法選取接受過(guò)化療或內(nèi)分泌治療后腫瘤進(jìn)展的晚期乳腺癌患者30例，以KLT注射液處理；處理前后取外周血經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)治療前后外周血中CD4+和CD4+PD-1+T淋巴細(xì)胞數(shù)量變化。并選取同期健康體檢者20名為對(duì)照組，常規(guī)抽血檢測(cè)。結(jié)果晚期乳腺癌患者治療前外周血CD4+T細(xì)胞較健康人群低，而CD4+PD-1+T細(xì)胞的比例較健康人群高；經(jīng)KLT治療后的晚期乳腺癌患者外周血CD4+T細(xì)胞較治療前顯著增高，而CD4+PD-1+T細(xì)胞的比例較治療前顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論KLT有效降低晚期乳腺癌患者外周血CD4+PD-1+T淋巴細(xì)胞比例，減弱機(jī)體腫瘤免疫抑制狀態(tài)。

乳腺癌；康萊特；CD4；PD-1；免疫

Oncol Prog，2016，14（6）

乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是多因素共同參與的復(fù)雜過(guò)程，與機(jī)體免疫功能密切相關(guān)。免疫監(jiān)視的失能，T細(xì)胞功能缺失及免疫抑制因子的產(chǎn)生是腫瘤免疫耐受的重要原因。程序性死亡分子1（programmed death-1，PD-1）是細(xì)胞免疫調(diào)控中的負(fù)性調(diào)控分子，主要表達(dá)于淋巴細(xì)胞表面。研究證明，PD-1及其配體PD-L1通路在腫瘤細(xì)胞和其浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞中的表達(dá)與部分惡性腫瘤患者預(yù)后密切相關(guān)［1-2］。PD-1/PD-L1阻斷劑（如KEYTRUDA、Opdivo）在非小細(xì)胞肺癌和黑色素瘤等臨床試驗(yàn)中顯示出了巨大的臨床潛力，以PD-1/PDL1為代表的免疫治療成為繼手術(shù)治療、化療、放療、分子靶向治療之后的新方法［3-4］。但這些PD-1單抗藥物價(jià)格昂貴，存在不同程度不良反應(yīng)，在臨床上受到一定的限制。傳統(tǒng)中醫(yī)中藥在調(diào)節(jié)身體亞健康狀態(tài)和免疫平衡等方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)。以薏苡仁為原料制備而成的多功能藥物康萊特（KLT）具有直接抗腫瘤作用和多種免疫調(diào)節(jié)作用，在臨床上廣泛應(yīng)用于免疫調(diào)節(jié)和輔助化療，并取得較好的療效［5-7］。本研究探討CD4+T淋巴細(xì)胞作為機(jī)體細(xì)胞免疫功能的重要組成部分，KLT對(duì)晚期乳腺癌患者外周血中CD4+和（或）PD-1+T細(xì)胞的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料

選取2014年12月至2015年8月收治的晚期乳腺癌患者30例，年齡38～85歲，中位年齡57歲。其中Ⅲb期11例，Ⅳ期19例；病理類(lèi)型：浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌24例，浸潤(rùn)性小葉癌6例。入組標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理、影像等檢查，確診為浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌或浸潤(rùn)性小葉癌，至少接受過(guò)內(nèi)分泌治療和（或）解救化療，出現(xiàn)內(nèi)分泌治療耐藥或不耐受化療合并腫瘤進(jìn)展。排除標(biāo)準(zhǔn)：有心腦腎等重要器官功能異常；預(yù)期存活時(shí)間＜3個(gè)月。另取20名同期體檢健康者作為對(duì)照組，中位年齡52歲。

1.2治療方法

乳腺癌患者按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)予靜脈滴注康萊特注射液200 ml，每日1次，3周為一個(gè)療程，治療期間予支持治療，不行化療或靶向治療等抗腫瘤治療，休息2～7 d后進(jìn)行第2個(gè)療程，共行兩個(gè)療程。

1.3檢測(cè)指標(biāo)

乳腺癌患者在治療前和治療后1周分別抽靜脈血5 ml進(jìn)行檢測(cè)。健康體檢者即時(shí)抽取靜脈血。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)乳腺癌患者治療前后和健康體檢組外周血中CD4及PD-1雙陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞比例，并進(jìn)行分析。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)流程如下：取混勻后的外周血每管100 μl，加入10 μl Fc受體封閉液（美國(guó)BD公司），混勻，置于室溫10 min；再加入5 μl熒光抗體：PE-anti-hCD4抗體（sc-1176PE，購(gòu)于Santa Cruz公司），F(xiàn)ITC-anti-hPD-1抗體（ab95791，購(gòu)自abcam公司），混勻，置于室溫，避光孵育30 min，加入磷酸鹽緩沖生理鹽水（PBS），2000 r/min，5 min離心以除去非特異性結(jié)合抗體；加入1 ml紅細(xì)胞裂解工作液（購(gòu)自美國(guó)BD公司）置于室溫10 min，離心后棄上清，再以PBS洗滌1次；然后用少量PBS重懸細(xì)胞，上機(jī)分析。采用流式細(xì)胞儀（BD FACS ARIA）進(jìn)行檢測(cè)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)-軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1兩組外周血中CD4+、PD-1+T細(xì)胞比例比較

晚期乳腺癌患者外周血中CD4+細(xì)胞低于對(duì)照組，而CD4與PD-1雙陽(yáng)性T細(xì)胞比例高于對(duì)照組，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001、0.003）。（表1、圖1）+T細(xì)胞比例比較

表1　晚期乳腺癌患者與健康人群組外周血T細(xì)胞亞群比較（%±s）

表1　晚期乳腺癌患者與健康人群組外周血T細(xì)胞亞群比較（%±s）

2.2治療前后患者外周血CD4+PD-1+T細(xì)胞比例比較

KLT治療后晚期乳腺癌患者外周血CD4+PD-1+T細(xì)胞的比例較治療前顯著降低，CD4+T細(xì)胞較治療前顯著增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（表2、圖1）

圖1　晚期乳腺癌患者及對(duì)照組患者外周血中CD4+及PD-1+T細(xì)胞比例

表2　晚期乳腺癌患者治療前后外周血T淋巴細(xì)胞亞群比例比較（%±s）

表2　晚期乳腺癌患者治療前后外周血T淋巴細(xì)胞亞群比例比較（%±s）

3　討論

乳腺癌患者經(jīng)過(guò)內(nèi)分泌治療如他莫昔芬、芳香化酶抑制劑和（或）卵巢功能抑制后出現(xiàn)全身多發(fā)轉(zhuǎn)移，進(jìn)入腫瘤晚期。對(duì)于晚期乳腺癌患者，目前臨床治療方法包括化療，曲妥珠單抗靶向治療，新型內(nèi)分泌藥物（如氟維司群）和新型藥物（palbociclib、依維莫司等）治療［8］。從國(guó)內(nèi)臨床實(shí)踐來(lái)看，化療并不能阻止腫瘤的進(jìn)展，而一些新的治療方法，如靶向藥物、新型藥物等都因價(jià)格昂貴而阻礙其在臨床上的應(yīng)用。PD-1/PD-L1阻斷劑作用機(jī)制研究表明，當(dāng)CD4+T細(xì)胞存在的情況下，PD-L1阻斷劑首先阻斷CD4+T細(xì)胞表面的PD-L1，繼而活化CD4+T細(xì)胞；當(dāng)CD4+T細(xì)胞活化后才開(kāi)始阻斷CD8+T細(xì)胞表面PD-L1進(jìn)而活化CD8+T細(xì)胞。因?yàn)槟[瘤誘導(dǎo)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可抑制免疫應(yīng)答［9］，削弱CD8+T細(xì)胞在抗腫瘤中的作用，所以PD-1/PD-L1阻斷劑的腫瘤殺傷效應(yīng)在無(wú)CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)時(shí)效率更高［10］。PD-1/PD-L1阻斷劑給人們帶來(lái)全新的啟示：通過(guò)抑制腫瘤組織內(nèi)浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞可以激活機(jī)體腫瘤免疫，從而得到持久的抗腫瘤免疫效果。

PD-1是表達(dá)于多種腫瘤表面的共抑制分子，它在介導(dǎo)乳腺腫瘤細(xì)胞免疫逃逸中起著重要作用。PD-1的主要配體PD-L1（B7-H1）選擇性地表達(dá)在許多腫瘤上和腫瘤微環(huán)境內(nèi)的抗原提呈細(xì)胞、活化T細(xì)胞、活化B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞上。而CD4+T淋巴細(xì)胞分為多個(gè)功能亞群，在抗腫瘤免疫中起關(guān)鍵作用，在癌癥患者中表達(dá)水平普遍降低。研究表明，CD4+T淋巴細(xì)胞表達(dá)抑制性分子PD-1在不同健康狀態(tài)下呈現(xiàn)不同的改變，如胃腺癌患者外周血中CD4+T細(xì)胞表面PD-1表達(dá)較健康人群明顯上調(diào)，而且晚期患者外周血CD4+PD-1+T細(xì)胞的比例明顯高于早期患者［1］。而腫瘤內(nèi)浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TIL）因腫瘤細(xì)胞原因而處于功能受損或缺失狀態(tài)，特別是乳腺癌組織中PD-1+、TIL和FOXP3+（forkhead box P3+），TIL往往提示預(yù)后不佳［11］。本研究結(jié)果顯示，晚期乳腺癌患者CD4+T淋巴細(xì)胞低于健康人群，而CD4+PD-1+T淋巴細(xì)胞高于健康人群，這說(shuō)明晚期乳腺癌患者機(jī)體免疫功能處于免疫低下?tīng)顟B(tài)，而且CD4+PD-1+T淋巴細(xì)胞代表的腫瘤免疫逃逸處于高峰狀態(tài)。盡管未見(jiàn)乳腺癌外周血及TIL中的CD4+PD-1+T淋巴細(xì)胞之間相關(guān)性的報(bào)導(dǎo)，本課題組推測(cè)兩者之間可能表現(xiàn)為正相關(guān)關(guān)系，即外周血CD4+PD-1+T淋巴細(xì)胞可代表同種表型的TIL，提示乳腺癌病灶局部微環(huán)境中的抗腫瘤免疫狀態(tài)高于健康人群。

康萊特對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有顯著的抑制和殺傷作用，臨床主要用于提高化療敏感性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，減輕化療不良反應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)作用。研究表明，康萊特可顯著提高化療患者CD3+、CD4+、CD4/CD8值，保護(hù)化療過(guò)程中機(jī)體的免疫功能，增強(qiáng)化療耐受性［6］。本研究也提示康萊特能明顯提高晚期乳腺癌患者外周血CD4+T淋巴細(xì)胞比例，結(jié)果與既往文獻(xiàn)報(bào)道相符［6］。更重要的是，康萊特治療后晚期乳腺癌患者外周血CD4+PD-1+T淋巴細(xì)胞較治療前明顯下降，說(shuō)明康萊特在上調(diào)機(jī)體免疫力的同時(shí)，減弱腫瘤免疫耐受，有助于誘導(dǎo)特異性腫瘤免疫，提高機(jī)體抗腫瘤免疫水平。但康萊特治療后外周血CD4+PD-1+T淋巴細(xì)胞水平下降仍高于健康人群的數(shù)值，提示康萊特阻斷PD-1/ PD-L1通路的能力相對(duì)較弱，可能需要結(jié)合其他治療手段，特別是靶向PD-1/PD-L1通路的藥物，以達(dá)到有效控制腫瘤的目的。同時(shí)本結(jié)果不排除因晚期乳腺癌患者腫瘤負(fù)荷過(guò)大所致的康萊特療效減弱。

本研究發(fā)現(xiàn)，康萊特治療晚期乳腺癌，可以提高患者的外周血CD4+T細(xì)胞比例，降低CD4+PD-1+T淋巴細(xì)胞比例，從而提高患者機(jī)體免疫功能，減弱局部腫瘤免疫抑制狀態(tài)。

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The effect of Kanglaite on the PD-1+and CD4+T lymphocytes in the peripheral blood of patients with advanced breast cancer△

XIE You-ke#HUANG Ding-ping
Department of Oncology，Ruikang Hospital，Guangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanning 530011，Guangxi China

ObjectiveTo investigate the effect of Kanglaite（KLT）on the PD-1+and CD4+T lymphocytes in peripheral blood of patients with advanced breast cancer（ABC），and discuss the role of KLT in inducing anti-cancer immune response in these patients.Method30 patients with ABC who had prior chemotherapy or endocrine therapy were included in this study as study group，given KLT injection，and the peripheral blood of these patients were sampled before and after treatment of KLT to determine the level of T lymphocytes of CD4+and CD4+/PD-1+using flow cytometry.Another 20 case of healthy adults were enrolled as control，whose peripheral blood was sampled and tested with the same procedure as in study group.ResultThe level of CD4+T lymphocytes in the peripheral blood of ABC patients before treatment was lower than that in control group，but the level of CD4+/PD-1+in these patients was notably higher.After treatment of KLT，the level of CD4+was increased in study group after treatment，and the level of CD4+/PD-1+was lower than that before treatment，with statistically significant difference observed（P＜0.05）.ConclusionKLT is effective in decreasing the level of CD4+PD-1+T lymphocytes in peripheral blood of advanced breast cancer patients，and thus attenuates tumor immunosuppression status in those patients.

breast cancer；Kanglaite；CD4；PD-1；immune

R737.9

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2016.14.06.07

2016-01-14）

國(guó)家自然科學(xué)基金（81560476）；八桂學(xué)者建設(shè)工程專(zhuān)項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助

（corresponding author），郵箱：xieyouke1215@sina.com.