劉自剛 袁金海 孫萬倉 曾秀存 方 彥 王志江 武軍艷 方 園李學(xué)才 米 超

甘肅省油菜工程技術(shù)研究中心 / 甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 甘肅蘭州730070

低溫脅迫下白菜型冬油菜差異蛋白質(zhì)組學(xué)及光合特性分析

劉自剛 袁金海 孫萬倉 曾秀存 方 彥 王志江 武軍艷 方 園李學(xué)才 米 超

甘肅省油菜工程技術(shù)研究中心 / 甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 甘肅蘭州730070

分離鑒定白菜型冬油菜低溫差異表達(dá)蛋白質(zhì)， 從蛋白質(zhì)組角度為揭示白菜型冬油菜抗寒機(jī)理奠定基礎(chǔ)。以強(qiáng)抗寒白菜型冬油菜隴油 7號(hào)為材料， 采用雙向電泳和質(zhì)譜分析技術(shù)， 比較低溫（4℃、-4℃）和常溫（25℃/20℃）下葉片蛋白質(zhì)組差異； 對差異蛋白進(jìn)行KO和KEGG功能分析。結(jié)果表明， 低溫下隴油7號(hào)生長點(diǎn)下陷、植株匍匐， 氣孔處于關(guān)閉或半關(guān)閉狀態(tài)。2-DE和PDQuest8.0.1軟件分析表明， 常溫和4℃低溫下葉片蛋白質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)分別726、738； 相對于常溫處理， 4℃低溫下隴油7號(hào)葉片10個(gè)蛋白點(diǎn)特異表達(dá)、5個(gè)蛋白點(diǎn)未表達(dá)； MALDI-TOF-TOF MS質(zhì)譜分析鑒定出11個(gè)蛋白質(zhì)， 參與碳水化合物代謝、糖代謝、氨基酸代謝、有機(jī)酸代謝、核酸代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)胞通訊等細(xì)胞過程。冰晶形態(tài)顯微觀察結(jié)果表明低溫處理后隴油7號(hào)葉片蛋白質(zhì)提取液中含有高活性抗凍蛋白（antifreeze proteins，AFPs）。鑒定的 11個(gè)蛋白質(zhì)中， 有 5個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)與光合作用有關(guān)， 低溫下隴油 7號(hào)葉片 1，5-二磷酸核酮糖羧化酶（RuBPCase）活性和凈光合速率Pn下降。葉片Pn下降與RuBPCase表達(dá)抑制和活性降低有關(guān)， 非氣孔限制是Pn下降的主要因素； 高活性抗凍蛋白在白菜型冬油菜抗寒中發(fā)揮重要作用。

白菜型油菜； 低溫脅迫； 蛋白質(zhì)組學(xué)； 光合特性

中國北方寒旱區(qū)冬季嚴(yán)寒漫長， 生態(tài)條件嚴(yán)酷，屬傳統(tǒng)的春油菜區(qū)［1］。春油菜在春季 3月下旬至 4月上中旬播種， 8月下旬至9月中下旬成熟。這種氣候條件給春油菜產(chǎn)區(qū)帶來兩方面的問題， 一是春耕春播等農(nóng)事措施很容易形成農(nóng)田塵源， 增加了中國北方沙塵氣候形成頻率［2］； 二是春油菜收獲后由于光熱限制難以發(fā)展復(fù)種， 造成大量資源浪費(fèi)。種植冬油菜可在冬春季地表形成厚的枯葉覆蓋層， 有效利用光熱水等自然資源。因此， 發(fā)展復(fù)種， 實(shí)現(xiàn)油糧增產(chǎn)和農(nóng)田生態(tài)協(xié)同改善的有機(jī)結(jié)合［3］。據(jù)測算， 中國北方寒旱區(qū)適宜發(fā)展冬油菜的面積約3226.7萬公頃， 近期可發(fā)展冬油菜333.3萬公頃， 對國家油糧穩(wěn)定供應(yīng)和生態(tài)改善均有重要意義［4］。冬油菜北移至北方寒旱區(qū)后該區(qū)越冬期持續(xù)低溫成為影響油菜生長發(fā)育和產(chǎn)量的重要環(huán)境限制因子。北方寒旱區(qū)冬油菜一般8月下旬至9月上旬播種， 幼苗生長至第4至第 5葉期即經(jīng)歷明顯的降溫過程， 隨后進(jìn)入冬前低溫生長階段。低溫傷害可能是幼苗低溫階段生長的主要限制因素。冬油菜能否有效利用冬前低溫階段有限的光熱資源進(jìn)行光合作用， 進(jìn)而積累充足有機(jī)物是越冬期根部抵御冬季嚴(yán)寒而安全越冬， 以及翌年返青進(jìn)行地上部營養(yǎng)體迅速重建的物質(zhì)基礎(chǔ)［5］。蛋白質(zhì)是生物學(xué)功能的主要執(zhí)行者， 在低溫下植物有機(jī)體蛋白質(zhì)組成和表達(dá)水平發(fā)生變化， 是植物低溫適應(yīng)的重要策略［6］。

低溫下強(qiáng)抗寒冬油菜品種冬前葉片貼地生長、深綠色、生長點(diǎn)低于地表等形態(tài)特征明顯不同于常溫條件下的［7］。低溫誘導(dǎo)下白菜型冬油菜抗氧化酶系活性升高， 可溶性糖、游離脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物積累， 抗寒性不同的材料在低溫下生理特性變化存在差異［1］。張騰國等［8］在白菜型冬油菜中克隆了BnMKK2、BnMKK4［9］、BnMPK6［10］、BnHMGB2［11］等基因 cDNA全長， 并分析了基因結(jié)構(gòu)、功能及低溫誘導(dǎo)下的表達(dá)情況， 結(jié)果表明這些基因在響應(yīng)低溫、鹽脅迫中發(fā)揮重要作用。

作物通過光合作用形成有機(jī)物質(zhì)， 光合作用也是作物受低溫影響最明顯的生理過程之一［5］； 利用冬前低溫階段有限光熱資源進(jìn)行光合積累， 是其抵御冬季嚴(yán)寒的物質(zhì)基礎(chǔ)。低溫下強(qiáng)抗寒冬油菜基因的差異表達(dá)是其重要的抗寒適應(yīng)特征， 利用差異蛋白質(zhì)組學(xué)可以獲得植物抗寒調(diào)控的關(guān)鍵差異蛋白質(zhì)［6］。本研究為了解低溫下白菜型冬油菜光合特性變化，采用質(zhì)譜鑒定分析， 探討差異表達(dá)蛋白在低溫適應(yīng)過程中的生物學(xué)功能， 尋找抗寒相關(guān)蛋白質(zhì)， 闡明白菜型冬油菜抗寒分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以超強(qiáng)抗寒白菜型冬油菜品種隴油 7號(hào)為材料。選取籽粒飽滿、大小一致的油菜種子， 用 10%過氧化氫處理30 min， 后用無菌水沖洗2～3次， 播于裝有育苗基質(zhì)的盆缽中， 以培養(yǎng)箱培養(yǎng)（光照 14 h，25℃， 黑暗10 h， 20℃）， 每盆留苗4株。五葉期進(jìn)行處理， 對照為光/暗 25℃/20℃（CK）， 低溫處理溫度為4℃和-4℃（光照14 h， 黑暗10 h）， 處理72 h后，分別觀察形態(tài)變化， 測定光合氣體交換參數(shù)、BuBPCase活性等。取對照及4℃處理的葉片提取總蛋白， 進(jìn)行雙向電泳（two-dimensional gel electrophoresis， 2-DE）分離； 并在-20℃下顯微觀察蛋白提取液冰晶形態(tài)。

1.2 形態(tài)特征觀察

處理后觀察記載幼苗葉片狀態(tài)、葉色、真葉刺毛、葉柄狀態(tài)、植株生長習(xí)性等變化； 低溫處理后取新展開葉片， 采用水封片法觀察葉片表皮及氣孔的形態(tài)。用鑷子輕輕撕下葉片表皮， 于加 1～2滴I2-KI染液的載玻片上展開表皮， 蓋上蓋玻片， 顯微觀察氣孔形態(tài)并照相。

1.3 白菜型冬油菜葉片總蛋白提取與蛋白質(zhì)濃度測定

采用 TCA-丙酮沉淀法提取冬油菜葉片總蛋白［12］，Bradford［13］法測定蛋白質(zhì)濃度； 對低溫脅迫處理組和對照（CK）進(jìn)行雙向電泳， 第一向等點(diǎn)聚焦（IEF）使用17 cm的IPG膠條， 按照GE Healthcare雙向電泳操作手冊， 上樣量為 900 μg， 將樣品與水化液按體積比1∶4混勻， 總體積不超過500 μL， 第二向采用12%丙烯酰胺凝膠的 SDS-PAGE， 經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色、脫色后通過UMAX的Powerlook 2100XL掃描采集圖像， 用PDQuest 8.0分析軟件對凝膠圖譜標(biāo)準(zhǔn)化處理， 蛋白質(zhì)點(diǎn)匹配和生物統(tǒng)計(jì)， 確定差異表達(dá)蛋白點(diǎn)， 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次； 對差異表達(dá)蛋白點(diǎn)回收、酶解［14］， 送往上海中科新生命生物科技有限公司進(jìn)行MALDI-TOF-TOF MS鑒定和數(shù)據(jù)庫檢索； 根據(jù)Uniprot Knowledgebase （http：//www.uniprot.org/）、NCBI （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）和 Gene Ontology Database （GO）的注釋， 按照其細(xì)胞組分、生物學(xué)過程和分子功能對已鑒定的蛋白質(zhì)比較分析。利用在線分析工具 KEGG （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes） Automatic Annotation Server （簡稱 KAAS） （http：//www.genome.jp/tools/kaas/）， 提交蛋白質(zhì)序列， 采用BBH （bi-directional best hit）方法比對相似性， 找到最相似的蛋白質(zhì)， 確定檢索蛋白質(zhì)的KO （KEGG ORTHOLOG）分類， 并獲得參與的代謝通路。

1.4 光合氣體交換參數(shù)測定

低溫處理后選新展開葉片， 采用 LI-6400便攜式光合儀測定葉片凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、胞間CO2濃度（Ci）、蒸騰速率（Tr）等， 設(shè)定葉室（2 cm ×3 cm）內(nèi)溫度20℃， 光強(qiáng)600 μmol m-2s-1； 同時(shí)采用葉綠素儀測定葉片葉綠素含量、氮素含量、水分含量。每個(gè)處理選5株， 每株讀數(shù)3次。

1.5 RuBPCase活性測定

參照龔富生等［15］的方法測定 RuBPCase活性。稱取冬油菜完全展開的新葉 0.5 g， 用預(yù)冷的Tris-HCl緩沖液（pH 7.4）， 冰浴研磨后轉(zhuǎn)移至離心管，4℃下離心力1317 ×g離心15 min， 取上清液為酶液。根據(jù)NADPH的氧化或NADP+的還原， 于340 nm測定光吸收值的變化， 計(jì)算酶活力。

1.6 質(zhì)外體蛋白的提取與其活性檢測

用顯微鏡觀察冰晶消長以檢測蛋白活性， 參照Deveris的方法［16］。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫下白菜型冬油菜幼苗和葉片氣孔形態(tài)特征

常溫下白菜型冬油菜隴油 7號(hào)幼苗呈半匍匐狀生長， 葉色深綠， 完全展開的葉片葉柄與地面間夾角小于45°。低溫下隴油7號(hào)幼苗呈匍匐生長狀態(tài)，生長點(diǎn)和心葉深陷入地表之下， 葉柄由斜上生變?yōu)閹缀跖c地面平行， 葉片緊貼地面； 葉色加深為濃綠色， 葉面密被刺毛（圖1）。

葉片氣孔是植物體與外界環(huán)境氣體等物質(zhì)交換的重要通道， 通過改變自身開閉狀態(tài)控制 CO2、O2等的進(jìn)出， 對光合效率產(chǎn)生重要影響。在光/暗溫度為25℃/20℃時(shí)， 超強(qiáng)抗寒品種隴油7號(hào)葉片氣孔均處于完全開放狀態(tài)， 保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體淀粉粒較多；溫度下降至4℃時(shí)， 大部分氣孔開放度減小， 處于半關(guān)閉狀態(tài)， 少數(shù)氣孔已完全關(guān)閉， 保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)仍保留較多淀粉粒； 當(dāng)在-4℃下時(shí)葉片大部分氣孔處于完全關(guān)閉或半關(guān)閉狀態(tài)， 淀粉顆粒變小、淀粉粒明顯減少（圖1）。

圖1 低溫下白菜型冬油菜幼苗及氣孔形態(tài)變化Fig.1 Changes of seedling and stomatal morphology of winter rape under low temperature

2.2 白菜型冬油菜不同溫度處理葉片蛋白質(zhì)圖譜及差異表達(dá)蛋白質(zhì)分析

選用pH 4～7、17 cm的IPG膠條， 對白菜型冬油菜隴油 7號(hào)常溫（25℃/20℃）和低溫（-4℃）處理的幼苗葉片總蛋白質(zhì)進(jìn)行分離， 經(jīng)考馬斯亮藍(lán)G-250染色后， 得到分辨率和重復(fù)性較好的2-DE圖譜（圖2）。采用PDQuest8.0.1軟件對2個(gè)處理的圖譜進(jìn)行斑點(diǎn)檢測， 對檢測出的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的總濃度均一化處理， 在等電點(diǎn)為4.0～7.0， 分子質(zhì)量為9.0～100.0 kD的圖譜上可分別鑒定出平均726和738個(gè)清晰的蛋白質(zhì)點(diǎn)， 2個(gè)處理的蛋白質(zhì)點(diǎn)圖譜匹配率為91.5%。

經(jīng)凝膠比對分析發(fā)現(xiàn)， 隴油 7號(hào)常溫和低溫 2個(gè)處理間表達(dá)量2倍以上差異蛋白質(zhì)點(diǎn)共有113個(gè)，上調(diào)表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)61， 下調(diào)表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)52； 表達(dá)量差異在4倍以上的蛋白質(zhì)點(diǎn)36個(gè)， 包括表達(dá)量上的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)和有無表達(dá)（抑制/誘導(dǎo)）的差異蛋白點(diǎn)， 其中表達(dá)量差異蛋白點(diǎn)21個(gè) （增量表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn) 12， 減量表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn) 9； 有無表達(dá)的差異蛋白點(diǎn)15個(gè)， 其中低溫完全抑制表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)5個(gè)（spot 1～5）， 低溫誘導(dǎo)表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)10個(gè)（spot 6～15）。

2.3 差異表達(dá)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定與分析

將重復(fù)性好的 15個(gè)低溫誘導(dǎo)/完全抑制差異表達(dá)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)進(jìn)行MALDI-TOF-TOF MS質(zhì)譜分析，11個(gè)點(diǎn)鑒定出蛋白質(zhì)（表2）， 4個(gè)點(diǎn)未能鑒定出結(jié)果。在質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析的基礎(chǔ)上， 用 MASCOT搜索NCBInr綠色植物數(shù)據(jù)庫， 對應(yīng)的蛋白質(zhì)分別為放氧增強(qiáng)蛋白（spot 1）、核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶（spot 5）、光系統(tǒng)II 23 kD外周蛋白（spot 15）、β碳酸酐酶2 （spot 8）、果糖-1，6-二磷酸醛縮酶（spot 7）、轉(zhuǎn)錄調(diào)控鋅指蛋白（spot 2）、膜聯(lián)蛋白（spot 6）、巰基蛋白酶抑制劑（spot 9、spot 10）、類甜蛋白（spot 13）、抗病毒蛋白（spot 14）。

圖2 白菜型冬油菜隴油7號(hào)雙向電泳圖Fig.2 Coomassie-stained 2-D gel protein profiles of leaves from Longyou 7

圖3 完全抑制和誘導(dǎo)表達(dá)差異蛋白點(diǎn)局部放大圖Fig.3 Completely inhibited and induced expression differential proteins

圖4 差異蛋白表達(dá)強(qiáng)度Fig.4 Differential protein expression intensity

表1 特異蛋白點(diǎn)MALDI-TOF-TOF MS質(zhì)譜鑒定結(jié)果Table1 Identification of special proteins by MALDI-TOF-TOF MS

2.4 差異表達(dá)蛋白質(zhì)的功能分析

對獲得的差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行 Gene Ontology 和KEGG功能注釋。將GO注釋成功的9個(gè)蛋白質(zhì)在三大類群（生物學(xué)過程BP、細(xì)胞組分CC和分子功能 MF）下進(jìn)行進(jìn)一步分類。這些蛋白質(zhì)分別參與碳同化過程（spot 5）， 具有單加氧酶活性、羧化酶活性；參與肽酶活性調(diào)控過程（spot 9）， 具有肽酶抑制劑活性； 參與光呼吸、碳同化過程（spot 14）， 具有單加氧酶活性、水解酶活性； 參與光合作用（spot 15）， 具有金屬離子結(jié)合活性； 參與逆境響應(yīng)（spot 6）， 具有鈣依賴磷脂結(jié)合活性； 參與糖代謝（spot 7）， 具有醛縮酶活性； 參與MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)、水楊酸生物合成、茉莉酸介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、光合作用（spot 8）， 具有含鋅水合酶活性； 參與光合水裂解（spot 1）， 具有氧化還原酶活性； 參與低溫響應(yīng)（spot 2）， 調(diào)控抗寒靶基因表達(dá)。這些蛋白從“細(xì)胞組分”分類來看， 分別是細(xì)胞膜、細(xì)胞基質(zhì)、胞外基質(zhì)、質(zhì)體的組分。

圖5 差異表達(dá)蛋白的GO分類圖Fig.5 Histogram showing Gene Ontology functional analysis of differentially expressed protein

圖6 差異表達(dá)蛋白KEGG分類圖Fig.6 Histogram showing KEGG pathway analysis of differentially expressed protein

經(jīng)KO注釋的9個(gè)蛋白參與了碳水化合物代謝、糖代謝、氨基酸代謝、有機(jī)酸代謝、核酸代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)胞通訊， 其中 5個(gè)蛋白參與光合碳水化合物代謝相關(guān)過程（spot 1、spot 2、spot 5、spot 8和spot 15）， 占KO注釋蛋白總數(shù)的55.6%， 表明光合作用是受低溫影響的重要代謝途徑之一。

2.5 低溫下白菜型冬油菜質(zhì)外體蛋白提取液冰晶形態(tài)

將2種溫度處理（25℃/20℃和-4℃處理7 d）的隴油7號(hào)葉片蛋白提取液在-20℃放置12 h后， 觀察到常溫處理的葉片質(zhì)外體蛋白質(zhì)提取液已完全結(jié)冰呈固態(tài)， 而低溫處理的葉片質(zhì)外體蛋白提取液仍保持液體狀態(tài)。常溫處理葉片的蛋白提取液形成的小晶體顆粒間相互快速融合， 冰晶迅速生長、相互擠壓形成不規(guī)則較大冰晶體； 而低溫處理的葉片蛋白提取液冰晶顆粒較小， 形態(tài)多為六邊形、雙棱錐形， 表現(xiàn)出明顯的飾晶活性和抑制重結(jié)晶活性。

2.6 低溫下白菜型冬油菜光合氣體交換參數(shù)

圖7 低溫下白菜型冬油菜葉片蛋白提取液的冰晶形態(tài)Fig.7 Ice crystal morphology of winter rapeseed leaf protein extract

表2 低溫對白菜型冬油菜品種隴油7號(hào)光合氣體交換參數(shù)的影響Table2 Photosynthetic gas exchange parameters of winter rapeseed variety Longyou 7 at low temperature

隨著溫度下降， 白菜型冬油菜葉片 Gs、Tr、Pn明顯降低， 而Ci呈先降后升趨勢。當(dāng)溫度降為20℃/5℃時(shí)， 葉片Gs顯著下降， Pn略有降低、但變化未達(dá)到顯著水平， 表明此時(shí)葉片仍保持較高的光合 CO2同化能力， 胞間 CO2濃度的減少主要由氣孔限制因素引起， 即 CO2通過氣孔阻力增加， 向葉片胞間輸入量減少， 導(dǎo)致了胞間 Ci降低； 當(dāng)溫度降低到-5℃時(shí)， 隴油7號(hào)葉片Pn顯著降低， 此時(shí)Pn僅為常溫時(shí)的48.7%， 表明葉片光合同化消耗CO2能力減弱， 通過氣孔進(jìn)入葉片的 CO2在胞間積累， 導(dǎo)致 Ci升高，說明此時(shí)葉片Pn下降的主要原因是非氣孔限制， 即光合系統(tǒng)效率降低所致。

2.7 低溫下白菜型冬油菜Rubisco酶活性及表達(dá)分析

低溫對白菜型冬油菜葉片光合固碳過程產(chǎn)生顯著影響， 本試驗(yàn)鑒定的11個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)中， 5個(gè)蛋白點(diǎn)與光合作用相關(guān)， 選擇光合固碳關(guān)鍵酶Rubisco檢測了其羧化酶活性。隨著溫度降低， 白菜型冬油菜葉片 RuBPCase活性顯著逐漸降低， 但處理間降低幅度不同。與常溫對照（25℃/20℃）相比， 4℃下葉片RuBPCase活性下降了21.1%； 而-4℃處理的葉片RuBPCase活性下降了71.6%， 與其他2個(gè)處理間差異達(dá)極顯著水平。

圖8 低溫下葉片RuBPCase活性Fig.8 RuBPCase activity at low temperature

3 討論

3.1 低溫對白菜型冬油菜光合的影響

光合作用是植物體內(nèi)復(fù)雜的生理生化代謝過程，包括光能的捕獲與轉(zhuǎn)化、水光解、電子傳遞、光合磷酸化、碳同化及同化物的轉(zhuǎn)化與運(yùn)輸?shù)冗^程［17］，涉及多種酶及其他物質(zhì)， 這些光合過程及涉及物質(zhì)對環(huán)境溫度變化敏感性有所不同， 其中光能捕獲與轉(zhuǎn)化等受溫度影響較小［18］。低溫下白菜型冬油菜幼苗生長點(diǎn)、心葉下陷， 葉片顏色、著生狀態(tài)等發(fā)生明顯改變； 采用MALDI-TOF-TOF MS質(zhì)譜法鑒定出的11個(gè)葉片差異蛋白質(zhì)， 有5個(gè)蛋白點(diǎn)（spot 1、spot 5、spot 7、spot 8、spot 15）與光合作用有關(guān)， 占鑒定差異蛋白質(zhì)總數(shù)的45.5%， 其中核酮糖1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶（spot 5）、葉綠體增氧蛋白（spot 1）下調(diào)表達(dá)； 葉綠體β調(diào)碳酸酐酶2 （spot 8）、光系統(tǒng)II氧系統(tǒng)23 kD蛋白（spot 15）上調(diào)表達(dá)。核酮糖1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶是調(diào)節(jié)光合和光呼吸， 決定凈光合速率的關(guān)鍵酶［19］。在低溫下該酶編碼基因轉(zhuǎn)錄降低、活性下降； 雖然低溫下葉片氣孔關(guān)閉或半關(guān)閉， 通過氣孔進(jìn)入葉片的 CO2量減少， 但由于低溫下Rubisco酶活性降低， CO2同化消耗能力減弱， 導(dǎo)致-5℃下白菜型冬油菜葉片Ci升高， 而光合速率Pn明顯降低， 因此， 此時(shí) Pn的降低主要由非氣孔限制引起。

3.2 植物激素與抗寒性的關(guān)系

水楊酸（salicylic acid， SA）是一種植物內(nèi)源簡單酚類化合物， 在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、逆境脅迫響應(yīng)等過程中具有廣泛的生理活性［20］。SA可誘導(dǎo)增強(qiáng)植物體抗氰呼吸代謝過程， 具有產(chǎn)熱效應(yīng)， 提高植物體內(nèi)溫度，對低溫下保持有機(jī)體正常生理狀態(tài)、酶系活性和代謝過程等具有重要意義［21］。適宜濃度的外源 SA可提高大葉黃楊［22］、厚皮甜瓜［23］等的抗寒性。本研究在白菜型冬油菜隴油 7號(hào)中鑒定到一個(gè)低溫誘導(dǎo)表達(dá)蛋白質(zhì)（spot 8）， GO分析表明該蛋白具有含鋅水合酶活性， 參與SA生物合成過程。

3.3 滲透調(diào)節(jié)物與抗寒性關(guān)系

低溫下植物細(xì)胞積累可溶性糖， 具有組織保護(hù)效用［24］； 特別是在胞間結(jié)冰溫度下， 結(jié)冰引起胞外水勢降低， 胞內(nèi)自由水能沿水勢梯度大量外滲造成細(xì)胞嚴(yán)重脫水， 導(dǎo)致植物類似干旱脅迫危害癥狀［25］。植物在長期進(jìn)化過程中也形成冷凍防御機(jī)制［26］， 如在低溫下植物細(xì)胞積累可溶性糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，以保持低溫下植物細(xì)胞內(nèi)外水勢平衡［27］， 從而使植物體在嚴(yán)寒環(huán)境中能保持良好的胞內(nèi)代謝狀態(tài)， 增強(qiáng)植物抗寒適應(yīng)性［28］。本研究從低溫處理后的白菜型冬油菜葉片中鑒定出果糖-1，6-二磷酸醛縮酶（spot 7）， 在低溫下誘導(dǎo)表達(dá)， 參與糖酵解、糖異生、磷酸戊糖循環(huán)、卡爾文循環(huán)等代謝途徑， 是植物體糖代謝、可溶性糖積累的關(guān)鍵酶之一。低溫下白菜型冬油菜果糖-1，6-二磷酸醛縮酶表達(dá)上調(diào)， 細(xì)胞中可溶性糖濃度提高， 可有效降低細(xì)胞溶液冰點(diǎn)， 防止細(xì)胞內(nèi)低溫結(jié)冰損失； 同時(shí)較高的可溶性糖濃度還可降低胞內(nèi)水勢， 增加細(xì)胞持水能力， 在低溫胞間結(jié)冰情況下， 維持細(xì)胞內(nèi)外水勢相對平衡， 避免在水勢逆差的促動(dòng)下細(xì)胞過度脫水受損。

3.4 抗凍蛋白與抗寒性關(guān)系

在嚴(yán)寒環(huán)境中， 植物體通常遭遇冰凍威脅［29］，體內(nèi)形成的冰晶會(huì)對細(xì)胞產(chǎn)生機(jī)械損傷， 甚至導(dǎo)致細(xì)胞破裂［30］， 許多寒地植物經(jīng)冷誘導(dǎo)可產(chǎn)生高活性抗凍蛋白（antifreeze proteins， AFPs）， 是有機(jī)體適應(yīng)低溫脅迫的重要策略［31］， AFPs具有降低細(xì)胞溶液冰點(diǎn)的熱滯活性、修飾冰晶形態(tài)和抑制重結(jié)晶活性［32］，AFPs與冰晶表面高親和結(jié)合， 阻隔水分子在晶格面吸附， 抑制冰晶生長和重結(jié)晶過程， 防止有機(jī)體冰晶形成和生長對細(xì)胞造成的機(jī)械損傷［26］。目前分離測序的植物AFPs包含近30個(gè)物種中鑒定的100多條數(shù)據(jù)［33］， 植物AFPs主要有類甜蛋白、β-1，3-葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶和多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白4種［34］。本研究中白菜型冬油菜幼苗低溫處理后， 其葉片蛋白質(zhì)提取液在-20°C下仍不結(jié)冰， 保持溶液狀態(tài)，表明該提取液中可能含有高活性抗結(jié)冰物質(zhì)。采用顯微冰晶形態(tài)觀察法， 檢測了蛋白提取液的結(jié)冰過程和晶冰形態(tài)， 對照溶液形成大量無規(guī)則大冰晶，而低溫處理葉片蛋白液形成體積較小的六邊形、雙棱錐形冰晶， 這兩種晶型是在 AFPs作用下形成的典型冰晶類型， 可以確定在低溫處理后的白菜型冬油菜葉片總蛋白質(zhì)提取液中存在高活性 AFP。MALDI-TOF-TOF MS質(zhì)譜法鑒定出低溫誘導(dǎo)白菜型冬油菜表達(dá)類甜蛋白（spot 13）， 目前已鑒定出低溫誘導(dǎo)黑麥產(chǎn)生的類甜蛋白具有AFP活性［35］， 但白菜型冬油菜低溫誘導(dǎo)表達(dá)的類甜蛋白是否具有 AFP活性， 仍需進(jìn)一步分離鑒定。

4 結(jié)論

低溫下白菜型冬油菜葉色加深、植株匍匐、生長點(diǎn)下陷， 葉片氣孔逐漸關(guān)閉； 其葉片蛋白質(zhì)組發(fā)生明顯變化， 15個(gè)低溫特異誘導(dǎo)或完全抑制蛋白點(diǎn)中， 質(zhì)譜鑒定出差異表達(dá)蛋白11個(gè)， 分別是細(xì)胞膜、細(xì)胞基質(zhì)、胞外基質(zhì)、質(zhì)體的組分； 參與碳水化合物代謝、糖代謝、氨基酸代謝、有機(jī)酸代謝、核酸代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)到與細(xì)胞通訊等細(xì)胞過程。低溫下白菜型冬油菜葉片Pn下降與RuBPCase表達(dá)抑制和活性降低有關(guān)， 非氣孔限制是 Pn下降的主要因素； 低溫處理后葉片中存在高活性抗凍蛋白， 在白菜型冬油菜抗寒中發(fā)揮重要作用。

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Differential Proteomic Analysis and Photosynthetic Characteristics of Winter Rapeseed under Low Temperature Stress

LIU Zi-Gang， YUAN Jin-Hai， SUN Wan-Cang， ZENG Xiu-Cun， FANG Yan， WANG Zhi-Jiang， WU Jun-Yan，F(xiàn)ANG Yuan， LI Xue-Cai， and MI Chao

Gansu Research Center of Rapeseed Engineering and Technology / Improvement and Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement of Gansu Province / Gansu Provincial Key Laboratory of Arid Land Crop Sciences / Agronomy College， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070， China

Isolation and identification of the differentially expressed proteins in winter rapeseed at low temperature， laid a foundation for revealing the mechanism of cold resistance of winter rapa.The strong cold resistant winter rape Longyou 7 was used as experimental material.Two dimensional electrophoresis， mass spectrometry and retrieval techniques were used to compare the proteomic differences at low temperature （4℃，-4℃） and normal atmospheric temperature （25℃/20℃）， and functions were analyzed by KO and KEGG.It was observed that Longyou 7 had subsided growth point， creeping stem， and closed or semi-closed stomata under low temperature.The 2-DE and PDQuest8.0.1 software analysis showed that the number of protein spots were 726 and 738， respectively.Compared with the normal temperature treatment， at the 4℃ treatment showed differential expression at 10 protein spots while didn’t at five protein.Eleven proteins were identified by MS MALDI-TOF-TOF mass spectrometry analysis.They are involved in carbohydrate metabolism， rugan metabolism， amino acid metabolism， organic acid metabolism， nucleic acid metabolism， signal transduction in cell and communication and other cellular processes.we found the high activity of antifreeze

Winter rape； Low temperature stress； Protein proteomics； Photosynthetic characteristics

10.3724/SP.J.1006.2016.01541

聯(lián)系方式： E-mail： lzgworking@163.com

Received（）： 2016-01-18； Accepted（接受日期）： 2016-06-20； Published online（網(wǎng)絡(luò)出版日期）： 2016-07-28.

本研究由國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31460356）， 國家農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目（2014G10000317）， 國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-13）和國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2015CB150206）資助。

This study was supported by the National Science Foundation of China （31460356）， the National Agricultural Science and Technology Achievements Transformation Fund of China （2014G10000317）， the China Agriculture Research System （CARS-13）， and the National Basic Research Program of China （973 Program） （2015CB150206）.

URL： http：//www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160728.0817.020.htmlprotein in Longyou 7 leaf protein extraction solution after low temperature treatment through ice crystal morphology microscopic observation.Five out of the 11 proteins identified were associated with photosynthesis.Under low temperature， ribulose 1，5-bisphosphate carboxylase （RuBPCase） activity and photosynthetic rate decreases in leaves of Longyou 7.Under the low temperature， the proteome of winter rape was significantly changed， and the specific protein was expressed.The decrease of Pnin leaves was related to the expression inhibition and the activity decrease of RuBPCase.The decrease of Pnin leaves was mainly caused by non stomatal limitation.High activity of antifreeze protein plays an important role in cold resistance of winter rape.