方蕾 李世巖

[摘要] 目的 研究超聲造影與肝細(xì)胞癌臨床病理之間的關(guān)系，以探討超聲造影對(duì)肝細(xì)胞癌的臨床應(yīng)用價(jià)值。 方法 選擇2012年11月～2014年5月在浙江省諸暨市人民醫(yī)院腫瘤科就診的51例肝細(xì)胞癌患者，在其接受手術(shù)治療之前給予超聲造影檢查，詳細(xì)記錄各項(xiàng)參數(shù)，同時(shí)檢測(cè)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）以及CD34的表達(dá)情況，并與術(shù)后病理結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，以探討各項(xiàng)指標(biāo)的關(guān)系。 結(jié)果 39例門靜脈期表現(xiàn)為快進(jìn)快出型低增強(qiáng)回聲，有24例為低分化癌。12例患者在門靜脈期表現(xiàn)為快進(jìn)慢出型等回聲或稍低回聲，在實(shí)質(zhì)期則表現(xiàn)為低增強(qiáng)，其中高分化和中分化的有11例。中分化與低分化腫瘤的造影劑增強(qiáng)時(shí)間以及消退時(shí)間明顯短于高分化腫瘤，而曲線下的面積則明顯大于高分化腫瘤（均P < 0.05）。VEGF表達(dá)陽性的患者，其微血管密度、曲線下面積均明顯高于表達(dá)陰性的患者，而造影劑增強(qiáng)時(shí)間以及造影劑消退時(shí)間均明顯短于表達(dá)陰性的患者（P < 0.05）；腫瘤直徑<5 cm的患者其微血管密度明顯低于腫瘤直徑≥5 cm的患者（P < 0.05）；匯管區(qū)有癌栓的患者微血管密度明顯高于無癌栓的患者，造影劑增強(qiáng)時(shí)間則明顯短于無癌栓患者（P < 0.05）。微血管密度與造影劑增強(qiáng)時(shí)間呈負(fù)相關(guān)（r=-0.609，P < 0.05），與曲線下面積呈正相關(guān)（r=0.558，P < 0.05）。 結(jié)論 超聲造影能夠反映出肝細(xì)胞癌腫瘤內(nèi)的微血管密度與血流供應(yīng)情況，能夠?yàn)榕R床診斷肝細(xì)胞癌以及明確其臨床病理特征提供重要的參考，幫助臨床制訂更有針對(duì)性的治療策略。

[關(guān)鍵詞] 超聲造影；肝細(xì)胞癌；血管內(nèi)皮生長因子；微血管密度

[中圖分類號(hào)] R735.704 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2016）03（a）-0115-04

Correlation of contrast-enhanced ultrasound and clinical pathology of hepatocellular carcinoma

FANG Lei1 LI Shiyan2

1.Department of Ultrasound， Zhuji People's Hospital， Zhejiang Province， Zhuji 311800， China； 2.Department of Ultrasound， Sir Run Run Shaw Hospital， School of Medicine， Zhejiang University， Zhejiang Province， Hangzhou 310020， China

[Abstract] Objective To analyze the relationship between contrast-enhanced ultrasound and clinical pathology of hepatocellular carcinoma （HCC）， and explore the clinical value of contrast-enhanced ultrasound for HCC. Methods 51 patients given HCC treated in Oncology Department， Zhuji People's Hospital from November 2012 to May 2014 were selected. Before operative treatment， all patients were taken contrast-enhanced ultrasonography， various parameters recorded detailedly， at the same time， expressions of VEGF and CD34 were detected， and compared with postoperative pathological results， in order to discuss the relationship between the indicators. Results 39 cases of portal vein phase showed fast in-fast out type low enhanced echo， had 24 cases of poorly differentiated carcinoma. 12 patients of portal venous phase showed the fast in-slow out type isoechoic or slightly low echo， showed low enhancement in parenchymal phase， had 11 cases of high differentiation and intermediate differentiation. The enhancement time and fading time of contrast agent in intermediate differentiation and low differentiation tumors were significantly shorter than high differentiation tumors， and the areas under the curve were obviously higher than the high differentiation tumors （all P < 0.05）. In the patients with positive expression of VEGF， the microvessel density and the area under the curve were significantly higher than the patients with negative expression of VEGF， otherwise， the enhanced time and fading time of contrast agent were significantly shorter than the patients with negative expression of VEGF （P < 0.05）. In the patients with tumor diameter < 5 cm， the microvessel density was significantly lower than patients with tumor diameter ≥5 cm （P < 0.05）. In the patients with tumor thrombus in the portal area， the microvessel density was significantly higher than patients without cancer embolus， otherwise， the contrast-enhanced time was significantly shorter （P < 0.05）. Microvessel density was negatively correlated with the time of contrast enhancement （r = -0.609， P < 0.05）， and positively correlated with the area under the curve （r = 0.558， P < 0.05）. Conclusion Contrast-enhanced ultrasonography can reflect the microvessel density and blood supply of HCC， and can provide an important reference for the clinical diagnosis of HCC and its pathology. It can help clinical to develop more targeted therapeutic strategies.

[Key words] Contrast-enhanced ultrasound； Hepatocellular carcinoma； Vascular endothelial growth factor； Microvessel density

隨著人們生活方式以及飲食習(xí)慣等改變，惡性腫瘤的發(fā)病率呈現(xiàn)不斷上升的趨勢(shì)[1]，已經(jīng)成為人們身體健康的嚴(yán)重威脅。肝細(xì)胞癌是臨床上較為常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，對(duì)于本病的治療一直是學(xué)術(shù)界研究的熱點(diǎn)問題。相關(guān)研究顯示，在惡性腫瘤的發(fā)生、生長以及對(duì)周圍組織的侵襲和腫瘤的轉(zhuǎn)移過程，腫瘤供血血管的生成及其基底膜的破壞起關(guān)鍵性作用[2]。因此，對(duì)于腫瘤供血血管的顯示，可以為臨床治療和患者預(yù)后的改善提供十分重要的幫助。超聲造影是一項(xiàng)較為安全、無創(chuàng)、可重復(fù)性強(qiáng)的診斷手段，能夠?yàn)榕R床提供腫瘤血管情況等有價(jià)值的信息，為臨床治療策略的制訂提供重要的參考[3]。本研究對(duì)浙江省諸暨市人民醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）收治的肝細(xì)胞癌患者的超聲造影檢查結(jié)果和肝細(xì)胞癌臨床病理之間的關(guān)系進(jìn)行觀察，以探討其在肝細(xì)胞癌治療過程中的臨床應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2012年11月～2014年5月在我院腫瘤科就診的肝細(xì)胞癌患者51例，其中，男39例，女12例；年齡37～71歲，平均（48.18±5.72）歲。所有患者經(jīng)過肝臟CT掃描或者M(jìn)RI檢查以及血清甲胎蛋白檢查，明確診斷為肝細(xì)胞癌，且病灶單一，均采用手術(shù)治療。

1.2 方法

1.2.1 超聲檢查的儀器和方法 采用美國的GE LOGIQ E9彩色超聲診斷儀（探頭頻率為2.0～4.0 MHz，機(jī)械指數(shù)為0.05～0.08），造影劑為意大利博萊科公司生產(chǎn)的聲諾維造影劑。通過超聲診斷儀自帶的軟件對(duì)造影劑的達(dá)到時(shí)間、增強(qiáng)時(shí)間、減低時(shí)間以及曲線下的面積等相關(guān)參數(shù)進(jìn)行定量分析并繪制時(shí)間-強(qiáng)度曲線。在進(jìn)行超聲造影前，先對(duì)腫瘤病灶進(jìn)行常規(guī)超聲掃描，并通過彩色超聲多普勒檢查腫瘤內(nèi)部以及周圍的血供情況，在超聲探頭位置不變的情況下，切換為即時(shí)灰階諧波超聲造影顯像模式，將2.4 mL的造影劑從患者的外周靜脈快速靜脈推注，造影過程采用實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)存儲(chǔ)技術(shù)儲(chǔ)存檢查信息，檢查結(jié)束后由2名高年資超聲醫(yī)生分析所儲(chǔ)存的檢查圖像進(jìn)行診斷。

1.2.2 腫瘤組織的血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）與CD34的表達(dá)情況檢測(cè) 所有患者均通過手術(shù)方法將病灶切除并行病理檢查。根據(jù)病理檢查的結(jié)果，組織切片選取腫瘤細(xì)胞最有侵襲力的部分。采用免疫組織化學(xué)染色-SP法檢測(cè)腫瘤組織VEGF與CD34的表達(dá)情況。檢測(cè)采用兔抗人CD34單克隆抗體（Abcam，貨號(hào)：ab81289）以及兔抗人VEGF單克隆抗體（Abcam，貨號(hào)：ab52917），陰性對(duì)照組采用PBS緩沖液代替。通過2名高年資的病理科醫(yī)師對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判斷。根據(jù)Weidner微血管計(jì)數(shù)法[4-5]對(duì)CD34的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判定。經(jīng)過染色后，顯色為棕褐色或者棕黃色的細(xì)胞或者細(xì)胞團(tuán)即為腫瘤組織新生的血管。通過光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS，BX60）和圖像分析軟件（IPP6.0）[6]觀察組織切片的染色結(jié)果。首先使用低倍鏡（100×）選擇棕褐色或者棕黃色細(xì)胞團(tuán)最為集中的區(qū)域，每張片選取3個(gè)視野，每個(gè)視野選取100個(gè)以上細(xì)胞數(shù)，采用高倍鏡（400×）取其平均值，計(jì)算陽性細(xì)胞百分比，從而得出該區(qū)域腫瘤組織的微血管密度。如果細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)經(jīng)過免疫組織化學(xué)染色后著色，則該細(xì)胞的有VEGF表達(dá)。如果陽性細(xì)胞的數(shù)量超過30%為陽性，反之則為陰性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Pearson相關(guān)系數(shù)對(duì)兩變量的相關(guān)性進(jìn)行分析；以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤病理分化級(jí)別和超聲造影檢查的關(guān)系

51例肝細(xì)胞癌患者的病理診斷結(jié)果顯示，在腫瘤的組織學(xué)類型上，12例為高分化癌，14例為中分化癌，25例為低分化癌。在超聲造影檢查方面，所有患者在動(dòng)脈期均表現(xiàn)為快速增強(qiáng)，其中，39例患者在門靜脈期表現(xiàn)為低增強(qiáng)回聲，與病理分化級(jí)別對(duì)比，其中有24例為低分化癌，占61.54%；其余12例患者在門靜脈期表現(xiàn)為等回聲稍低回聲，在實(shí)質(zhì)期則表現(xiàn)為低增強(qiáng)，在病理分化級(jí)別上，11例為高分化和中分化癌，占91.67%。見表1。

2.2 腫瘤臨床病理分化級(jí)別與超聲造影動(dòng)態(tài)參數(shù)之間的關(guān)系

不同病理分化級(jí)別的腫瘤，其造影劑的到達(dá)時(shí)間相當(dāng)（P > 0.05），而中分化級(jí)腫瘤與低分化級(jí)腫瘤在造影劑的增強(qiáng)時(shí)間以及消退時(shí)間上，明顯短于高分化級(jí)腫瘤（P < 0.05），而曲線下面積則明顯高于高分化級(jí)腫瘤（P < 0.05）。見表2。

2.3 患者一般情況及臨床病理與腫瘤VEGF和CD34表達(dá)的關(guān)系

所有患者的腫瘤組織CD34檢測(cè)結(jié)果均為陽性，其染色結(jié)果呈環(huán)狀或條狀分布于其細(xì)胞膜以及細(xì)胞質(zhì)。而VEGF的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陽性患者25例，占49.02%。對(duì)不同年齡、性別、腫瘤直徑、病理分化級(jí)別以及匯管區(qū)癌栓患者的腫瘤組織微血管密度進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同腫瘤直徑、匯管區(qū)癌栓患者腫瘤微血管密度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。而以上因素與VEGF陽性表達(dá)的單因素分析結(jié)果顯示，不同匯管區(qū)癌栓患者VEGF的陽性表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表3。

2.4 腫瘤臨床病理與超聲造影動(dòng)態(tài)增強(qiáng)參數(shù)的關(guān)系

VEGF表達(dá)陽性的患者，其微血管密度、曲線下面積均明顯高于陰性表達(dá)的患者，而造影劑增強(qiáng)時(shí)間以及造影劑消退時(shí)間均明顯短于陰性表達(dá)的患者（P < 0.05）；腫瘤直徑<5 cm的患者，其微血管密度明顯低于腫瘤直徑≥5 cm的患者（P < 0.05），而其余超聲造影動(dòng)態(tài)參數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；匯管區(qū)有癌栓的患者，其微血管密度明顯高于無癌栓的患者，造影劑增強(qiáng)時(shí)間則明顯短于無癌栓患者（P < 0.05），其余參數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表4。

2.5 微血管密度以及超聲造影動(dòng)態(tài)增強(qiáng)參數(shù)之間的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)分析結(jié)果表明，微血管密度與造影劑增強(qiáng)時(shí)間呈顯著負(fù)相關(guān)（r = -0.609，P < 0.05），與曲線下面積呈顯著正相關(guān)（r = 0.558，P < 0.05）。

3 討論

惡性腫瘤已經(jīng)成為當(dāng)前人類生命健康的重大威脅之一，是人類死亡的主要原因之一[7]。腫瘤難以被徹底治愈的主要原因在于腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，造成機(jī)體多處病灶且難以被徹底清除。如何徹底消滅腫瘤病灶成為了學(xué)術(shù)界研究的熱點(diǎn)問題之一[8]。肝細(xì)胞癌是臨床上常見的惡性腫瘤之一，其最常見的轉(zhuǎn)移途徑是血行轉(zhuǎn)移[9]。腫瘤局部新生血管的情況對(duì)腫瘤的發(fā)生、生長和轉(zhuǎn)移等過程起到重要的作用[10-11]。超聲造影是一種無創(chuàng)性的診斷措施，能夠有效顯示腫瘤的血管分布情況，有助于臨床工作者準(zhǔn)確了解腫瘤的血管分布，對(duì)制訂具體的治療策略有十分重要的意義。

在本研究中，低分化級(jí)的腫瘤，其超聲造影門靜脈期以快出型為主，而高分化級(jí)以及中分化級(jí)則以慢出型為主，說明不同病理分化級(jí)別的腫瘤其超聲造影的表現(xiàn)有所不同，與廖繼安等[12]的研究結(jié)果基本一致。這主要是由于不同分化級(jí)別的腫瘤，其內(nèi)部的血管構(gòu)造不同，造成造影劑的排泄時(shí)間有所差異。低分化級(jí)的腫瘤，由于其新生血管豐富，存在大量動(dòng)靜脈瘺，能夠通過更多的血流，因此造影劑達(dá)到腫瘤血管后，更容易達(dá)到峰值以及更快消退[13]。相關(guān)研究表明，在肝細(xì)胞癌的發(fā)展過程中，其血流動(dòng)力學(xué)呈漸進(jìn)性改變，隨著腫瘤內(nèi)新生血管的增多，門靜脈的血流逐漸變少，而使腫瘤的血流供應(yīng)不斷增多[14]。而超聲造影的曲線下面積能夠很好地反映出腫瘤的血流供應(yīng)情況，為臨床肝細(xì)胞癌的診斷及其臨床病理分期的初步判斷提供可靠的參考。在本研究中，通過腫瘤的臨床病理分化級(jí)別與超聲造影動(dòng)態(tài)參數(shù)之間關(guān)系的分析也表明，腫瘤的病理分化級(jí)別越低，其造影劑的增強(qiáng)時(shí)間和消退時(shí)間均明顯縮短，而曲線下面積則正好相反，同時(shí)曲線下面積和微血管密度呈正相關(guān)（P < 0.05）。

研究表明，實(shí)體瘤的生長需要新生血管的支持以維持其血液供應(yīng)[15]。血液供應(yīng)豐富的腫瘤，其生長、轉(zhuǎn)移等發(fā)展則更為迅速，而VEGF在新生血管的生成中起到了重要的作用[16-17]。在本研究中，VEGF表達(dá)陽性的腫瘤，其微血管密度也明顯增加，兩者的相關(guān)性明顯。而對(duì)VEGF表達(dá)陽性的患者來說，其造影劑的增強(qiáng)時(shí)間、消退時(shí)間以及曲線下面積均和陰性患者有明顯的差異。這說明超聲造影能夠作為一種檢測(cè)腫瘤的血管分布情況的較為敏感的手段。同時(shí)，由于VEGF的表達(dá)與腫瘤的轉(zhuǎn)移能力有直接的關(guān)系[18-20]，因此，通過超聲造影的時(shí)間-強(qiáng)度曲線，能夠?yàn)榕R床上判斷腫瘤的血管生成情況以及腫瘤的復(fù)發(fā)以及預(yù)后提供重要的參考信息。

綜上所述，超聲造影的增強(qiáng)時(shí)間、消退時(shí)間等動(dòng)態(tài)增強(qiáng)參數(shù)能夠反映出肝細(xì)胞癌腫瘤內(nèi)的微血管密度情況，而曲線下面積能夠反映出腫瘤的血流供應(yīng)情況，對(duì)超聲造影檢查的結(jié)果進(jìn)行綜合評(píng)估，能夠?yàn)榕R床診斷肝細(xì)胞癌以及明確其病理分化級(jí)別等臨床病理特征提供重要的參考，幫助臨床制訂更有針對(duì)性的治療策略。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 陳萬青，鄭榮壽，曾紅梅，等.1989-2008年中國惡性腫瘤發(fā)病趨勢(shì)分析[J].中華腫瘤雜志，2012，34（7）：517-524.

[2] 楊君伶，姚登福.細(xì)胞間黏附分子-1異常表達(dá)與肝癌的侵襲生長和轉(zhuǎn)移[J].中華肝臟病雜志，2012，20（2）：158-160.

[3] Sever AR，Mills P，Weeks J，et al. Preoperative needle biopsy of sentinel lymph nodes using intradermal microbubbles and contrast-enhanced ultrasound in patients with breast cancer [J]. AJR，2012，199（2）：465-470.

[4] 杜海峰，魏長宏，王作志，等.體部伽瑪?shù)堵?lián)合高強(qiáng)度聚焦超聲治療中晚期原發(fā)性肝癌的療效觀察[J].醫(yī)學(xué)綜述，2015，21（3）：572-573，576.

[5] 張磊.原發(fā)性肝癌介入治療的研究現(xiàn)狀[J].醫(yī)學(xué)綜述，2014，20（8）：1392-1394.

[6] 甘思遠(yuǎn)，鐘雪云，謝思明，等.腫瘤耐藥相關(guān)蛋白及β-catenin在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義[J].癌癥，2010，29（3）：323-329.

[7] Honeychurch J，Alduaij W，Azizyan M，et al. Antibody-induced nonapoptotic cell death in human lymphoma and leukemia cells is mediated through a novel reactive oxygen species-dependent pathway [J]. Blood，2012，119（15）：3523-3533.

[8] 高萍，張俊杰.腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究進(jìn)展[J].國際外科學(xué)雜志，2011，38（1）：40-43.

[9] 欽倫秀，葉青海，湯釗猷，等.肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的分子機(jī)制與預(yù)測(cè)：從組學(xué)研究到臨床應(yīng)用[J].中華外科雜志，2012，50（1）：1-3.

[10] Vásquez Osorio EM，Hoogeman MS，Méndez Romero A，et al. Accurate CTMR vessel-guided nonrigid registration of largely deformed livers [J]. Medical Physics，2012，39（5）：2463-2477.

[11] Du CY，Chen JG，Zhou Y，et al. Impact of lymphatic and/or blood vessel invasion in stage Ⅱ gastric cancer[J]. World Journal of Gastroenterology，2012，18（27）：3610-3616.

[12] 廖繼安，王愛玉，張化誠，等.不同分化程度、不同病理類型小肝癌患者超聲造影表現(xiàn)分析[J].中華醫(yī)學(xué)超聲雜志：電子版，2012，9（2）：136-141.

[13] Lirdprapamongkol K，Chiablaem K，Sila-Asna M，et al. Exploring stemness gene expression and vasculogenic mimicry capacity in well- and poorly-differentiated hepatocellular carcinoma cell lines [J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，2012，422（3）：429-435.

[14] Lin ZY，Chen J，Deng XF，et al. Treatment of hepatocellular carcinoma adjacent to large blood vessels using 1.5T MRI-guided percutaneous radiofrequency ablation combined with iodine-125 radioactive seed implantation [J]. European Journal of Radiology，2012，81（11）：3079-3083.

[15] 楊一林，段云友，楊瑞靜，等.超聲造影時(shí)問強(qiáng)度量化分析與肝細(xì)胞肝癌VEGF表達(dá)及微血管密度間關(guān)系的初步研究[J].中華超聲影像學(xué)雜志，2011，20（4）：307-310.

[16] 薛慧婷.血管內(nèi)皮生長因子在肝癌診治中的作用[J].醫(yī)學(xué)綜述，2012，18（16）：2578-2580.

[17] Tomiá TT，Gustavsson H，Wang W，et al. Castration resistant prostate cancer is associated with increased blood vessel stabilization and elevated levels of VEGF and Ang-2 [J]. The Prostate，2012，72（7）：705-712.

[18] 楊一林，段云友，楊瑞靜，等.時(shí)間-強(qiáng)度量化分析與原發(fā)性肝癌預(yù)后的初步研究[J].中國超聲醫(yī)學(xué)雜志，2011， 27（12）：1094-1097.

[19] 徐青，張一心，王志偉，等.肝癌組織微血管計(jì)數(shù)的臨床意義[J].肝膽胰外科雜志，2005，17（1）：11-13.

[20] 程繼榮，徐虓，王淑琴，等.肺癌組織CD31、CD34及CD105標(biāo)記的微血管密度的臨床意義[J]. 中國癌癥雜志，2010，20（8）：638-640.

（收稿日期：2015-12-01 本文編輯：程 銘）