申光輝，黎梅，王玥，楊紅霞，唐倩，劉小英，張志清

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安，625014)

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發(fā)酵低醇西瓜果酒產(chǎn)香酵母的分離篩選及香氣成分分析

申光輝*，黎梅，王玥，楊紅霞，唐倩，劉小英，張志清

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安，625014)

為獲得適宜低醇西瓜果酒發(fā)酵的酵母菌株，以嗅聞香氣和總酯產(chǎn)量為指標(biāo)，從傳統(tǒng)白酒酒曲中分離篩選獲得5株產(chǎn)香酵母。通過(guò)菌株形態(tài)、生理生化特征，結(jié)合26SrRNA序列分析，將菌株Z133鑒定為異常威克漢姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)，菌株Z2、Z31、Z32和Z43鑒定為扣囊復(fù)膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)。菌株Z133可產(chǎn)濃郁的果香氣味，對(duì)糖、SO2及乙醇均有良好的耐受性，可發(fā)酵西瓜汁獲得乙醇體積分?jǐn)?shù)5.6%的低醇西瓜果酒。采用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法分析發(fā)現(xiàn)，酒體中醇類和酯類香氣成分種類和相對(duì)含量高于未發(fā)酵西瓜汁，主要香氣成分苯乙醇、乙酸香葉酯和乙酸異戊酯的相對(duì)含量分別為25.65%、6.41%和3.93%。結(jié)果表明，從酒曲獲得的產(chǎn)香酵母菌株Z133在低醇西瓜果酒發(fā)酵中具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

產(chǎn)香酵母；低醇西瓜果酒；香氣成分；頂空固相微萃取

西瓜(Citrullus lanatusThunb.)瓤甜多汁，富含糖類、有機(jī)酸、維生素等營(yíng)養(yǎng)功能成分，深受消費(fèi)者喜愛(ài)。由于產(chǎn)期集中、不耐貯存，常以鮮食為主。利用西瓜汁發(fā)酵果酒是緩解西瓜滯銷問(wèn)題，提高產(chǎn)品附加值的有效途徑。風(fēng)味淡薄是目前大部分果酒生產(chǎn)中迫切需要解決的問(wèn)題[1]。發(fā)酵菌種是影響果酒口感風(fēng)味的重要因素之一，而目前西瓜果酒多用葡萄酒酵母發(fā)酵[2]，篩選適合西瓜果酒發(fā)酵的優(yōu)良酵母菌種的研究工作開(kāi)展較少，且多以菌株產(chǎn)乙醇能力為指標(biāo)[3]，忽視了菌種的發(fā)酵產(chǎn)香性能對(duì)果酒風(fēng)味的積極影響。產(chǎn)香酵母屬于可產(chǎn)醇、醛、酯等多種芳香物質(zhì)的非釀酒酵母，能夠積極改變酒體的化學(xué)成分，對(duì)酒的感官風(fēng)味品質(zhì)有特別的貢獻(xiàn)，可改善傳統(tǒng)釀酒酵母釀制的果酒風(fēng)味，在果酒生產(chǎn)中應(yīng)用潛力巨大[4-11]。酒曲是我國(guó)傳統(tǒng)白酒釀造的發(fā)酵生香劑，蘊(yùn)含著產(chǎn)香酵母在內(nèi)的多樣化釀酒功能菌資源[12-14]。本實(shí)驗(yàn)從酒曲中分離篩選適于低醇西瓜果酒發(fā)酵的產(chǎn)香酵母，進(jìn)行菌株分類鑒定和發(fā)酵性能測(cè)定，并檢測(cè)發(fā)酵低醇西瓜果酒香氣成分，以評(píng)價(jià)該菌株用于發(fā)酵低醇西瓜果酒的可行性。

1　材料與方法

1.1材料

酒曲：中溫曲和中高溫成熟曲，由四川省瀘州市某酒廠提供。西瓜：市售成熟西瓜。

1.2培養(yǎng)基

麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基(g/L)：葡萄糖1.0，氯化鉀1.8，酵母膏2.5，醋酸鈉8.2，pH自然，115 ℃滅菌15min。YPD培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20.0，蛋白胨20.0，酵母膏10.0，瓊脂15.0，pH6.0，115 ℃滅菌15min。PDA培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯(去皮)200.0，葡萄糖20.0，瓊脂15.0，pH自然，121 ℃滅菌20min。豆芽汁培養(yǎng)基：取黃豆芽200.0g加適量水煮沸30min，紗布過(guò)濾得豆芽汁，加葡萄糖20.0g溶解，補(bǔ)水至1 000mL，121 ℃滅菌15min[10]。西瓜汁培養(yǎng)基：鮮西瓜取瓤榨汁過(guò)濾，用蔗糖調(diào)整糖度至18°Bx，pH自然，115 ℃滅菌15min。

1.3儀器與設(shè)備

SHP-160生化培養(yǎng)箱，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；GI54DWS高壓滅菌器，致微(廈門)儀器有限公司；SW-CJ-2D雙人單面潔凈工作臺(tái)，蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司；NikonEclipseE100光學(xué)顯微鏡，南京貝登生物科技有限公司；UV-3100PC紫外分光光度計(jì)，上海美普達(dá)儀器有限公司；JA1203B電子天平，上海越平科學(xué)儀器有限公司；ZWY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司。PX-B32T型水果糖度儀，廣州市普析通儀器有限公司；Agilent7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent公司；SPME手動(dòng)進(jìn)樣器、15mL進(jìn)樣瓶、57328-U手動(dòng)固相微萃取裝置、50/30μmDVB/CAR/PDMS固相微萃取纖維頭，美國(guó)Supelco公司。

1.4產(chǎn)香酵母菌分離與純化

稱取5.00g酒曲粉碎樣品加入到100mL無(wú)菌水制成懸液，取1.0mL加入到9.0mL麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基試管中，28 ℃，120r/min振蕩富集培養(yǎng)24h。富集培養(yǎng)液梯度稀釋，取10-2、10-3、10-4、10-5梯度稀釋液各100μL，分別涂布于YPD平板，28 ℃培養(yǎng)48h。挑取酵母樣菌落進(jìn)行鏡檢，反復(fù)平板劃線法純化后接種于PDA斜面，28 ℃培養(yǎng)48h，4 ℃保藏備用。

1.5產(chǎn)香酵母篩選

將分離菌株劃線接種于YPD平板上，28 ℃培養(yǎng)3～5d，通過(guò)嗅聞法[15]初步判斷是否有酯香或醇香，篩選具有較濃酯香氣或特殊果香氣的菌株。將初篩獲得的酵母菌接種于PDA液體培養(yǎng)基中，28 ℃活化培養(yǎng)24h至酵母菌數(shù)為108CFU/mL。將酵母菌活化液用按體積分?jǐn)?shù)0.4%接入裝有200mL豆芽汁液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，28 ℃下靜置培養(yǎng)3d。取150mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入250mL圓底燒瓶中，采用回流皂化法[16]測(cè)定培養(yǎng)液總酯含量(以乙酸乙酯計(jì))，篩選出產(chǎn)酯量較高的菌株。

1.6產(chǎn)香酵母菌鑒定

1.6.1形態(tài)及生理生化鑒定

參照《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》[17]，進(jìn)行菌株形態(tài)學(xué)觀察和生理生化特征測(cè)定。

1.6.226SrRNAD1/D2區(qū)序列分析

采用酵母基因組提取試劑盒提取酵母總DNA。引物采用NL1：5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’，NL4：5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’。50μLPCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：Taq酶0.25μL、Buffer5μL、dNTP4μL、DNA模板1μL、引物NL1/NL4各1μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5min，94 ℃變性1min，48 ℃退火1min，72 ℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒純化后，送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測(cè)序。測(cè)得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，選取相似度較高的模式菌株序列，用ClustalX1.83軟件進(jìn)行序列比對(duì)，用MEGA5.1軟件，Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.7產(chǎn)香酵母Z133生長(zhǎng)耐受性能測(cè)定

制備不同初始糖度、不同pH、不同SO2質(zhì)量分?jǐn)?shù)及不同乙醇體積分?jǐn)?shù)的滅菌西瓜汁培養(yǎng)基，按1×105CFU/mL接種量接入酵母菌種子液，28 ℃培養(yǎng)48h，血球計(jì)數(shù)法測(cè)定酵母細(xì)胞總數(shù)，以考察菌株對(duì)糖度、酸度、SO2及乙醇的耐受性。同時(shí)將相同接種量的西瓜汁培養(yǎng)基在不同溫度下培養(yǎng)48h計(jì)數(shù)，考察菌株溫度耐受性。

1.8產(chǎn)香酵母Z133發(fā)酵低醇西瓜果酒揮發(fā)性香氣成分分析

1.8.1低醇西瓜果酒發(fā)酵及理化指標(biāo)測(cè)定

將榨汁過(guò)濾的西瓜汁，用蔗糖調(diào)整糖度至20°Bx，檸檬酸調(diào)pH至4.0，添加80mg/LSO2，按1×105CFU/mL接種量接入酵母菌種子液，30 ℃發(fā)酵6d后過(guò)濾澄清，獲得低醇西瓜果酒。發(fā)酵過(guò)程中總糖、總酸及乙醇體積分?jǐn)?shù)測(cè)定參考GB/T15038—2006[18]。

1.8.2果酒揮發(fā)性香氣成分分析

采用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法[8, 15]。取5mL果酒(或西瓜汁)于15mL頂空瓶中60 ℃恒溫水浴平衡5min，將老化好的固相微萃取頭插入頂空瓶中萃取30min，移入GC-MS進(jìn)樣口解吸3min，分析香氣成分。色譜條件：毛細(xì)管色譜柱AgilentHP-5MS(30m×250μm，0.25μm)；手動(dòng)不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣口溫度250 ℃；程序升溫：初始溫度40 ℃，保留2min，以5 ℃/min到220 ℃，保留2min；檢測(cè)器溫度250 ℃；載氣He，流速1mL/min。質(zhì)譜條件：EI電離源，230 ℃，電子能量70eV，四極桿溫度150 ℃，質(zhì)量掃描范圍50～550u。未知化合物經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索同時(shí)與NIST11譜庫(kù)匹配，對(duì)匹配度大于80的化合物進(jìn)行分析，峰面積歸一法計(jì)算香氣成分的相對(duì)含量。

1.9數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用DPS7.05軟件，Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行結(jié)果顯著性差異分析。

2　結(jié)果與分析

2.1產(chǎn)香酵母篩選

從YPD平板上挑出具有酵母菌典型特征的菌落，結(jié)合顯微形態(tài)觀察從中溫酒曲分離獲得36株酵母菌株，中高溫曲未分離到酵母菌。

將分離純化的36株酵母菌劃線于YPD平板上，28 ℃培養(yǎng)3～5d，通過(guò)嗅聞初步篩選出風(fēng)味柔和、有發(fā)酵香氣的5株菌Z133、Z2、Z31、Z32、Z43，其中Z133菌株具有特殊的果香味。將具有發(fā)酵香氣的5株酵母菌接種到豆芽汁培養(yǎng)基中靜止培養(yǎng)3d，測(cè)定培養(yǎng)液總酯含量。由表1可見(jiàn)，酵母菌株Z31培養(yǎng)液總酯含量最高，為0.48g/L，菌株Z133培養(yǎng)液總酯含量最低，但其發(fā)酵具有濃郁的果香香氣，而其他4株酵母香氣較淡。

表1　五株酵母菌培養(yǎng)液總酯含量

注：不同小寫(xiě)字母表示在P<0.05水平上差異顯著。

2.2產(chǎn)香酵母鑒定

2.2.1形態(tài)學(xué)鑒定

5株產(chǎn)香酵母菌的菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)特征見(jiàn)表2和圖1。

表2　五株產(chǎn)香酵母菌落特征

圖1　五株產(chǎn)香酵母菌落特征Fig.1　Colony morphology of five aroma-producing yeast strains on PDA plates

2.2.2生理生化鑒定

表3是5株酵母生理生化特征結(jié)果，根據(jù)《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》初步將Z133鑒定為威克漢姆酵母屬Wickerhamomyces，Z2、Z31、Z32和Z43鑒定為復(fù)膜孢酵母屬Saccharomycopsis。

2.2.326SrRNA序列分析鑒定

將菌株26SrRNAD1/D2片段序列測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中酵母模式菌株基因序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，選取相似度較高的標(biāo)準(zhǔn)菌株序列，Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

由圖2可見(jiàn)，菌株Z133與異常威克漢姆酵母Wickerhamomyces anomalusNRRLY-366(GenBank登錄號(hào)：U74590)聚在同一分支，且支持率100%，Z2，Z31，Z32，Z43四株菌與扣囊復(fù)膜酵母Saccharomycopsis fibuligera(GenBank登錄號(hào)：U40088)聚在同一分支。因此，結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化特征，將Z133鑒定為異常威克漢姆酵母W. anomalus，Z2，Z31，Z32，Z43鑒定為扣囊復(fù)膜酵母S.fibuligera。

表3　5株產(chǎn)香酵母生理生化特性

注：“+”為陽(yáng)性，“-”為陰性。

2.3產(chǎn)香酵母Z133發(fā)酵耐受性

果酒發(fā)酵酵母生長(zhǎng)發(fā)酵的耐受性能是評(píng)價(jià)菌株發(fā)酵能力的重要方面，同時(shí)也是進(jìn)行果酒發(fā)酵條件控制的主要依據(jù)。由表4可知，菌株Z133生長(zhǎng)溫度范圍較寬，在30 ℃生長(zhǎng)發(fā)酵最快。在15～25°Bx的糖度范圍內(nèi)生長(zhǎng)良好，最低可耐受pH3.0的酸性環(huán)境。此外，該菌株對(duì)SO2和乙醇的耐受性良好，最高可耐受200mg/L的SO2濃度及體積分?jǐn)?shù)12%的乙醇。

2.4產(chǎn)香酵母Z133發(fā)酵低醇西瓜果酒揮發(fā)性香氣成分

本實(shí)驗(yàn)篩選獲得5株產(chǎn)香酵母中，菌株Z133總酯產(chǎn)量雖然不高，但其培養(yǎng)液具有濃郁的果香氣味。因此以菌株Z133為發(fā)酵菌株，按1.7.1方法發(fā)酵低醇西瓜果酒，獲得的西瓜果酒酒體金黃色，清亮透明，光澤較好，有濃郁的酒香氣和西瓜果香，酸甜適口，酒體較完整，饒有余味。由表5可見(jiàn)，Z133可消耗利用

西瓜汁中的糖分發(fā)酵轉(zhuǎn)化成乙醇，6d后獲得的低醇西瓜果酒乙醇體積分?jǐn)?shù)為5.6%，酸度為4.7g/L。

圖2　基于26S rRNA D1/D2區(qū)域序列構(gòu)建的5株產(chǎn)香酵母菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2　Phylogenetic tree of five aroma-producing yeast strains based on 26S rRNA D1/D2 domain sequence analyses

表4　產(chǎn)香酵母Z133發(fā)酵耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注：“-”表示未生長(zhǎng)發(fā)酵；同列數(shù)值后不同小寫(xiě)字母表示在P<0.05水平上差異顯著，下表同。

表5　產(chǎn)香酵母Z133發(fā)酵西瓜果酒過(guò)程中還原糖、殘?zhí)?、酸度和乙醇體積分?jǐn)?shù)的變化

注：-表示未測(cè)定。

采用頂空固相微萃取結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用法檢測(cè)分析了西瓜汁與發(fā)酵西瓜果酒的揮發(fā)性香氣成分。由表6可知，西瓜汁中揮發(fā)性香氣成分較少，主要包括醛類、烯類、酸類成分，其中壬醛和檸檬醛為主要醛類物質(zhì)，相對(duì)含量分別為5.10%和4.59%，烯類包括β-甜沒(méi)藥烯、α-姜黃烯和β-柏木烯，相對(duì)含量分別為3.14%、1.25%和2.17%，此外葵醚相對(duì)含量2.86%。

本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到的揮發(fā)性化合物種類相對(duì)于其他研究結(jié)果[19-20]較少，這除了與所用西瓜材料品種及成熟度有關(guān)外，還與所用揮發(fā)性物質(zhì)萃取分離分析的技術(shù)條件有關(guān)。相對(duì)于未發(fā)酵西瓜汁，Z133發(fā)酵6d獲得的低醇西瓜果酒增加了4種醇類和4種酯類揮發(fā)性香氣成分。其中乙醇、苯乙醇是主要醇類物質(zhì)，相對(duì)含量分別為4.81%和25.65%，而酯類主要為乙酸異戊酯和乙酸香葉酯，相對(duì)含量分別達(dá)3.93%和6.41%。結(jié)果表明菌株Z133賦予西瓜果酒獨(dú)特的感官風(fēng)味與其發(fā)酵代謝西瓜汁過(guò)程中產(chǎn)生的醇類和酯類物質(zhì)有關(guān)。

表6　產(chǎn)香酵母Z133發(fā)酵低醇西瓜果酒和西瓜汁揮發(fā)性成分比較

注：-表示未檢測(cè)到。

3　討論

本實(shí)驗(yàn)從白酒中溫曲中分離到5株產(chǎn)香酵母，包括1株異常威克漢姆酵母Wickerhamomyces anomalus和4株扣囊復(fù)膜酵母Saccharomycopsis fibuligera，均是醬香型[21]和濃香型[12]酒曲中常見(jiàn)的優(yōu)勢(shì)非釀酒酵母。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)異常威克漢姆酵母Z133豆芽汁培養(yǎng)液總酯含量雖然不高，但其發(fā)酵的西瓜果酒具有怡人的濃郁果香味，同時(shí)在生長(zhǎng)耐受能力方面具有發(fā)酵低醇西瓜果酒的應(yīng)用潛力。

低醇果酒是乙醇體積分?jǐn)?shù)為1%～7%的發(fā)酵果酒[18]，可減少高酒精度對(duì)身體健康的危害，且口感柔和，受到越來(lái)越多的消費(fèi)群體，特別是酒精耐受力較弱人群的青睞。同時(shí)乙醇濃度對(duì)果酒芳香風(fēng)味有著重要影響，較高的乙醇含量降低一些香氣成分的貢獻(xiàn)率，導(dǎo)致果酒芳香度降低，風(fēng)味更淡[22-23]。低醇果酒能以較低的乙醇含量改善目前果酒風(fēng)味淡薄的問(wèn)題，近年來(lái)逐漸成為果酒研究的重要趨勢(shì)。而非釀酒酵母乙醇產(chǎn)量低的代謝特點(diǎn)正適合于發(fā)酵低醇果酒，是發(fā)酵低醇果酒的重要方式[24]。

本實(shí)驗(yàn)篩選獲得的異常威克漢姆酵母Z133發(fā)酵6d即可獲得乙醇體積分?jǐn)?shù)5.6%的低醇西瓜果酒，同時(shí)代謝產(chǎn)生多種醇類、酯類香氣化合物，賦予其獨(dú)特的發(fā)酵醇香和酯香氣。其中苯乙醇相對(duì)含量最高，為25.65%，在其他來(lái)源的異常威克漢姆酵母產(chǎn)香代謝物研究中均有報(bào)道[8, 25-27]。

本研究從白酒酒曲中分離篩選獲得5株產(chǎn)香酵母菌株，經(jīng)鑒定分屬于異常威克漢姆酵母和扣囊復(fù)膜酵母。其中異常威克漢姆酵母Z133產(chǎn)果香能力強(qiáng)，能夠耐受200mg/LSO2及體積分?jǐn)?shù)12%的乙醇，以其發(fā)酵獲得的低醇西瓜果酒乙醇體積分?jǐn)?shù)5.6%，含有苯乙醇、乙酸異戊酯、乙酸香葉酯等香氣成分。Z133具有發(fā)酵低醇西瓜果酒的潛力。

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Screeningandidentificationofaroma-producingyeaststrainsforlow-alcoholwatermelonwineandcharacterizationofaromaticcompounds

SHENGuang-hui*，LIMei，WANGYue，YANGHong-xia，TANGQian，LIUXiao-ying，ZHANGZhi-qing

(CollegeofFoodScience,SichuanAgriculturalUniversity,Ya’an625014,China)

Toobtainyeaststrainforlow-alcoholwatermelonwineproduction,fivearoma-producingyeaststrainswereisolatedfromtraditionalChinesewinestarterbyolfactometryandesterproductiondetermination.Basedonmorphological,physiologicalandbiochemicalcharacteristicsand26SrRNAD1/D2domainsequenceanalysis,strainZ133wasidentifiedasWickerhamomyces anomalusandZ2,Z31,Z32andZ43wereidentifiedasSaccharomycopsis fibuligera.StrainZ133couldproduceenjoyablefruitaromaflavorandshowedwelltolerancetosugar,SO2andethanol.Thearomacompoundsinlow-alcoholwatermelonwine(ethanolconcentrationwas5.6%)fermentedwithstrainZ133wereanalyzedbyheadspacesolidphasemicroextractioncombinedwithgaschromatography-massspectrometry,andthemainvolatilearomacompoundsinlow-alcoholwatermelonwinewerebenzeneethanol,geranylacetateandisoamylacetate,whichrepresented25.65%, 6.41%and3.93%ofthetotalvolatilecompounds,respectively.TheresultsshowedthatstrainZ133hadgreatpotentialforproducinglow-alcoholwatermelonwine.

ester-producingyeast;low-alcoholwatermelonwine;aromaticcompounds;headspacesolidphasemicroextraction

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201608019

博士，講師(本文通訊作者，E-mail:shenghuishen@163.com)。

國(guó)家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303073)；四川農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生科研興趣培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目(2014155)

2016-02-24，改回日期：2016-04-07