周運(yùn)恒， 馬紅霞， 李 戩， 石曉星， 劉風(fēng)華

·論著·

2012—2015年某醫(yī)院男性不育患者精液支原體陽性率和耐藥情況動態(tài)分析

周運(yùn)恒1， 馬紅霞2， 李 戩1， 石曉星1， 劉風(fēng)華1

目的 了解近4年來武警上海市總隊醫(yī)院男性不育患者精液中支原體檢測陽性率和耐藥情況，為臨床抗菌藥物的合理使用提供參考。方法 以4年來的3 278例男性不育患者和348例健康對照者為研究對象，采用固體-液體培養(yǎng)基聯(lián)合檢測對精液標(biāo)本中的脲原體屬和人型支原體進(jìn)行培養(yǎng)、鑒定和藥敏試驗；采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行比較分析。結(jié)果 近4年男性不育患者精液脲原體屬和人型支原體的總陽性率為35 %～50 %，以脲原體屬為主，其陽性率為31 %～40 %，均顯著高于健康對照組（P＜0.05）；2012－2014年各種支原體陽性率變化不大；2015年總陽性率和脲原體屬的陽性率高于前幾年的陽性率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；1 259例男性不育者支原體陽性的年齡主要集中在26～30歲和31～35歲年齡段，分別為37.8 %和32.1 %。在10種抗菌藥物中，脲原體屬對四環(huán)素類和大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物的耐藥率較低，均小于5 %，4年中對各種藥物的耐藥率變化不大。結(jié)論 該地區(qū)近4年來男性不育患者精液中支原體陽性率較高，且以脲原體屬為主，多集中于26～30歲和31～35歲年齡段，與前3年相比，2015年陽性率明顯升高，近4年來各種藥物的耐藥性變化不大，治療上應(yīng)首選四環(huán)素類和大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物。

脲原體屬； 人型支原體； 不育； 耐藥性

近年來不育不孕發(fā)病率（15 %～20 %）逐漸上升，而且很多原因不明。大量研究表明，約15 %男性不育由泌尿生殖道病原體感染引起，而感染率最高的是脲原體屬（以前稱解脲脲原體屬、解脲支原體或溶脲脲原體屬，Ureaplasma spp.），其次是人型支原體（Mycoplasma hominis）、生殖支原體、衣原體、淋病奈瑟菌和病毒等［1-2］。這些病原體與男性不育之間的關(guān)系目前仍不甚清晰，而且很多致病機(jī)制不明確。文獻(xiàn)對脲原體屬和人型支原體在精液中的陽性率和耐藥性的報道差異較大，可能與檢測方法、受檢人群和用藥習(xí)慣等因素有關(guān)［3］。目前國內(nèi)外對男性不育患者的研究較少，而且所分析標(biāo)本多為尿道分泌物或前列腺液，而精液作為男性不育與支原體關(guān)系研究的首選標(biāo)本，其覆蓋面更廣、漏診率更低，更能反映患者的感染情況［4］。本研究采用液體-固體培養(yǎng)法對本地區(qū)近4年男性不育患者精液標(biāo)本感染的脲原體屬和人型支原體進(jìn)行檢測及藥敏結(jié)果分析，探討陽性率和耐藥性變化情況，為臨床診治提供更為客觀的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象 以2012年1月－2015年12月在武警上海市總隊醫(yī)院就診的3 278例男性不育患者為研究對象，年齡21～50歲，符合不育癥診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］。隨機(jī)選擇348例已經(jīng)有生育或者妻子已經(jīng)懷孕的健康男性作為對照組。

1.1.2 標(biāo)本采集 禁欲3～7 d后手淫取精液于干燥消毒量杯內(nèi)，立即送檢，置37℃水浴箱內(nèi)液化。

1.1.3 試劑 支原體選擇性固體培養(yǎng)基和支原體分離、培養(yǎng)、鑒定、藥敏試劑盒由眾愛生河北生物科技有限公司提供，用OLYMPUS CR21顯微鏡觀察。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)及體外藥敏操作步驟 吸取液化后的精液100 μL分別接種在固體培養(yǎng)基和基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，用移液器分至商品化試劑盒的微孔板鑒定孔和藥敏孔中，所有操作步驟均嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，在37℃ 5 % CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)48～72 h觀察結(jié)果。10種抗菌藥物分別是多西環(huán)素、米諾環(huán)素、交沙霉素、阿奇霉素、克拉霉素、羅紅霉素、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、司帕沙星和氧氟沙星。

1.2.2 結(jié)果判斷 液體培養(yǎng)基判斷標(biāo)準(zhǔn)：培養(yǎng)48 h，液體培養(yǎng)基由黃色變成紅色和橙紅色，且清亮為陽性，提示有支原體生長，凡≥104CFU（菌落形成單位）/mL鑒定孔試劑變色為支原體陽性的初篩對象，≤104CFU/mL為攜帶者或無致病意義。固體培養(yǎng)基陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)：培養(yǎng)48 h，用顯微鏡在低倍鏡下觀察支原體的菌落生長情況，以看到固體培養(yǎng)基上生長的支原體菌落作為陽性的確診標(biāo)準(zhǔn)。脲原體屬菌落較小，圓形棕褐色，多為海膽型；人型支原體菌落較大，無色、有寬大透明的周邊帶環(huán)繞的油煎蛋樣。

藥敏判斷標(biāo)準(zhǔn)：通過顏色變化判斷，每種藥物均有高低2個濃度，藥敏孔變紅色為陽性，變黃色為陰性，兩孔均陰性為敏感（S），前孔陽性，后孔陰性為中介（I），兩孔均陽性為耐藥（R）。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)處理 用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，支原體陽性率和抗菌藥物敏感率的比較采用Pearson卡方檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 支原體培養(yǎng)陽性率

近4年男性不育患者精液脲原體屬和人型支原體的各年陽性率為35 %～50 %，均以脲原體屬為主，其陽性率為31 %～40 %，人型支原體合并脲原體屬的混合陽性率為0.9 %～9.1 %，人型支原體陽性率非常低，僅為0～2.1 %。不育組總陽性率和脲原體屬的陽性率分別高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。2012－2014年各種支原體陽性率變化不大，2015年總陽性率和脲原體屬的陽性率高于前幾年的陽性率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

2.2 支原體陽性不育者年齡分布

共有1 259例男性不育者支原體培養(yǎng)陽性，占不育者的38.4 %。支原體陽性者年齡主要集中在26～30歲和31～35歲年齡段，分別為37.8 %和32.1 %，各年齡段的陽性率見表2。

表1 近4年不育患者精液支原體陽性率Table1 Prevalence of Mycoplasma in semen specimens of infertile males from 2012 to 2015

表2 1259例男性不育患者支原體陽性者年齡分布Table2 Isolation of Mycoplasma in 1 259 cases of infertile men in terms of age group

2.3 脲原體屬對10種抗菌藥物的耐藥性

排除人型支原體單純陽性和混合脲原體屬陽性的研究對象，在1 138例脲原體屬陽性患者中，脲原體屬對米諾環(huán)素、多西環(huán)素、羅紅霉素、阿奇霉素、交沙霉素和克拉霉素的耐藥率均小于5 %；脲原體屬對環(huán)丙沙星和氧氟沙星的耐藥率較高，分別在60 %～70 %和36 %～56 %，而對左氧氟沙星和司帕沙星的耐藥率較低，分別在3.4 %～16.5 %和4.8 %～11.3 %。近4年來各種藥物的耐藥率變化不大，無明顯升高或降低的趨勢，見表3。

表3 近4年男性不育患者檢出脲原體屬對10種抗菌藥物的耐藥率Table3 Antibiotic resistance of the Ureaplasma strains isolated from semen specimens of infertile males to ten antimicrobial agents from 2012 to 2015

3 討論

支原體的檢測主要有液體培養(yǎng)法、固體培養(yǎng)法、血清學(xué)方法和分子生物學(xué)方法。其中應(yīng)用較多的是液體培養(yǎng)法，該法操作方便、簡單，可以同時觀察藥敏結(jié)果，但是存在較多的假陽性和假陰性現(xiàn)象［6］。固體培養(yǎng)法可同時鑒別多種支原體混合感染，是檢測支原體的金標(biāo)準(zhǔn)，但操作煩瑣、成本較高［7-8］。既往文獻(xiàn)顯示男性不育患者生殖道感染率最高的是脲原體屬，國外為5 %～58 %，健康生育組為3 %～31 %［9-10］，國內(nèi)多為15%～20 %［11-14］。人型支原體在男性不育的致病作用和相關(guān)研究較少，但國外文獻(xiàn)報道其陽性率可高達(dá)10.8 %～28 %［15-17］，脲原體屬和人型支原體混合陽性率為7 %～22 %［18-19］。

本研究中，2012－2014年，男性不育患者脲原體屬和支原體檢測總陽性率均約35 %，無明顯變化，但都顯著高于對照組（18.9 %）。而2015年脲原體屬、混合陽性和總陽性率均高于前3年，可能原因是研究對象的變化，以及固體培養(yǎng)法的應(yīng)用提高了人型支原體及混合支原體的陽性率。而生育組接近20 %陽性率也說明健康人群也存在一定的隱性感染，支原體感染后大多癥狀輕微或無臨床癥狀。臨床上支原體感染的診斷需結(jié)合實驗室檢查、臨床癥狀、感染途徑等流行病學(xué)資料綜合判斷。最近在臨床實踐中發(fā)現(xiàn)，液體培養(yǎng)法對精液脲原體屬和人型支原體存在較高的假陰性，不同的加樣量和培養(yǎng)時間對液體培養(yǎng)法的結(jié)果影響也很大，而以往可能由于未仔細(xì)觀察固體培養(yǎng)基而造成部分假陰性結(jié)果的漏報。但與國外報道相比，人型支原體和混合支原體的陽性率還很低，是方法學(xué)的原因還是檢測人群流行病學(xué)的差異今后還需進(jìn)一步的研究。

由于支原體的主要傳播途徑為性接觸傳播，其陽性率與年齡和性行為相關(guān)［20］。本研究中男性不育患者支原體陽性者主要集中在26～30歲和31～35歲年齡段，占總陽性率的70 %，與其他文獻(xiàn)基本一致，說明生育高峰期和性活躍期的不育患者支原體陽性率也最高。

從本研究的藥敏結(jié)果看，近4年來單純脲原體屬陽性者對2種半合成四環(huán)素類和4種大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物的耐藥率都非常低，均小于5 %，而對氧氟沙星和環(huán)丙沙星的耐藥率較高，可能是由于本地區(qū)臨床上對后者使用率較高所致，對前兩者的耐藥率明顯低于喹諾酮類的左氧氟沙星和司帕沙星。半合成四環(huán)素類抗菌作用較強(qiáng)，半衰期長，口服吸收迅速，目前作為支原體治療的首選藥與其他文獻(xiàn)報道基本一致［21］。本研究近4年來的耐藥性與其他文獻(xiàn)報道基本一致，但都低于女性，可能原因是女性抗菌藥物用藥比較頻繁導(dǎo)致的耐藥性增加，另外精液標(biāo)本由于多種蛋白質(zhì)緩存體系的存在是否會對脲原體屬的耐藥性有影響也值得討論。支原體藥敏試驗最早在上世紀(jì)60年代提出，目前市場上的定性藥敏商品化試劑盒多參考革蘭陽性菌或梅里埃的標(biāo)準(zhǔn)，基本認(rèn)為方法學(xué)可靠，但缺乏質(zhì)控品和統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，市場上也存在質(zhì)量參差不齊的情況［22］。國內(nèi)外僅有少數(shù)單位開展定量藥敏檢測，而且其質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)在2012年底才確立，還需要其他國家和地區(qū)結(jié)合用藥情況進(jìn)一步完善［23-24］。所以，通過鑒定、分離、純化和傳代對感染的脲原體屬進(jìn)行定量藥敏試驗將會反映真正的耐藥性。

支原體感染可能從多方面影響男性生育能力，如通過干擾精子發(fā)生、影響精子代謝、影響精卵結(jié)合及生殖道局部免疫等機(jī)制。因為存在隱性感染，所以在臨床上關(guān)于支原體感染是否需要治療也存在一定的爭議，目前初步認(rèn)為其致病性可能與生物群或血清型、感染時間和患者的免疫狀態(tài)有關(guān)［25］。由于不育患者檢測人群、支原體陽性率和抗菌藥物耐藥譜的差異，以及感染后癥狀的不典型性，臨床上應(yīng)加強(qiáng)支原體的動態(tài)監(jiān)測和藥敏試驗，對于反復(fù)感染、經(jīng)驗性藥物治療效果不好的患者，最好進(jìn)行脲原體屬的定量藥敏試驗，個性化用藥，精準(zhǔn)治療，有助于提高對患者泌尿生殖系殘余支原體的清除和徹底治療［26］。

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Changing prevalence and antibiotic resistance profile of Mycoplasma in semen from infertile males during the period from 2012 to 2015

ZHOU Yunheng， MA Hongxia， LI Jian， SHI Xiaoxing， LIU Fenghua.
（Department of Laboratory Medicine，Armed Police Corps Hospital of Shanghai， Shanghai 201103， China）

Objective This study was undertaken to investigate the prevalence and antibiotic resistance profle of Mycoplasma in semen samples from infertile males during the period from 2012 to 2015 in Shanghai. Methods A total of 3 278 infertile male patients and 348 healthy controls were recruited into the study from the infertility clinic from 2012 to 2015 in our hospital. Culture，identifcation and the antimicrobial susceptibility testing were done to characterize Ureaplasma and Mycoplasma hominis strains. SPSS 21.0 software was used to analyze the data. Results In 3 278 cases of infertile men， the prevalence of Mycoplasma was 35 %-50 % from 2012 to 2015. The prevalence of Ureaplasma strains was predominant from 31 % to 40 %， signifcantly higher than in healthy controls （P＜0.05）. The prevalence of total Mycoplasma and Ureaplasma in infertile males was signifcantly higher in 2015 than in other 4 years （P＜0.05）. The males of 26 to 30 and 31 to 35 years of age showed high risk of Mycoplasma infection in the 1 259 infertile males， evidenced by positive Mycoplasma in 37.8 % and 32.1 %， respectively. The Ureaplasma strains showed the lowest resistance rate to semisynthetic tetracyclines and macrolides （＜5 % resistant）. No obvious change about the resistant rateswas observed in the last 4 years. Conclusions The prevalence of Mycoplasma， especially Ureaplasma spp.， is high in the infertile males in Shanghai. The prevalence of Mycoplasma in 2015 was the highest in the last 4 years. The males of 26 to 30 and 31 to 35 years of age have high risk of Mycoplasma infections in the infertile males. Tetracyclines and macrolides are of choice for the potential Mycoplasma infection in theinfertile males in Shanghai.

Ureaplasma spp.； Mycoplasma hominis； infertility； antimicrobial susceptibility testing

R375

A

1009-7708 （ 2016） 05-0648-05

10.16718/j.1009-7708.2016.05.022

2015-12-21

2016-02-20

上海市自然科學(xué)基金（13ZR1449700）。

1. 武警上海市總隊醫(yī)院檢驗科，上海 201103；

2. 上海市東方醫(yī)院體檢中心。

周運(yùn)恒（1976—），男，博士，副主任技師，主要從事臨床微生物學(xué)及免疫學(xué)檢驗工作。

馬紅霞，E-mail：mahx2004@126.com。