包玉龍，張三潤，徐宋瑤，周好樂

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110）

軟體動物牡蠣肌聯(lián)蛋白一級結(jié)構(gòu)的預(yù)測

包玉龍，張三潤，徐宋瑤，周好樂

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110）

旨在預(yù)測牡蠣肌聯(lián)蛋白的基因exon-intron結(jié)構(gòu)，并確定其一級結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)域。利用生物信息學(xué)方法，從牡蠣基因組數(shù)據(jù)中預(yù)測肌聯(lián)蛋白基因的exon-intron結(jié)構(gòu)，并進一步預(yù)測編碼肌聯(lián)蛋白的mRNA組成，從而確定該蛋白的一級結(jié)構(gòu)，并檢測其結(jié)構(gòu)域；與同源蛋白進行序列比對，制作系統(tǒng)進化樹以了解其在系統(tǒng)進化中的位置。結(jié)果表明，該蛋白基因在基因組中橫跨200 kb的序列區(qū)域，預(yù)測編碼肌聯(lián)蛋白的mRNA大約由74 kb組成，推測相對分子質(zhì)量約為2 700 ku；該蛋白由Ig、Fn、kinase結(jié)構(gòu)域，PEVK結(jié)構(gòu)域和unique序列組成；在系統(tǒng)發(fā)育方面，該蛋白歸屬于原口動物集團。牡蠣肌聯(lián)蛋白是一種新型的肌聯(lián)蛋白樣蛋白。

生物信息學(xué)；基因組；肌聯(lián)蛋白；同源蛋白

肌聯(lián)蛋白是相對分子質(zhì)量約為300萬ku的巨大彈性蛋白質(zhì)［1］，由1個分子連接肌小節(jié)的Z線到M線［2-3］。肌聯(lián)蛋白的彈性與肌小節(jié)的結(jié)構(gòu)維持和被動張力有關(guān)［4］，該種彈性性質(zhì)與存在于肌小節(jié)I帶區(qū)域的免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）結(jié)構(gòu)域、PEVK 區(qū)域、unique 序列有關(guān)［2，5-7］。 在無脊椎動物橫紋肌中，從其一級結(jié)構(gòu)和抗體交叉反應(yīng)方面來看，存在很多類似肌聯(lián)蛋白的肌聯(lián)蛋白樣蛋白（connectin-like protein），如線蟲 TTN-1、小龍蝦凸出蛋白、昆蟲凸出蛋白等［8-12］。

在軟體動物平滑肌中，當(dāng)細(xì)肌絲和粗肌絲相互作用產(chǎn)生收縮后，存在一種叫做捕捉（catch）的結(jié)構(gòu)，它能利用少量能量維持長時間的張力。該種狀態(tài)與一種相對分子質(zhì)量為53萬ku的肌聯(lián)蛋白樣蛋白——顫搐蛋白（twitchin）有關(guān)。貽貝顫搐蛋白的一級結(jié)構(gòu)已被確定，它是由24個Ig結(jié)構(gòu)域和15個纖連蛋白 3 型（fibronectin type 3，F(xiàn)n3）結(jié)構(gòu)域組成，在C末端附近存在1個激酶結(jié)構(gòu)域；在肌小節(jié)中定位于粗肌絲，與肌球蛋白等粗肌絲組成蛋白相結(jié)合［13-14］。

到目前為止，軟體動物的肌聯(lián)蛋白樣蛋白，除了顫搐蛋白以外尚未有報道。關(guān)于軟體動物橫紋肌收縮及舒展時肌小節(jié)結(jié)構(gòu)維持的機制尚不明確。在對牡蠣平滑肌全蛋白提取液進行SDS-PAGE檢測時發(fā)現(xiàn)，在相對分子質(zhì)量為3 500 ku（肌聯(lián)蛋白）的位置出現(xiàn)條帶，該蛋白可能是存在于軟體動物中的新型肌聯(lián)蛋白樣蛋白，對軟體動物橫紋肌的結(jié)構(gòu)維持與被動張力的產(chǎn)生起到?jīng)Q定性作用。筆者通過生物信息學(xué)的方法預(yù)測牡蠣高分子肌聯(lián)蛋白的一級結(jié)構(gòu)并檢測其結(jié)構(gòu)域，同時利用激酶結(jié)構(gòu)域氨基酸序列制作系統(tǒng)發(fā)育樹，以了解其在系統(tǒng)發(fā)育中的地位。

1 材料與方法

1.1 SDS-PAGE 試驗 根據(jù) Laemmli［15］報道的方法進行SDS-PAGE試驗，使用無濃縮膠的2%～6%的梯度凝膠，凝膠染色使用考馬斯亮藍染色。

1.2 肌聯(lián)蛋白基因序列檢索 對牡蠣肌聯(lián)蛋白進行檢索時，使用人肌聯(lián)蛋白［7］的N末端2個Ig結(jié)構(gòu)域和C末端激酶結(jié)構(gòu)域氨基酸序列，在OysterBase （http://www.oysterdb.com/FrontHomeAction.do?method=home）主頁上公開的牡蠣基因組數(shù)據(jù)庫 oyster_genome_v1［16］中進行 TBLASTN 檢索，查找肌聯(lián)蛋白的類似序列。檢索得到牡蠣基因組序列片段「scaffold556」的堿基序列有較高同源性，將其用于詳細(xì)的檢索。

1.3 蛋白結(jié)構(gòu)域（domain）和肌聯(lián)蛋白基因exonintron結(jié)構(gòu)的預(yù)測 使用GENETYX version 4軟件將得到的基因組序列「scaffold556」的480 kb堿基序列打開，并將該序列翻譯成3行氨基酸序列。將得到的氨基酸序列保存為Microsoft Word文檔。然后，使用 SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）程序進行蛋白的結(jié)構(gòu)域預(yù)測［8］。按照結(jié)構(gòu)域序列間的內(nèi)含子以堿基gt開始、以堿基ag終止的原則對牡蠣肌聯(lián)蛋白基因的exon-intron結(jié)構(gòu)進行預(yù)測。將這些結(jié)構(gòu)域合并后，得到肌聯(lián)蛋白的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)［2］。

1.4 同源性分析 使用DDBJ（DNA Data Bank of Japan）在主頁上提供的CLUSTALW（http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html）程序及GENETYX軟件進行同源性分析［7，17］。

1.5 系統(tǒng)發(fā)育樹分析 使用不同物種的肌聯(lián)蛋白樣蛋白的激酶結(jié)構(gòu)域氨基酸序列，在由DDBJ（DNA Data Bank of Japan）主頁提供的CLUSTALW（http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html）程序中進行同源性分析，并得到系統(tǒng)進化樹文件。使用Tree view［18］軟件對進化樹進行分析，了解同源蛋白間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

圖1 牡蠣平滑肌全蛋白提取物的SDS-PAGE結(jié)果

2 結(jié)果與分析

2.1 SDS-PAGE試驗 利用2%～6%的梯度凝膠對牡蠣平滑肌全蛋白提取物進行電泳分離。結(jié)果表明，在相對分子質(zhì)量為3 500 ku左右的位置上出現(xiàn)了條帶（見圖1）。將相對分子質(zhì)量約為3 500 ku的蛋白視為牡蠣肌聯(lián)蛋白。

2.2 肌聯(lián)蛋白基因的exon-intron結(jié)構(gòu) 在基因組數(shù)據(jù)庫中進行BLAST和SMART檢索，得到的肌聯(lián)蛋白基因的exon-intron結(jié)構(gòu)見圖2。由圖2可知，肌聯(lián)蛋白基因在基因組數(shù)據(jù)庫中橫跨200 kb的序列區(qū)間。該基因所有外顯子長度之和約為74 kb，推測相對分子質(zhì)量約為2 700 ku。

2.3 肌聯(lián)蛋白的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu) 將得到的exon-intron結(jié)構(gòu)中的所有外顯子合并后，獲得了牡蠣肌聯(lián)蛋白的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)（見圖3）。由圖3可知，牡蠣肌聯(lián)蛋白由62個Ig結(jié)構(gòu)域、48個Fn結(jié)構(gòu)域、7個Spectrin結(jié)構(gòu)域、5個 PEVK結(jié)構(gòu)域和1個kinase結(jié)構(gòu)域組成。

圖2 牡蠣肌聯(lián)蛋白基因的exon-intron結(jié)構(gòu)

圖3 牡蠣肌聯(lián)蛋白的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)

表1 牡蠣肌聯(lián)蛋白激酶結(jié)構(gòu)域與脊椎動物和無脊椎動物肌聯(lián)蛋白激酶結(jié)構(gòu)域的同源性

圖4 各類動物肌聯(lián)蛋白樣蛋白激酶結(jié)構(gòu)域系統(tǒng)發(fā)育分析

2.4 同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析 所預(yù)測的結(jié)構(gòu)域中在C末端存在1個激酶結(jié)構(gòu)域，其氨基酸數(shù)目為255個，與其他肌聯(lián)蛋白樣蛋白的激酶結(jié)構(gòu)域氨基酸數(shù)目保持一致。在氨基酸水平上計算與不同物種激酶結(jié)構(gòu)域的同源性，結(jié)果表明，牡蠣肌聯(lián)蛋白激酶結(jié)構(gòu)域與脊椎動物肌聯(lián)蛋白激酶結(jié)構(gòu)域同源性約為40%，與無脊椎動物的同源性約為50%（見表1）。利用激酶結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列進行分組系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明，牡蠣肌聯(lián)蛋白歸屬于原口動物集團（見圖 4）。

3 討論

該研究中得到的編碼牡蠣肌聯(lián)蛋白的mRNA長度約為74 kb，推測相對分子質(zhì)量約為2 700 ku。牡蠣平滑肌SDS-PAGE結(jié)果表明，在相對分子質(zhì)量約為3 500 ku左右的位置出現(xiàn)了條帶，這與推測的相對分子質(zhì)量間存在差異，這可能與序列中存在的5個PEVK結(jié)構(gòu)域有關(guān)。此外，由于該研究只是通過基因組數(shù)據(jù)對其進行預(yù)測分析，因此，一些外顯子可能未被預(yù)測出來，需要今后進一步利用PCR試驗來驗證。

從該基因的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)來看，N末端存在連續(xù)的Ig結(jié)構(gòu)域和PEVK結(jié)構(gòu)域，C末端具有激酶結(jié)構(gòu)域，這一特點與脊椎動物肌聯(lián)蛋白的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)非常相似。但該結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)中C末端存在47個連續(xù)的Fn結(jié)構(gòu)域，這在以往已知的肌聯(lián)蛋白樣蛋白中從未發(fā)現(xiàn)。該蛋白結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)中不存在人肌聯(lián)蛋白所具有的由Ig和Fn組成的超級重復(fù)序列，另外，由Ig和PEVK結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的區(qū)域較長，占整體的一半以上。這些特點表明，牡蠣肌聯(lián)蛋白是一種與之前發(fā)現(xiàn)的肌聯(lián)蛋白樣蛋白的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)不同的新型肌聯(lián)蛋白樣蛋白。

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Prediction of Primary Structure of Oyster Connectin

BAO Yu-long，ZHANG San-run，XU Song-yao，ZHOU Hao-le
（Basic Medical College，Inner Mongolia Medical University，Hohhot 010110，China）

The aim of the present study was to predict the exon-intron structure of gene coding connectin in oyster and to determine its primary structure and domains.The exon-intron structure of gene coding connectin was deduced based on oyster genomic data by using bioinformatics method;the mRNA composition of coding regions for connectin in oyster was predicted;the primary structure of oyster connectin was determined and its domains were detected;phylogenetic tree was constructed by comparing amino acid sequences of homologous protein associated with connectin from different species.The results showed that the gene coding connectin in oyster genome covered 200 kb,the connectin-coding mRNA was about 74 kb,and the relative molecular weight of oyster connectin was deduced as 2 700 ku;oyster connectin was composed of Ig,Fn,and kinase domain,PEVK domain and unique sequences;the oyster connectin phylogenetically belonged to protostome group.Oyster connectin is a new type of connectin-like protein.

bioinformatics；genome；connectin；homologous protein

Q516

A文章順序編號1672-5190（2016）12-0005-04

2016－11－15

項目來源：內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金項目（2014MS08106）。

包玉龍（1976—），男，講師，博士，主要從事分子細(xì)胞生物學(xué)研究工作。

周好樂（1962—），女，教授，主要從事動物遺傳學(xué)研究工作。

（責(zé)任編輯：趙俊利）