楊春萍，劉麗芳*，楊濤，聶佳欣，高雙雙，胡文文

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長沙410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南長沙410007；3.湖南省第二人民醫(yī)院，湖南長沙410007）

柴芍乳癖顆粒對乳腺增生兔模型B超聲像及組織形態(tài)學(xué)的影響

楊春萍1，劉麗芳2*，楊濤1，聶佳欣1，高雙雙1，胡文文3

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長沙410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南長沙410007；3.湖南省第二人民醫(yī)院，湖南長沙410007）

目的觀察柴芍乳癖顆粒對乳腺增生病兔模型乳腺組織B超聲像及組織形態(tài)學(xué)的影響。方法56只健康未孕新西蘭雌兔，隨機挑出10只為正常對照組，肌注生理鹽水；46只為模型制備組，序貫肌注雌孕激素造模。2組均隨機處死1只雌兔，觀察病理切片確定造模成功后，將模型制備組剩下的45只兔再隨機分為5組：模型對照組、乳癖散結(jié)顆粒組、柴芍乳癖顆粒低、中、高劑量組。6組兔每天分別予以生理鹽水、乳癖散結(jié)顆粒（0.56 g/kg）、柴芍乳癖顆粒（0.47、0.94、1.88 g/kg）水溶液灌胃1次，連續(xù)3月。末次灌胃24 h后麻醉，用B超機采集第2對乳房的聲像圖，處死后取第2對乳腺組織，HE染色觀察組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，計數(shù)乳腺小葉腺泡數(shù)、導(dǎo)管上皮細(xì)胞層數(shù)、腺泡腔直徑。結(jié)果柴芍乳癖顆粒能使模型兔乳腺組織低回聲區(qū)縮小，內(nèi)部回聲強度減低，其中高劑量組最明顯；與模型組相比，柴芍乳癖顆粒低、中、高劑量跟乳癖散結(jié)顆粒均可明顯縮小腺泡腔直徑（P＜0.01），中、高劑量可以減少乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞層數(shù)，低劑量還可減少乳腺小葉腺泡數(shù)（P＜0.05）。結(jié)論柴芍乳癖顆?？梢愿纳迫橄僭錾媚Ｐ虰超聲像，減輕雌兔乳腺增生程度，治療乳腺增生效果明顯。

乳腺增生；柴芍乳癖顆粒；B超聲像；組織形態(tài)學(xué)；柴胡

〔Abstract〕Objective To observe the effect of Chaishao Rupi Granules on B type ultrasound images and histomorphology of rabbit models with breast hyperplasia.M ethods 10 rabbits were random ly selected from 56 healthy unfertilized female New Zealand rabbits as the normal control group，which were given muscle injection with normal saline，46 rabbits as model preparation group，which were taken female progestogen sequential muscle injection.Random ly killing female rats in the two groups，determine the model is successful or not by observing the pathological section.The remaining 45 rabbits in model preparation group were divided into 5 groups：model control group，Rupi Sanjie granule group，and low dose，middle dose，high dose of Chaishao Rupi granules groups.The six groups were administrated normal saline，0.56 g/kg Rupi Sanjie granules，and 0.47 g/kg，0.94 g/kg，1.88 g/kg Chaishao Rupi granules，respectively，once a day，continuous for 3 months.At 24 h after the last lavage，we implemented the anesthesia to all of the rabbits and collected the second pair of breasts'B ultrasound images. We cut the second pair of breast tissue out.The histomorphology after HE staining was observed.The numbers of lobular acini，duct epithelial layer and acinus cavity diameter were counted.Results Chaishao Rupi granules can shrink the rabbit model's breast tissue keyed acoustic area，decrease internal echo intensity，the effect of high dose group is the most obvious.Compared with model group，three doses of Chaihu Rupi granules and Rupi Sanjie granules can narrow the acinus cavity diameter significantly（P＜0.01）.The middle dose and high dose can reduce the mammary ductal epithelial cell layers（P＜0.05），low dose can also reduce lobular acini number（P＜0.05）.Conclusion Chaishao Rupi granules can improve B ultrasonicimage of mammary gland hyperplasia rabbit models，can reduce the degree of female rabbits'hyperplasia of mammary glands. The effect on hyperplasia of mammary glands is obvious.

〔Keywords〕hyperplasia of mammary glands；Chaishao Rupi granules；B type ultrasound images；histomorphology

乳腺增生病（hyperplasia of mammary glands，HMG）是乳腺組織的一種既非炎癥也非腫瘤性病變。據(jù)調(diào)查，70%～80%的女性都有不同程度的乳腺增生［1］。HMG是最常見的乳房疾?。?］，且有癌變可能。終末導(dǎo)管小葉單位→普通增生→非典型增生→原位癌→浸潤性癌→轉(zhuǎn)移癌是連續(xù)演變的，但在出現(xiàn)“原位癌”之前上述進(jìn)程是可逆的。積極治療乳腺增生，既能解除廣大患者的痛苦，又能避免發(fā)展為乳腺癌。

導(dǎo)師劉麗芳教授根據(jù)多年臨床經(jīng)驗創(chuàng)制出柴芍乳癖湯，已經(jīng)在臨床上采用中藥配方顆粒的形式運用多年。經(jīng)前期臨床觀察表明：柴芍乳癖湯能在一定程度上控制乳腺增生癥狀［3］。但目前尚無柴芍乳癖顆粒對乳腺組織產(chǎn)生影響的直觀證據(jù)。本次動物實驗通過創(chuàng)建兔HMG模型，觀察兔乳腺組織的B超聲像及組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，以期直觀驗證柴芍乳癖顆粒對HMG的療效。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1動物健康未孕雌性新西蘭白兔56只，體質(zhì)量1.7～2.5 kg，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供，使用許可證編號：SYXK（湘）2013-0005。

1.1.2藥物柴芍乳癖顆粒（簡稱CSRPKL）：柴胡、白芍、當(dāng)歸、青皮、郁金、瓜蔞皮、浙貝母、莪術(shù)、橘核、牡蠣、夏枯草、王不留行、白術(shù)、茯苓（一方中藥配方顆粒），由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房提供；乳癖散結(jié)顆粒（簡稱RPSJKL）：陜西白鹿制藥股份有限公司，4 g/袋，批號150503。

1.1.3主要試劑苯甲酸雌二醇注射液（寧波第二激素廠，批號140910）、黃體酮注射液（浙江仙琚制藥股份有限公司，批號140706）、0.9%氯化鈉注射液（湖南科倫制藥有限公司，批號G141201F）、8%硫化鈉水溶液、10%甲醛溶液、巴比妥鈉等分析純試劑。

1.1.4主要儀器尼康CI-1研究型正置熒光顯微鏡；Motic BA410研究型顯微鏡（加拿大麥克奧迪）；Motic 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（加拿大麥克奧迪）；M5邁瑞便攜式彩色B超機（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；萊卡RM2235輪轉(zhuǎn)石蠟切片機；金迪YD-A生物組織攤片機；DNP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒）。

1.2方法

1.2.1HMG模型兔的創(chuàng)建56只兔編號1-56，抓鬮法隨機挑出10只為正常對照組編號Z1-Z10、剩余46只為模型制備組，編號M1-M46，參考文獻(xiàn)［4］造模方法，正常對照組雙大腿內(nèi)外側(cè)肌肉豐厚處交替肌注生理鹽水，1次/d，連續(xù)30 d；模型制備組肌注（獸用）苯甲酸雌二醇0.5 mg/kg，1次/d，連續(xù)25 d，隨后肌注（人用）黃體酮1 mg/kg，隔天1次，共3次。末次肌注24 h后將兔腹部脫毛觀察乳房大體變化情況，兩組均隨機挑出1只兔處死，取第2對乳房做病理切片，顯微鏡下觀察乳腺組織形態(tài)，確認(rèn)造模成功。

1.2.2分組與給藥將造模后的45只雌兔，按體質(zhì)量由低到高編號1-45，用隨機數(shù)字表法隨機編入模型對照組、RPSJKL組和CSRPKL低、中、高劑量組5個組，加上正常對照組，共6個組，每組9只。采用灌胃給藥，1次/d，連續(xù)3月。按照徐叔云［5］《藥理實驗方法學(xué)》體表面積法換算，CSRPKL中劑量組和RPSJKL組換算為臨床日用量等效劑量，低、中、高劑量組按1∶2∶4的比例用藥。每只兔每日灌胃藥量分別為RPSJKL組0.56 g/kg、CSRPKL低劑量組0.47 g/kg、中劑量組0.94 g/kg、高劑量組1.88 g/kg。正常對照組、模型對照組兔灌同體積的生理鹽水。

1.2.3B超聲像采集及病理取材造模后及末次灌胃后24 h，用5%巴比妥鈉200 mg/kg腹腔注射麻醉，仰面固定在解剖臺上，先剪短腹部（鎖骨→腹股溝）被毛，再均勻涂抹8%硫化鈉水溶液，幾分鐘后待被毛變成黃色粘稠液態(tài)物質(zhì)，抹布蘸溫水擦凈，觀察乳房大體變化，標(biāo)號拍照。末次灌胃標(biāo)號拍照后，用便攜式彩超機采集第2對乳房的B超聲像圖，然后空氣栓塞致死，剪取第2對乳房。

1.2.4病理切片的制作與染色（1）固定：將離體組織標(biāo)本在10%甲醛溶液中浸泡24 h以上；（2）脫水、透明、石蠟包埋；（3）切片：蠟塊連續(xù)切片，厚約4μm；（4）HE染色：①二甲苯連續(xù)脫蠟2次，10 min/次；②梯度酒精復(fù)水，2～5 min/次；③蘇木素染色，5～10 min；④水洗時間隨機；⑤藍(lán)化時間隨機；⑥伊紅液染色，1～3 min；⑦梯度酒精脫水，2～5 min/次；⑧二甲苯兩步透明；（5）中性樹脂封片，標(biāo)號及標(biāo)示左右。

1.2.5組織形態(tài)學(xué)觀測用Motic BA410研究型顯微鏡在10×10倍光鏡下觀察經(jīng)HE染色后的病理切片，用Motic 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)采集圖像，每只兔觀測左、右二張切片，每張切片觀測4個視野，計數(shù)每個視野中乳腺小葉腺泡數(shù)、腺泡腔直徑和導(dǎo)管上皮細(xì)胞層數(shù)，取4個視野的平均值作為該切片的數(shù)值，取左、右二張切片的平均值作為該只兔的最終值。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1造模后乳房大體變化

末次肌注激素24 h后將兔腹部脫毛，觀察見：兩組雌兔各乳頭均充血增大，其中第2對最明顯（正常對照組見圖1A，模型制備組見圖1B）。

圖1　兔腹部4對乳房大體照片

2.2HMG兔模型的評價

顯微鏡下觀察處死的正常對照組和模型制備組雌兔的乳腺組織病理切片，可見正常乳腺組織（圖2A）小葉腺胞數(shù)較少，導(dǎo)管上皮細(xì)胞排列整齊，導(dǎo)管腔基本無擴張。模型制備組（圖2B）乳腺小葉腺泡數(shù)增加，導(dǎo)管上皮細(xì)胞層數(shù)增加、結(jié)構(gòu)紊亂，腺泡腔明顯擴張，腔內(nèi)可見脫落的上皮細(xì)胞及分泌物，參考文獻(xiàn)［6］標(biāo)準(zhǔn)，可以判定造模成功。

2.3干預(yù)后乳房B超聲像表現(xiàn)

正常對照組（圖3A）乳腺腺體層不增厚，模型對照組（圖3B）乳腺腺體增厚，回聲強弱不一，內(nèi)部光點增粗，回聲區(qū)形狀近似介于橢圓形和梭形之間，藥物干預(yù)后，RPSJKL組（圖3C）和CSRPKL低劑量組（圖3D）乳腺組織稍厚，低回聲區(qū)呈長條形，其中RPSJKL組的面積小于低劑量組；中劑量組（圖3E）乳腺組織類似半橢圓形，中央回聲稍高；高劑量組（圖3F）乳腺組織低回聲區(qū)比RPSJKL組和低劑量組窄、厚，邊界較模糊，形態(tài)略不規(guī)整。

圖2　兔第2對乳腺組織病理切片光鏡圖（HE×100）

圖3　兔乳房B超聲圖像

2.4干預(yù)后兔乳腺組織病理形態(tài)學(xué)情況

由于實驗正值梅雨季及酷夏，動物飼養(yǎng)環(huán)境一般，加之實驗人員操作不熟練、動物不配合等原因，灌胃3月后僅剩44只雌兔。其中，模型對照組1只兔因奮力反抗肌注、灌胃等操作而雙下肢癱瘓，1只被野鼠咬傷感染而亡；CSRPKL低劑量組因藥液灌至肺內(nèi)死亡2只，腹瀉死亡1只；中劑量組死亡2只，高劑量組死亡3只，解剖見肺內(nèi)有藥液殘留、胸腔大量炎性積液。6組雌兔第2對乳腺組織病理切片詳見圖4。

圖4　兔乳腺組織病理切片光鏡圖（HE×100）

與正常對照組相比，模型對照組乳腺小葉腺泡數(shù)、導(dǎo)管上皮細(xì)胞層數(shù)增多（P＜0.05），腺泡腔直徑顯著擴張（P＜0.01），造模效果好。干預(yù)后，與模型組相比，CSRPKL低劑量組乳腺小葉腺泡數(shù)減少（P＜0.05），CSRPKL中、高劑量組導(dǎo)管上皮細(xì)胞層數(shù)減少（P＜0.05），RPSJKL組及CSRPKL低、中、高劑量組腺泡腔直徑均明顯縮?。≒＜0.01）。結(jié)果見表1。

表1　各組乳腺小葉腺泡數(shù)、導(dǎo)管上皮細(xì)胞層數(shù)、腺泡腔直徑比較（±s）

表1　各組乳腺小葉腺泡數(shù)、導(dǎo)管上皮細(xì)胞層數(shù)、腺泡腔直徑比較（±s）

注：與正常對照組相比，●P＜0.05，●●P＜0.01；與模型對照組相比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

組別n正常對照組模型對照組RPSJKL對照組CSRPKL低劑量組CSRPKL中劑量組CSRPKL高劑量組9 7 9 6 7 6乳腺小葉腺泡數(shù)（個）4.58±3.65 10.42±4.27●6.90±2.50 4.75±2.26▲6.92±3.37 5.83±2.76導(dǎo)管上皮細(xì)胞層數(shù)（層）1.07±0.65 2.25±0.45●1.83±0.39 1.65±0.45 1.43±0.49▲1.43±0.49▲腺泡腔直徑（μm）56.73±12.80 108.85±24.88●●79.04±23.04▲▲73.81±19.78▲▲67.48±13.50▲▲73.07±16.74▲▲

3　分析與討論

HMG主要病因為內(nèi)分泌失調(diào)，屬慢性疾病。目前，診斷HMG的首選檢查方法是B超［7］，無創(chuàng)、可反復(fù)使用；確診HMG的方法是病理檢查，但有創(chuàng)，患者不易接受。常用治療HMG的西藥有激素類、維生素類、碘制劑、利尿消腫藥和止痛劑。激素類藥物會加重機體內(nèi)分泌失調(diào)，停藥后乳房疼痛加重，出現(xiàn)子宮內(nèi)膜增厚甚至癌變、月經(jīng)不調(diào)等副反應(yīng)；碘制劑有導(dǎo)致甲狀腺功能障礙的風(fēng)險；維生素類沒有直接抗增生作用，療效不確切；利尿消腫藥和止痛劑也是“治標(biāo)不治本”。而據(jù)統(tǒng)計，中醫(yī)藥治療HMG的平均有效率為（93.50±6.45）%［8］，能有效控制HMG的臨床癥狀，副反應(yīng)也較少。因此，對臨床療效顯著的柴芍乳癖顆粒開展相關(guān)研究具有較高價值和重要意義。

HMG以乳房疼痛和腫塊為主要臨床表現(xiàn)，屬中醫(yī)學(xué)“乳癖”范疇，由郁怒傷肝、思慮傷脾、氣滯血瘀、痰凝成核，氣、血、痰三者夾雜同時致病［9］。柴芍乳癖顆粒由14味中藥組成，針對乳癖的病因病機，方中君藥柴胡疏肝解郁，白芍養(yǎng)血斂陰、柔肝止痛；臣藥青皮疏肝破氣、消積化滯，郁金活血止痛、行氣解郁，白術(shù)和茯苓益氣健脾、利水滲濕，當(dāng)歸活血補血，佐藥瓜蔞皮、浙貝母和橘核清熱化痰、理氣寬胸、散結(jié)止痛，使藥川楝子行氣止痛，王不留行活血通經(jīng)，莪術(shù)破血行氣、消積止痛，丹參活血祛瘀止痛，牡蠣軟堅散結(jié)，夏枯草清肝瀉火、散結(jié)消腫。諸藥合用，共奏疏肝理氣、健脾益氣、除濕化痰、活血化瘀、散結(jié)止痛之功。

本研究通過創(chuàng)建模擬人類HMG的兔模型，進(jìn)行長期藥物干預(yù)實驗，既能減輕患者的痛苦，又能減少患者依從性不高對實驗結(jié)果的影響。通過研究發(fā)現(xiàn)：在B超聲像方面，柴芍乳癖顆粒能縮小增生乳腺組織回聲區(qū)范圍，降低乳腺組織內(nèi)部回聲強度。在乳腺組織病理形態(tài)學(xué)方面，柴芍乳癖顆粒減輕增生的作用是值得肯定的，低劑量組能減少乳腺小葉腺泡數(shù)，中、高劑量組可以減少導(dǎo)管上皮細(xì)胞層數(shù)，低、中、高劑量組均能明顯縮小腺泡腔直徑。但與正常對照組相比，各用藥組均未恢復(fù)至乳腺無增生狀態(tài)，可能與中藥起效慢有關(guān)。另外，從乳房大體照片上可以看出：實驗中正常對照組雌兔乳頭亦充血增大，可能與兔齡增長自然發(fā)育有關(guān)，屬正常生理現(xiàn)象，病理切片顯示兔乳頭充血增大與乳腺組織增生無必然聯(lián)系。

目前，中醫(yī)藥治療HMG的動物實驗多采用小鼠、大鼠造模，采用兔的很少，而且已查閱到的文獻(xiàn)內(nèi)建立HMG動物模型的部分激素已經(jīng)停產(chǎn)。因此，本實驗參考前人研究成果，創(chuàng)新性采用獸用激素注射液進(jìn)行造模，并在激素使用劑量和次數(shù)上進(jìn)行探索。實驗發(fā)現(xiàn)：肌注（獸用）苯甲酸雌二醇注射液0.5 mg/kg，1次/d，連續(xù)25 d，隨后肌注（人用）黃體酮注射液1 mg/kg，隔天1次，共3次，可創(chuàng)建出HMG兔模型。病理觀測造模效果好，希望對后續(xù)研究者起到一定的參考作用。本文的造模方法前期僅進(jìn)行過1次預(yù)實驗，模型的重復(fù)性和穩(wěn)定性有待后續(xù)研究者進(jìn)一步實驗后評判。

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（本文編輯楊瑛）

Effects of Chaishao Rupi Granules on B Type Ultrasound Images and Histomorphology of Rabbit M odels w ith Breast Hyperp lasia

YANG Chunping1，LIU Lifang2*，YANG Tao1，NIE Jiaxin1，GAO Shuangshuang1，HU Wenwen3
（1.Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410208，China；2.The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410007，China；3.Hunan Second People's Hospital，Changsha，Hunan 410007，China）

R285.5

A

doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2016.09.007

2015-12-06

楊春萍，女，碩士，研究方向：中醫(yī)外治法。

〔通迅作者〕*劉麗芳，女，教授，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：liulff@126.com。