陳潔　溫正旺　陳曉晴　金龍騰　陳益平　李昌崇

TLR3-NEMO-NFkβ信號通路對手足口病腦炎的診療價值

陳潔溫正旺陳曉晴金龍騰陳益平★李昌崇

目的 探討干擾素TLR3-NEMO-NFkβ信號通路在EV71手足口病腦炎重癥重型中的診療價值。方法 選取2014年1月至2015年1月通過腦脊液檢查及臨床診斷的兒童144例分成普通手足口病兒童2d 組（A組）、普通手足口病兒童5d組（B組）、手足口病腦炎重癥重型2d組（C組）、手足口病腦炎重癥重型5d組（D組），每組各36例。另選擇同期健康體檢兒童36例為對照組。用ELISA法檢測各組血液中TLR3、NEMO、NFkβ蛋白及干擾素的表達(dá)水平。結(jié)果 觀察組干擾素的表達(dá)水平明顯高于對照組（P＜0.01），A組、C組和D組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），B組明顯高于A組、C組和D組（P＜0.01）。觀察組TLR3、NEMO、NFkβ蛋白的表達(dá)水平明顯高于對照組（P＜0.01），A組、C組和D組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），B組明顯高于A組、C組和D組（P＜0.01）。結(jié)論 手足口病腦炎患兒干擾素及TLR3、NEMO、NFkβ蛋白的表達(dá)水平會較正常兒童明顯升高，但相較于普通手足口病患兒會較低，提示TLR3-NEMO-NFkβ信號通路對手足口病腦炎具有一定的診斷意義。

EV71 手足口病 腦炎 干擾素

手足口?。╤and，food and mouth disease）是一種嚴(yán)重的傳染性疾病，多發(fā)于學(xué)齡前兒童，自2007年來，世界各國手足口病重癥病例及手足口病腦炎的報道出現(xiàn)明顯上升，甚至出現(xiàn)死亡病例，國內(nèi)手足口病腦炎的診斷及治療也面臨著重要的考驗［1-2］，本課題將干擾素的應(yīng)答機(jī)制作為切入點，通過檢測手足口病患兒2d、5d組和手足口病腦炎患兒2d、5d組以及正常體檢兒童對照組血中TLR3、NEMO、NFkβ信號通路蛋白、基因及干擾素的表達(dá)水平，從分子生物學(xué)機(jī)制上研究干擾素的應(yīng)答信號通路對EV71手足口病腦炎的影響，為臨床中手足口病腦炎的及時診療及研究提供一個新的靶點。

1　臨床資料

1.1一般資料 選擇2014年1月至2015年1月本院手足口病患兒144例為觀察組，其中男72例，女72例，年齡6個月至3歲。均經(jīng)腦脊液、糞便EV71抗原檢查及臨床表現(xiàn)確診，重癥重型多表現(xiàn)為持續(xù)發(fā)熱＞3d，偶有肢體抖動，睡覺時有驚跳，精神軟，排除合并其它疾病。依據(jù)病情及時間分成4組，普通手足口病患兒2d組（A組）、5d組（B組）；手足口病腦炎重癥重型患兒2d組（C組）、5d組（D組），每組各36例。另選擇同期健康體檢兒童36例為對照組，男18例，女18例，年齡6個月至3歲。各組一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2方法 采用Elisa法檢測各組中TLR3、NEMO、NFkβ及干擾素的蛋白表達(dá)（試劑盒由博士得公司提供），在每日清晨抽取各組的外周靜脈血1.5 ml，共5組，加入 24孔培養(yǎng)板中，加入血40μl/孔，第1 孔加入生理鹽水作為基礎(chǔ)對照，第2、3、4、5、6 孔作陽性對照，加入植物血凝素（PHA）100μl，后5孔者分別用生理鹽水稀釋成 50g/ml，加入總量均為200μl，加入抗原后輕柔搖動20s，37 ℃水浴中孵育16～20h，抽取血漿上清液適量，于-20℃冰箱冷凍備用，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對應(yīng)的光密度（OD）值計算標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計算出對應(yīng)的樣品濃度。干擾素的釋放水平檢測嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件。正態(tài)計量資料以（x±s）表示，正態(tài)分布資料采用one-way ANOVA方差分析，組間比較方差齊采用LSD檢驗，方差不齊則采用Tamhane's T2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組干擾素的表達(dá)水平比較 觀察組干擾素的表達(dá)水平明顯高于對照組（P＜0.01），A組、C組和D組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），B組明顯高于A組、C組和D組（P＜0.01）。。

2.2各組TLR3、NEMO、NFkβ蛋白的表達(dá)水平比較 觀察組TLR3、NEMO、NFkβ蛋白的表達(dá)水平明顯高于對照組（P＜0.01），A組、C組和D組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），B組明顯高于A組、C組和D組（P＜0.01）。見表1。

表1　各組TLR3、NEMO、NFkβ蛋白的表達(dá)水平比較［μg/ml，（x±s）］

2.3預(yù)后 本實驗中涉及的重癥重型病例手足口病腦炎患兒經(jīng)過積極治療后，病情基本穩(wěn)定，在住院12～14d后治愈出院，未出現(xiàn)轉(zhuǎn)為危重型的病例。

3　討論

目前EV71病毒的檢測及EV71病毒感染的治療存在滯后性及缺乏針對性，EV71病毒感染所致手足口病腦炎可導(dǎo)致腦干腦炎以及嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)損傷。EV71手足口病腦炎的研究，一直是世界各國研究的難點和熱點，我國一直有對手足口病腦炎患者進(jìn)行糞便采集及EV71檢測，但對于EV71如何導(dǎo)致手足口病腦炎的分子機(jī)制仍研究甚少，目前研究發(fā)現(xiàn)干擾素可以影響EV71手足口病腦炎的進(jìn)展及預(yù)后，但起效機(jī)制尚未明確，本課題將干擾素的產(chǎn)生機(jī)制作為切入點，從分子生物學(xué)機(jī)制上研究干擾素的產(chǎn)生信號通路對EV71手足口病腦炎的影響，為手足口病腦炎的及時診療及研究提供一個新的靶點。

EV71病毒屬于小RNA病毒科、腸道病毒屬病毒，為單股正鏈RNA病毒［3］。自1974年首次報道從美國加州神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者標(biāo)本中分離得到EV71以來，EV71病毒曾在世界范圍內(nèi)多次引起暴發(fā)疫情，主要引起嬰幼兒手足口病和無菌性腦膜炎、腦炎等多種嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，以及心肌炎、肺水腫等。有研究提示用EV71病毒感染神經(jīng)細(xì)胞可以導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的損傷，說明EV71攻擊性較強(qiáng)，在新生小鼠體內(nèi)如何導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，其病理生理機(jī)制尚未明確，但提示這些損傷均需依賴于一些未知的內(nèi)部因子［4］。

干擾素是一類高活性多功能的糖蛋白，能誘導(dǎo)細(xì)胞對病毒感染產(chǎn)生抗性，其通過干擾病毒基因轉(zhuǎn)錄或病毒蛋白組分的翻譯，從而阻止或限制病毒感染，是目前最主要的抗病毒感染和抗腫瘤生物制品［5］。其抗病毒活性不是殺滅而是抑制病毒，作為廣譜病毒抑制劑，對RNA和DNA病毒均有抑制作用，當(dāng)病毒感染恢復(fù)期可見干擾素的存在。IFN-Ⅰ中α、β和IFN-Ⅱ具有較強(qiáng)的抗病毒、抗腫瘤活性并且在病毒感染引起的免疫應(yīng)答中起重要的調(diào)節(jié)作用，長期作為有效的抗病毒與抗腫瘤藥物應(yīng)用于臨床［6］。對其抗病毒、抗腫瘤機(jī)制的研究，一直是病毒學(xué)研究的熱點。在臨床治療中使用干擾素制劑可以對EV71手足口病腦炎的癥狀起到控制作用［7］。

干擾素存在應(yīng)答及產(chǎn)生信號通路，主要通過產(chǎn)生信號通路發(fā)揮作用。在干擾素產(chǎn)生信號通路的上游，存在一種TLR3 受體，其是toll 樣受體中的一員，是一種重要的模式識別受體，在天然免疫中發(fā)揮著核心作用，在誘導(dǎo)獲得免疫中也具有重要作用，與病毒感染密切相關(guān)；在抗病毒及自身免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用［8］。TLR3是病毒dsRNA識別受體，由于dsRNA是病毒復(fù)制過程中普遍存在的產(chǎn)物，因此 TLR3在宿主抗病毒天然免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［9］。TLR3是干擾素產(chǎn)生信號通路上的一個重要應(yīng)激因子，多數(shù)病毒感染均涉及TLR3的表達(dá)，包括EV71病毒，其在多種細(xì)胞中廣泛表達(dá)［10］；尤其在神經(jīng)突觸細(xì)胞中表達(dá)最為豐富，主要功能是識別病毒感染并誘導(dǎo)干擾素的產(chǎn)生，作為干擾素產(chǎn)生信號通路的上游因子，TLR3可以影響下游信號因子的表達(dá)。

TLR3可以通過兩種途徑產(chǎn)生干擾素，介導(dǎo)病毒感染對機(jī)體的影響。其中與NEMO基因相關(guān)，涉及DsDNA的途徑最為重要。在皰疹病毒導(dǎo)致的腦炎研究中發(fā)現(xiàn)，TLR3-UNC-93B信號通路表達(dá)的減弱會誘導(dǎo)乃至加重單純皰疹病毒腦炎［11］。UNC-93B與NEMO之間存在緊密聯(lián)系，NEMO是一種重要的細(xì)胞因子，可以調(diào)控 TLR3的活性；TLR3通過NF-Kb介導(dǎo)了單純皰疹病毒腦炎中的免疫反應(yīng)，NEMO與IKK（inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase，IKβ激酶）結(jié)合后參與并誘發(fā)了這個發(fā)生過程，在研究中TLR3蛋白表達(dá)下降，對UNC-98B、NF-Kb的激活產(chǎn)生了抑制作用，最終導(dǎo)致干擾素表達(dá)水平下降［12］。本研究結(jié)果提示在EV71手足口病及并發(fā)腦炎的患兒中TLR3-UNC-93B通路的表達(dá)水平明顯升高，存在時間依賴性，但在手足口病腦炎患兒中，該通路的表達(dá)水平并未隨著發(fā)病時間的延長而升高，提示EV71病毒感染對該通路具有抑制作用，與先前的研究保持一致，提示TLR3-UNC-93B通路參與EV71手足口病腦炎的發(fā)生發(fā)展過程。

綜上所述，作者推測干擾素“TLR3-UNC-93B”信號通路可能在EV71中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中發(fā)揮重要作用且具有一定的診療意義。但本課題由于時間及客觀因素并未收集到危重型手足口病腦炎病例，不能對該通路與與危重型腦炎病例病情的發(fā)生發(fā)展進(jìn)行相關(guān)性分析，再者，不能設(shè)置通路抑制劑組進(jìn)行比較，無法全面了解該信號通路在手足口病腦炎中的作用，有待通過動物實驗來進(jìn)一步驗證。

［1］Hu XM，Zhang Y，Xu BL，et al.Development of a GeXP based multiplex RT-PCR assay for simultaneous differentiation of nine human hand food mouth disease pathogens.Bing Du Xue Bao，2011， 27（4）：331-336.

［2］Li J，Qu M，Jia L，et al.Etiological detection of severe hand-foodmouth disease and related genetic characteristics of enterovirus type 71 infection in Beijing，2010.Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi，2012，33（9）：926-929.

［3］Lui YL，Tan TL，Woo WH，et al.Enterovirus71 （EV71） utilise host microRNAs to mediate host immune system enhancing survival during infection.PLoS One，2014，9（7）：e102997.

［4］Liu WL，Yang GL，Wei Q，et al.The genetical evolution of the full length genes of 5 EV 71 strains from 5 Shenzhen patients with handfood-mouth disease associated with EV71 infection.Zhonghua Shi Yan He Lin Chuang Bing Du Xue Za Zhi，2011，25（1）：53-56.

［5］Huang TS，Shyu YC，Chen HY，et al.A systematic review and metaanalysis of adjuvant interferon therapy after curative treatment for patients with viral hepatitis-related hepatocellular carcinoma.J Viral Hepat，2013，20（10）：729-743.

［6］Zhuang LP，Zeng XT，Meng ZQ.A systematic review and metaanalysis of randomized controlled trails：adjuvant interferon therapy for hepatocellular carcinoma. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi，2012， 20（5）：363-367.

［7］陳聰，余春梅，王曉宇.重組人干擾素α1b霧化治療121例手足口病療效分析.檢驗醫(yī)學(xué)與臨床，2014，11（9）：1233-1234.

［8］Lei X，Sun Z，Liu X，et al.Cleavage of the adaptor protein TRIF by enterovirus 71 3C inhibits antiviral responses mediated by Toll-like receptor 3.J Virol，2011，85（17）：8811-8818.

［9］Guo F，Mead J，Aliya N，et al.RO 90-7501 enhances TLR3 and RLR agonist induced antiviral response.PLoS One，2012，7（10）：e42583.

［10］Pang L，Gong X，Liu N，et al.A polymorphism in melanoma differentiation-associated gene 5 may be a risk factor for enterovirus 71 infection.Clin Microbiol Infect，2014，20（10）：O711-O717.

［11］Gonzalez-Granado LI.Is it time to study TLR3 or UNC-93B pathway deficiencies in reactivated herpes simplex encephalitis. Pediatr Infect Dis J，2011，30（1）：90.

［12］Audry M，Ciancanelli M，Yang K，et al.NEMO is a key component of NF-kappaB-and IRF-3-dependent TLR3-mediated immunity to herpes simplex virus.J Allergy Clin Immunol， 2011，128（3）：610-617.

Objective To investigate the role of TLR3-NEMO-NFkβ signal pathway in EV71-induced encephalitis of hand foot and mouth disease. Methods The study was conducted at second Affi liated Hospital and Yuying Children Hospital of Wenzhou Medical College from January 2014 to January 2015，based on blood examination，CSF routine test and clinical manifestation. There were 180 members and divided into fi ve groups，each group includes 36. 2day control group，2day hand-food-mouth（A），5day hand-food-mouth（B），2day hand-food-mouth and encephalitis（C），5day hand-food-mouth and encephalitis（D）. Elisa and western blot were used to detect the expressions of certain signal pathway related proteins in blood. Results Elisa assay： the levels of interferon，TLR3，NEMO，NFkβ protein expression in the groups of patients were signifi cantly increased than that of the corresponding control groups（P＜0.01），especially the B group，there was no signifi cant difference found between C group and A group，it was the same between C and D group. Conclusions The levels of the levels of interferon，TLR3，NEMO，NFkβprotein expression in the groups of hand food mouth disease and encephalitis were signifi cant increased，but less expression than that groups of general hand food mouth disease，these suggest that TLR3-NEMO-NFkβ signal pathway has a great role in the diagnosis of hand food mouth disease and encephalitis.

EV71 Hand-food-mouth disease Encephalitis Interferon

浙江省溫州市科技計劃項目（Y20150375）

325000 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院