范寧娟, 湯江江

(1. 西北農(nóng)林科技大學 a. 生命科學學院； b. 理學院，陜西 楊凌　712100)

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4-酰氧基黃體酮衍生物的合成及其細胞毒性

范寧娟1a, 湯江江1b*

(1. 西北農(nóng)林科技大學 a. 生命科學學院； b. 理學院，陜西 楊凌712100)

以黃體酮為前體，經(jīng)4,5-環(huán)氧黃體酮合成了4-羥基黃體酮(2); 2與酰氯經(jīng)?；磻?yīng)合成了一系列新型4-酰氧基黃體酮衍生物(4a～4i)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR，13C NMR和MS(ESI)表征。體外細胞毒性實驗結(jié)果表明：在用藥量為50 μg·mL-1時， 4c， 4d和4e對MCF-7細胞的抑制率分別為26%， 22%和13%。

甾體; 黃體酮; 酰氧基; 細胞毒性; 合成

甾體類衍生物是有機合成中活性比較廣泛的化合物，通常具有親脂性，對細胞膜和某些甾體受體有較強的親和力，受到了研究人員的廣泛關(guān)注[1-2]。黃體酮是一種比較廉價的孕甾烷和常用的激素類藥物，黃體酮衍生物通常具有廣泛的生物活性[3-6]。有專利指出，4-羥基黃體酮的酯類具有治療功能性子宮出血的功效[7-8]，但未提供此類衍生物詳細的波譜數(shù)據(jù)，更未見其具體的藥理學研究結(jié)果。

近年來本課題組以黃體酮為底物，設(shè)計并合成了多個系列的黃體酮類衍生物[9-12]。作為合成工作的延續(xù)，本文以黃體酮為前體，經(jīng)4,5-環(huán)氧黃體酮(1)合成了4-羥基黃體酮(2)； 2與取代酰氯(3a～3i)經(jīng)?；磻?yīng)合成了系列新型4-酰氧基黃體酮衍生物(4a～4i， Scheme 1)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR，13C NMR和MS(ESI)表征。考察了4的體外細胞毒性。

Scheme 1

1　實驗部分

1.1儀器與試劑

XT-4型雙目顯微熔點儀(溫度未校正)；Bruker Advance III 500型核磁共振儀(CDCl3為溶劑，TMS為內(nèi)標)；LTQ Fleet 型ESI源質(zhì)譜儀。1按文獻[7]方法合成；4-氯黃體酮(5) 按文獻[9]方法合成;其余所用試劑均為分析純。

1.2合成

(1) 2的合成

將1 2.57 g(7.8 mmol)溶于冰醋酸50 mL中，稍微加熱使其溶解。于室溫加入濃硫酸2.5 mL，攪拌3 min(黃色變成紅色)，于室溫反應(yīng)24 h(期間伴隨偶爾的震蕩)。將反應(yīng)液倒入冰水1 L中(析出白色固體)，抽濾，濾餅用水反復洗滌至無刺激氣味，加入二氯甲烷150 mL，依次用飽和氯化鈉溶液(40 mL)洗滌，無水硫酸鈉干燥，減壓除溶，殘余物用甲醇重結(jié)晶得白色固體2 1.59 g,收率62%， m.p.225～227 ℃(m.p. 230～232 ℃[8])；1H NMRδ： 0.67(s, 3H, 18-H), 0.96～1.06(m, 2H), 1.18(s, 3H, 19-H), 1.25～2.08(m, 13H), 2.12(s, 3H, 21-H), 2.17～2.10(m, 1H), 2.49～2.55(m, 3H), 2.99～3.02(m, 1H), 6.09(s, 1H, 4-OH);13C NMRδ： 13.34, 17.13, 20.96, 22.88, 22.93, 24.41, 30.92, 31.50, 31.76, 34.69, 35.16, 37.77, 38.73, 43.92, 54.09, 56.16, 63.58, 139.68, 141.22, 193.51, 209.36； MS(ESI)m/z: 331{[M+H]+}。

(2) 4a～4i的合成通法

將2 33 mg(0.1 mmol)溶于干燥的吡啶中(1.5 mL)，冰浴冷卻下加入3a～3i 0.14 mmol，于室溫反應(yīng)至終點(TLC檢測)。減壓濃縮得油狀粗產(chǎn)物，經(jīng)GF254薄層層析[展開劑：(石油醚/丙酮=3/1，V/V)]純化得4a～4i。

4-(苯甲酰氧基)-孕甾-4-烯-3,20-二酮(4a)：白色固體38 mg, 收率88%， m.p.138～140 ℃；1H NMRδ: 0.68(s, 3H, 18-H), 1.02～1.28(m, 5H), 1.30(s, 3H, 19-H), 1.46～2.10(m, 11H), 2.13(s, 3H, 21-H), 2.17～2.19(m, 1H), 2.53～2.56(m, 2H), 2.75～2.78(m, 1H), 7.47(m, 2H, ArH), 7.60(m, 1H, ArH), 8.12(d,J=7.5 Hz, 2H, ArH)；13C NMRδ: 13.35, 17.74, 21.02, 21.02, 22.87, 24.18, 24.33, 30.92, 31.50, 33.49, 35.12, 38.66, 39.22, 43.91, 53.68, 55.96, 63.48, 126.29, 128.49, 129.08, 130.23, 133.49, 139.31, 164.43, 190.62, 209.26； MS(ESI)m/z: 435 {[M+H]+}。

4-(2′-氯苯甲酰氧基)-孕甾-4-烯-3,20-二酮(4b)： 白色固體38 mg, 收率81%， m.p.205～207 ℃；1H NMRδ: 0.68(s, 3H, 18-H), 1.02～1.28(m, 5H), 1.30(s, 3H, 19-H), 1.46～2.10(m, 11H), 2.13(s, 3H, 21-H), 2.17～2.19(m, 1H), 2.53～2.56(m, 2H), 2.82～2.85(m, 1H), 7.35(m, 1H, ArH), 7.48(m, 2H, ArH), 8.07(dd,J=1.0 Hz, 8.5 Hz, 1H, ArH)；13C NMRδ: 13.36, 17.73, 21.02, 21.02, 22.87, 24.34, 24.34, 30.87, 31.52, 33.45, 35.11, 38.65, 39.29, 43.92, 53.67, 55.93, 63.48, 126.70, 128.93, 131.14, 132.24, 133.08, 134.27, 139.14, 156.30, 163.17, 190.30, 209.35； MS(ESI)m/z: 469{[M+H]+}。

4-(2′,4′-二氯苯甲酰氧基)-孕甾-4-烯-3,20-二酮(4c)： 白色固體44 mg, 收率88%， m.p.183～185 ℃;1H NMRδ： 0.68(s, 3H, 18-H), 1.02～1.28(m, 5H), 1.30(s, 3H, 19-H), 1.46～2.10(m, 11H), 2.13(s, 3H, 21-H), 2.17～2.20(m, 1H), 2.53～2.56(m, 2H), 2.77～2.80(m, 1H), 7.34(dd,J=2.0 Hz, 8.5 Hz, 1H, ArH), 7.51(d,J=2.0 Hz, 1H, ArH), 8.03(d,J=8.5 Hz, 1H, ArH)；13C NMRδ：13.35, 17.73, 21.01, 21.01, 22.87, 24.33, 24.33, 30.87, 31.52, 33.40, 35.09, 38.63, 39.30, 43.90, 53.65, 55.91, 63.46, 127.14, 127.19, 131.08, 133.29, 135.48, 138.93, 139.07, 156.39, 162.32, 190.17, 209.28; MS(ESI)m/z: 503{[M+H]+}。

4-(3′,5′-二氯苯甲酰氧基)-孕甾-4-烯-3,20-二酮(4d)： 白色固體43 mg, 收率86%， m.p.145～146 ℃；1H NMRδ: 0.68(s, 3H, 18-H), 1.02～1.28(m, 5H), 1.30(s, 3H, 19-H), 1.46～2.10(m, 11H), 2.13(s, 3H, 21-H), 2.18～2.20(m, 1H), 2.53～2.56(m, 2H), 2.70～2.73(m, 1H), 7.58(t,J=2.0 Hz, 1H, ArH), 7.98(d,J=2.0 Hz, 2H, ArH)；13C NMRδ: 13.35, 17.75, 21.02, 21.02, 22.87, 24.33, 24.33, 30.90, 31.52, 33.38, 35.08, 38.62, 39.30, 43.90, 53.65, 55.91, 63.46, 128.60, 131.90, 133.31, 135.43, 139.13, 156.44, 162.16, 190.02, 209.28； MS(ESI)m/z: 503{ [M+H]+}。

4-(2′-溴苯甲酰氧基)-孕甾-4-烯-3,20-二酮(4e)： 白色固體41 mg, 收率80 %， m.p. 214～216 ℃；1H NMRδ: 0.68(s, 3H, 18-H), 1.02～1.28(m, 5H), 1.30(s, 3H, 19-H), 1.46～2.10(m, 11H), 2.13(s, 3H, 21-H), 2.18～2.20(m, 1H), 2.53～2.56(m, 2H), 2.83～2.86(m, 1H), 7.40(m, 2H, ArH), 7.69(dd,J=0.5 Hz, 8.5 Hz, 1H, ArH), 8.06(dd,J=1.5 Hz, 7.5 Hz, 1H, ArH)；13C NMRδ: 13.36, 17.73, 21.01, 21.01, 22.87, 24.34, 24.34, 30.87, 31.52, 33.44, 35.11, 38.65, 39.30, 43.91, 53.67, 55.92, 63.48, 122.18, 127.28, 130.99, 132.20, 133.06, 134.41, 139.11, 156.34, 163.66, 190.27, 209.31； MS(ESI)m/z: 513{ [M+H]+}。

4-(4′-溴苯甲酰氧基)-孕甾-4-烯-3,20-二酮(4f)： 白色固體43mg, 收率84%， m.p.179～181 ℃；1H NMRδ: 0.68(s, 3H, 18-H), 1.02～1.28(m, 5H), 1.30(s, 3H, 19-H), 1.46～2.10(m, 11H), 2.13(s, 3H, 21-H), 2.18～2.20(m, 1H), 2.53～2.56(m, 2H), 2.71～2.74(m, 1H), 7.61(d,J=8.5 Hz, 2H, ArH), 7.97(d,J=8.5 Hz, 2H, ArH)；13C NMRδ: 13.36, 17.75, 21.01, 21.01, 22.87, 24.33, 24.33, 30.91, 31.52, 33.44, 35.10, 38.64, 39.25, 43.91, 53.66, 55.94, 63.47, 127.99, 128.72, 131.72, 131.87, 139.21, 156.30, 163.75, 190.59, 209.27； MS(ESI)m/z: 513{ [M+H]+}。

4-(2′-碘苯甲酰氧基)-孕甾-4-烯-3,20-二酮(4g)： 白色固體49 mg, 收率88%， m.p.217～219 ℃；1H NMRδ: 0.68(s, 3H, 18-H), 1.02～1.28(m, 5H), 1.30(s, 3H, 19-H), 1.46～2.10(m, 11H), 2.13(3s, H, 21-H), 2.18～2.20(m, 1H), 2.53～2.56(m, 2H), 2.82～2.85(m, 1H), 7.19(m, 1H, ArH), 7.44(t,J=7.5 Hz, 1H, ArH), 8.02(d,J=8.0 Hz, 1H, ArH), 8.08(dd,J=0.5 Hz, 7.5 Hz, 1H, ArH)；13C NMRδ: 13.36, 17.73, 21.01, 21.01, 22.87, 24.35, 24.35, 30.88, 31.52, 33.44, 35.12, 38.65, 39.30, 43.91, 53.65, 55.92, 63.48, 94.64, 128.02, 131.86, 133.13, 133.84, 139.11, 141.43, 156.32, 164.11, 190.27, 209.30； MS(ESI)m/z: 561{ [M+H]+}。

4-(4′-甲氧基苯甲酰氧基)-孕甾-4-烯-3,20-二酮(4h)： 白色固體35 mg, 收率76%， m.p. 178～180 ℃；1H NMRδ: 0.67(s, 3H, 18-H), 1.02～1.28(m, 5H), 1.29(s, 3H, 19-H), 1.46～2.10(m, 11H), 2.13(s, 3H, 21-H), 2.18～2.20(m, 1H), 2.53～2.56(m, 2H), 2.74～2.77(m, 1H), 3.87(s, 3H, OCH3), 6.94(d,J=8.0 Hz, 2H, ArH), 8.07(d,J=7.5 Hz, 2H, ArH)；13C NMRδ: 13.35, 17.72, 21.01, 21.01, 22.84, 24.16, 24.32, 30.92, 31.51, 33.51, 35.11, 38.65, 39.18, 43.90, 53.66, 55.51, 55.95, 63.47, 113.77, 121.37, 132.33, 139.30, 156.12, 163.84, 164.13, 190.77, 209.29； MS(ESI)m/z: 465{ [M+H]+}。

4-(3′,4′-二甲氧基苯甲酰氧基)-孕甾-4-烯-3,20-二酮(4i)： 白色固體36 mg, 收率73%， m.p.79～80 ℃;1H NMRδ: 0.68(s, 3H, 18-H), 1.02～1.28(m, 5H), 1.30(s, 3H, 19-H), 1.46～2.10(m, 11H), 2.13(s, 3H, 21-H), 2.18～2.20(m, 1H), 2.53～2.56(m, 2H), 2.75～2.78(m, 1H), 3.93(s, 3H, OCH3), 3.95(s, 3H, OCH3), 6.92(d,J=8.5 Hz, 1H, ArH), 7.60(s, 1H, ArH), 7.79(d,J=8.0 Hz, 1H, ArH)；13C NMRδ: 13.36, 17.75, 21.03, 21.03, 22.87, 24.34, 24.34, 30.94, 31.51, 33.50, 35.13, 38.67, 39.22, 43.92, 53.69, 55.98, 56.03, 56.10, 63.49, 110.37, 112.49, 121.43, 124.49, 124.56, 139.34, 148.73, 153.53, 164.26, 190.69, 209.30； MS(ESI)m/z： 495{ [M+H]+}。

(3) 由5 合成 2

氮氣保護條件下，將5 348 mg(1 mmol)溶于叔丁醇(25 mL)中，攪拌下加入氫氧化鉀細粉末168 mg(3 mmol)，回流反應(yīng)40 min。冷卻至室溫，加水30 mL，用乙酸乙酯(3×30 mL)抽提，合并有機相，用水洗滌，用無水硫酸鈉干燥，減壓除溶得粗產(chǎn)物，經(jīng)薄層層析(展開劑：V(石油醚) ∶V(丙酮)=5 ∶1)純化得2 276 mg，收率23%。

1.3體外細胞毒活性測試

用四氮唑藍 (MTT)法測試了4a～4i的體外抑制乳腺癌細胞MCF-7增殖的活性。以完全培養(yǎng)基為溶劑，5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)作為對照藥劑，將4a～4i配制成濃度為50 μg·mL-1的藥液。將生長至對數(shù)生長期的細胞消化、離心, 制成細胞懸液, 吹勻并將其密度調(diào)至4～6×104個· mL-1, 以180 μL/孔接種到96孔板中, 將96孔板置于37 ℃含5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育24 h。加入不同的受試化合物，每組設(shè)定4復孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。加入配制好的MTT溶液, 每孔20 μL，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h。取出孵育4 h的96孔板, 將其中的MTT溶液輕輕甩出, 每孔加DMSO 100 μL，微量振蕩儀上振蕩5 min使甲瓚完全溶解, 用酶標儀在492 nm下測光密度(OD)值, 并記錄數(shù)據(jù)，根據(jù)比值計算抑制率。

2　結(jié)果與討論

2.1合成

黃體酮在堿性過氧化氫介質(zhì)中生成1[9]， 1在酸性介質(zhì)(濃硫酸和冰醋酸的混合液、冰醋酸和醋酸酐的混合液、冰醋酸和對甲苯磺酸的混合液以及對甲苯磺酸和甲酸混合液)中均能生成中間產(chǎn)物4,5-二羥基黃體酮，5-位的羥基脫水進而生成2。文獻[13]報道1和甲酸反應(yīng)合成2的收率不到40%，本文使用濃硫酸和冰醋酸的混合液進行脫水反應(yīng)，于室溫條件下緩慢分批加入混合液，避免濃硫酸產(chǎn)生熱量而產(chǎn)生副反應(yīng)，收率可達62%，比傳統(tǒng)方法提高了20%。

另有報道[14]稱4-氯甾體化合物可以在固體氫氧化鉀的作用下直接轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的4-羥基甾體化合物。我們用前期合成的5嘗試了這種由氯代產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為羥基取代的反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)5可以直接轉(zhuǎn)化為2(Scheme 2)，但收率很低(23%)。

Scheme 2

羥基是一種活性較強的反應(yīng)基團，很容易和酰氯反應(yīng)生成酰氧類產(chǎn)物。我們用吡啶作為反應(yīng)介質(zhì)和縛酸劑，使2發(fā)生酰化反應(yīng)生成4a～4i，收率為73%～88%。理論上來說，酰氧類衍生物4a～4i的極性應(yīng)該小于它的底物2，但TLC薄層層析分析結(jié)果恰恰相反，產(chǎn)物點在底端，底物點在高端，原因可能是2中3-位的羰基和4-位的羥基形成了分子內(nèi)氫鍵，從而降低了分子本身的極性。

表1　4a～4i在50 μg·mL-1時抑制MCF-7細胞增殖的活性*

*NA 表示抑制率低于10%。

2.2體外細胞毒活性

本課題組前期合成的多個系列的黃體酮類衍生物均具有細胞毒活性[9～11]，因此本文采用常規(guī)的MTT比色實驗, 測試了4a～4i對MCF-7的體外細胞毒抑制活性, 實驗結(jié)果見表1。由表1可見，在濃度為50 μg·mL-1時，大多數(shù)4-酰氧基黃體酮類衍生物的抑制率均低于10%， 4c， 4d和4e對MCF-7細胞的抑制率分別為26%， 22%和13%，但抑制活性遠遜于陽性對照5-fluorouracil(抑制率達95%)。

以黃體酮為原料，經(jīng)4,5-環(huán)氧化后，在濃硫酸和冰醋酸混合液的條件下，得到了較高收率的關(guān)鍵中間體4-羥基黃體酮(2); 2通過?；磻?yīng)進一步得到了新型的4-酰氧基黃體酮衍生物，然而這些衍生物的體外細胞毒性并不強，其結(jié)構(gòu)還有待于進一步優(yōu)化。

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Synthesis and Cytotoxicity of 4-Acyloxy Modified Derivatives from Progesterone

FAN Ning-juan1a,TANG Jiang-jiang1b

(a. College of Life Science; b. College of Science, Northwest Agriculture and Forestry University, Yangling 712100, China)

The 4-hydroxyprogesterone(2) was prepared from 4,5-epoxy progesterone， using progesterone as raw material. A series of novel 4-acyloxy progesterones(4a～4i) were synthesized by acetylation reaction of 2 with different acyl chlorides(3a～3i). The structures were characterized by1H NMR,13C NMR and MS(ESI). Theinvitrocytotoxicity results showed that 4c, 4d and 4e exhibited weak activity against the MCF-7 cells at the concentrations of 50 mg·mL-1, with inhibition rate of 26%, 22% and 13%, respectively.

steroid; progesterone; acyloxy; cytotoxicity； synthesis

2016-06-27

國家自然科學基金資助項目(21402156)

范寧娟(1980-)，女，漢族，陜西岐山人，博士，主要從事天然有機合成研究。

湯江江，副教授， Tel. 029-87092226, E-mail： tangjiang11@nwsuaf.edu.cn

O629； O621.3

ADOI： 10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2016.09.16162