王玲　楊麗萍　劉夢迎　王大博

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大鼠球結(jié)膜濾過泡模型中轉(zhuǎn)化生長因子β1及轉(zhuǎn)化生長因子β2動態(tài)表達的實驗研究△

王玲楊麗萍＊劉夢迎王大博

目的建立大鼠球結(jié)膜濾過泡模型，觀察濾過泡形成及瘢痕化過程中結(jié)膜及結(jié)膜下組織轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)及轉(zhuǎn)化生長因子β2(TGF-β2)的動態(tài)表達情況，探討TGF-β1及TGF-β2在濾過泡瘢痕化中的作用。方法選用健康成年雄性SD大鼠64只，隨機選取8只作為正常對照組，其余56只大鼠作為實驗組。右眼成功建立球結(jié)膜濾過泡模型。將實驗組平均隨機分為7組，每組8只，術后觀察濾過泡的形成情況，監(jiān)測眼壓波動情況；并于術后各時間點分別處死，分別采用免疫熒光組織化學及Western印跡法檢測術區(qū)TGF-β1及TGF-β2的表達部位及動態(tài)表達量的變化。結(jié)果①所觀察術眼在術后第1天均能形成不同程度隆起明顯的濾過泡。濾過泡生存時間為7～22 d，平均13 d。②所觀察術眼在術后眼壓均明顯下降，后緩慢上升。平均于術后7 d時回歸術前基線水平，保持至觀察期結(jié)束。③免疫熒光組織化學結(jié)果顯示在濾過泡結(jié)膜組織上皮層、固有層均可見到TGF-β1及TGF-β2強陽性表達。④Western印跡法結(jié)果顯示TGF-β1在術后1 d開始明顯增高，持續(xù)增高至術后5、7 d達峰值，隨后逐漸降低至術后28 d，但仍高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(F=431.918 ,P<0.01)。TGF-β2在術后1 d開始明顯增高，持續(xù)增高至術后7 d達峰值，隨后逐漸降低至術后28 d，但仍高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(F= 674.323,P<0.01)。結(jié)論前房引流管植入術可成功建立大鼠球結(jié)膜濾過泡模型。TGF-β1及TGF-β2參與了球結(jié)膜濾過泡的形成及瘢痕化進程。(中國眼耳鼻喉科雜志，2016，16：313-318)

青光眼濾過性手術；轉(zhuǎn)化生長因子β1；轉(zhuǎn)化生長因子β2；瘢痕化；大鼠

青光眼是一組以視神經(jīng)萎縮和視野缺損為共同特征的疾病，病理性眼壓增高是其發(fā)生、發(fā)展的重要危險因素。青光眼濾過性手術是當前公認降低眼壓最理想的干預措施，但其失敗率依然達10%～30%[1]。目前研究[2]顯示，青光眼濾過區(qū)濾過泡消失主要是由于傷口周圍成纖維細胞大量增殖造成的。細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)是存在于細胞間的動態(tài)網(wǎng)狀結(jié)締組織，在病理情況下，ECM的原有平衡也會被打破，在炎癥反應、新生血管生成、腫瘤局部浸潤及遠處轉(zhuǎn)移的病理進程中起到重要作用。轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β,TGF-β)能夠特異性增加ECM的合成，刺激膠原蛋白、層粘連蛋白和纖連蛋白等分泌增加，同時抵制其降解酶的活化，減少ECM降解，促使ECM 沉積[3]。TGF-β通過對炎癥細胞和成纖維細胞強烈的趨化、吸引作用，使得這些細胞創(chuàng)傷局部大量聚集，增強炎癥反應。TGF-β還可以刺激成纖維細胞分泌纖維粘連蛋白，并增加它們在ECM 中積聚[4]。

為進一步研究青光眼濾過術后濾過泡形成及瘢痕化進程中TGF-β發(fā)揮的作用，我們通過在大鼠前房內(nèi)植入引流管成功建立球結(jié)膜濾過泡模型，術后觀察濾過泡形成及眼部反應，監(jiān)測眼壓波動情況，采用Western印跡法觀察TGF-β1及TGF-β2在濾過區(qū)結(jié)膜及結(jié)膜下組織中的動態(tài)表達，并用免疫熒光組織化學檢測TGF-β1及TGF-β2在濾過區(qū)的表達部位。研究TGF-β1及TGF-β2在大鼠球結(jié)膜濾過泡模型中的動態(tài)表達，為下一步青光眼術后瘢痕化的干預治療提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗動物及分組選取健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠64只，6～8周，重250～300 g。于青島大學附屬醫(yī)院動物實驗室(SPF級)飼養(yǎng)。所有鼠眼術前均經(jīng)裂隙燈、直接檢眼鏡檢查，排除眼部疾患。從中隨機選取8只作為正常對照組，不做任何處理；其余56只大鼠作為實驗組，并隨機平均分為7組，每組8只。隨機選取5只實驗組大鼠，剪取大鼠濾過術區(qū)結(jié)膜及結(jié)膜下組織進行Western印跡法檢測；取另3只大鼠完整眼球做冷凍切片進行免疫熒光組織化學染色。于動物實驗室飼養(yǎng)1周后，實驗眼行前房引流管植入術，成功建立大鼠球結(jié)膜濾過泡模型。

1.2球結(jié)膜濾過泡動物模型的制備將10%水合氯醛按0.3 mL/100 g的劑量腹腔注射入大鼠體內(nèi)(推注不宜過快)，誘導其全身麻醉；眼部滴用0.4%鹽酸奧布卡因滴眼液表面麻醉，0.25%氯霉素滴眼液沖洗Tenons囊2次；0.5%聚維酮碘(碘伏)消毒術眼，范圍為眼瞼以外2 cm，鋪無菌洞巾內(nèi)。參照Sherwood等[5]前房引流管植入法，大鼠眼球顳上方角膜緣后2～2.5 mm處以角膜緣為基底做長2～3 mm的結(jié)膜瓣；剪開球結(jié)膜，鈍性分離Tenons囊至鞏膜面，距角膜緣約0.5 mm處用24 G胰島素針針頭穿刺鞏膜進入前房；并向前房內(nèi)注入黏彈劑，以維持前房。取25 G長3～4 mm的微管(硅膠管，北京醫(yī)用橡膠制品研究所)，將穿入前房端剪成斜面，末端為平面，保持斜面向上，沿鞏膜隧道穿刺入前房。因植管與鞏膜隧道連接相對緊密，不需要縫線等固定位置。植管后即可見管末端有液體流出。10-0絲線連續(xù)縫合球結(jié)膜及Tenons囊。術后結(jié)膜囊內(nèi)涂紅霉素眼膏。術后注意保溫，待大鼠麻醉完全蘇醒后，送回動物房飼養(yǎng)。手術操作及術后觀察均由同一人完成。術后3 d內(nèi)常規(guī)雙眼滴用0.25%氯霉素滴眼液，2次/d，預防手術區(qū)感染。

1.3試劑和儀器立體顯微鏡(解剖顯微鏡)(OLYMUS MODEL SZ2-ILST，日本)；冷凍切片機(LEICA CM1950，德國)；熒光顯微鏡(LEICA DFC480，德國)；最佳切削溫度(optimal cutting temperature, OCT)包埋劑(美國櫻花)；電轉(zhuǎn)移裝置(Bio-Rad公司，美國)；垂直板蛋白電泳槽(Bio-Rad公司，美國)；24 G胰島素穿刺針(日本)；硅膠管(北京醫(yī)用橡膠制品研究所)；眼壓計(陜西達明生物科技有限公司)；免疫熒光一抗：兔抗大鼠單克隆抗體TGF-β1( 美國Abcam公司，按1∶100稀釋成工作液)、小鼠抗大鼠單克隆抗體TGF-β2 ( 美國Abcam公司，按1∶500稀釋成工作液)；免疫熒光二抗：Cy3標記的山羊抗兔抗體(中國康為世紀公司，按1∶100稀釋成工作液)；Western一抗：兔抗大鼠單克隆抗體TGF-β1 ( 美國Abcam公司，按1∶400稀釋成工作液)，小鼠抗大鼠單克隆抗體TGF-β2(美國Abcam公司，1∶5 000)；Western二抗：山羊抗兔抗體(中國康為世紀公司，按1∶5 000稀釋成工作液)；Western內(nèi)參：抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)鼠單克隆抗體(中國康為世紀公司,按1∶3 000稀釋成工作液)；4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)(中國碧云天公司,按1∶4 000稀釋成工作液)。

1.4術后一般情況的觀察及處理手術后觀察大鼠的一般情況及在裂隙燈顯微鏡下的術眼反應。術后1周內(nèi)每天觀察，手術1周后觀察頻率改為每2天1次。每次觀察后雙眼結(jié)膜囊內(nèi)均涂布適量紅霉素眼膏。

1.5正常及術后各時間點的眼壓測量用Tonolab眼壓計測量正常對照組及實驗組各時間點的大鼠眼壓(選取用于Western印跡法檢測的5只大鼠眼球)。按0.3 mL/100 g體重的劑量對大鼠腹腔注射10%水合氯醛誘導全麻，眼角膜表面點用0.4%鹽酸奧布卡因表面麻醉藥。取Tonolab眼壓計，保持測量探頭水平，使其在距離角膜3～ 5 mm 的角膜頂點處與視軸的夾角在25°范圍內(nèi)[6]。每只觀察眼均測量6次，記錄所有數(shù)據(jù)。

1.6取材及標本的處理對照組的8只大鼠在購買后于實驗室飼養(yǎng)1周處死。7個實驗組大鼠，各組隨機選取5只大鼠用于Western印跡法檢測，同時測量各時間點大鼠眼壓；另3只大鼠用于免疫組織化學染色。實驗組56只大鼠于手術完成后1、3、5、7、14、21、28 d分別處死。對隨機選取的5只大鼠，剪取大鼠濾過區(qū)結(jié)膜及結(jié)膜下組織，用細胞裂解液提取總蛋白，利用標準蛋白含量曲線對樣本定量后行Western印跡法檢測；對另3只大鼠完整眼球，仔細解剖摘除后用磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline, PBS)沖凈血跡，OCT包埋，做冷凍切片進行免疫熒光組織化學染色。

1.7Western印跡法測各樣本TGF-β1及TGF-β2表達各樣本使用等量總蛋白進行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白印跡轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜上。封閉液置室溫封閉1 h。加入一抗稀釋液；兔抗大鼠單克隆抗體TGF-β1(1∶400)或小鼠抗大鼠單克隆抗體TGF-β2(1∶5 000)，室溫孵育2 h。PBS-T漂洗，每次10 min，共3次。再加入二抗；山羊抗兔抗體(1∶5 000)，室溫孵育1 h。PBS-T漂洗，每次10 min，共3次。采用增強的化學發(fā)光法顯跡，在柯達感光底片上曝光1 min，保存分析結(jié)果。每個標本在實驗中至少重復檢測3次。將顯影后X線片掃描成圖片后，應用凝膠圖像分析系統(tǒng)對蛋白條帶進行灰密度值讀數(shù)，數(shù)值以測得GAPDH的灰度掃描為基線水平。

1.8免疫熒光化學染色檢測各樣本MMP-2及TIMP-2表達摘除大鼠眼球，用PBS沖凈眼球上的血跡，用OCT 包埋后，置于冷凍切片機切片(6 μm)。4%多聚甲醛固定15 min，PBS-T緩沖液沖洗2次，阻斷液(5%BSA，PBS-T，0.5%TritonX-100)室溫封閉30 min；加入按說明書說明的以及根據(jù)預實驗結(jié)果稀釋至適當濃度一抗工作液：兔抗大鼠單克隆抗體TGF-β1(1∶100)、小鼠抗大鼠單克隆抗體TGF-β2(1∶500)，4 ℃孵育(陰性對照一抗加PBS)過夜；PBS-T緩沖液漂洗3次；加入二抗：Cy3標記的山羊抗兔抗體(1∶100)，37 ℃恒溫箱孵育1 h(從二抗孵育開始注意避光)；PBS-T緩沖液漂洗3次；DAPI(1∶4 000)染核5 min，緩沖液漂洗后用熒光顯微鏡觀察拍照。

2　結(jié)果

2.1術后大鼠全身一般情況和眼前節(jié)情況術后大鼠全身一般情況良好，飲食正常，精神尚佳，活動靈活。眼前節(jié)情況：眼瞼無明顯紅腫，結(jié)膜囊干凈，球結(jié)膜切口對合好，縫線在位。濾過泡完整無滲漏，呈不同程度隆起。角膜透明，無明顯水腫及上皮缺損。前房深度正常，無出血，房水中可見不同程度的房水閃輝和房水細胞，均在術后2～4 d內(nèi)消失。瞳孔圓形居中，光反應良好。晶狀體透明。

2.2結(jié)膜濾過泡形成情況以手術后有無形成結(jié)膜濾過泡作為判斷手術效果的標準[2]。觀察組術眼在術后第1天均能形成不同程度隆起明顯的濾過泡。濾過泡維持時間為7～22 d，平均生存時間是13 d。4～5 d濾過泡表面開始出現(xiàn)血管化。

2.3正常及術后眼壓情況用Tonolab眼壓計測量正常組大鼠眼壓及實驗組大鼠球結(jié)膜濾過泡模型制作術后的眼壓情況，測量結(jié)果見圖1。利用SPSS17.0進行各組間眼壓值單因素方差分析：F=4.382，P=0.007，各組間眼壓相比差異具有統(tǒng)計學意義。組間兩兩相比：術后1、3、5 d眼壓低于正常組，術后1 d眼壓與正常組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.004)，術后3、5 d眼壓與正常組相比差異有統(tǒng)計學意義(P=0.011、0.036)；術后7、14、21、28 d眼壓與正常組相比差異均無統(tǒng)計學意義(P=0.900、1.000、0.974、0.988)。

圖1.　正常及青光眼濾過泡模型制作術后各組眼壓情況

2.4Western印跡法檢測TGF-β1及TGF-β2的表達術后不同時間點大鼠結(jié)膜及結(jié)膜下組織TGF-β1及TGF-β2的表達情況(圖2)。

圖2.　Western印跡法TGF-β1及TGF-β2的水平表達

術后實驗組中TGF-β1隨手術后時間變化呈明顯峰型變化，術后1 d即明顯增加，術后5、7 d表達量達到峰值，以后呈現(xiàn)降低趨勢，但仍高于正常對照組(圖3)。各組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(F=431.918，P=0.000)，術后不同時間點TGF-β1蛋白相對表達量與術前相比差異均具有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。實驗組濾過術后不同時間點間兩兩比較結(jié)果顯示，TGF-β1含量在術后1 d與術后28 d以及術后5 d和術后7 d間的差異無統(tǒng)計學意義(P=0.097、0.621)，其余兩時間點間比較差異均具有統(tǒng)計學意義。

圖3.　Western印跡法檢測大鼠濾過術區(qū)組織中TGF-β1蛋白相對表達量

術后實驗組中TGF-β2隨手術后時間變化呈明顯峰型變化，術后1 d即明顯增加，術后7 d表達量達到峰值，以后呈現(xiàn)降低趨勢，但仍高于正常對照組(圖4)。各組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(F=674.323，P=0.000)。術后不同時間點TGF-β2蛋白相對表達量與術前相比差異均具有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。實驗組濾過術后不同時間點間兩兩比較結(jié)果顯示，TGF-β2含量在術后1 d與術后28 d間差異無統(tǒng)計學意義(P=0.779)，其余2個時間點間比較差異均具有統(tǒng)計學意義。

圖4.　Western印跡法檢測大鼠濾過術區(qū)組織中TGF-β2蛋白相對表達量

2.5免疫熒光組織化學檢測TGF-β1及TGF-β2的表達正常組織及濾過泡組織中TGF-β1的表達結(jié)果顯示，正常對照組：在正常結(jié)膜組織中可觀察到TGF-β1在結(jié)膜上皮層有較弱陽性表達，固有層基本無表達；實驗組：術后7、28 d顯示TGF-β1在濾過泡結(jié)膜組織上皮層、固有層，可見到強陽性表達(圖5)。正常組織及濾過泡組織中TGF-β2的表達結(jié)果顯示，正常對照組：TGF-β2正常組織結(jié)膜上皮層見較弱陽性表達，固有層基本無表達；實驗組術后7、28 d顯示TGF-β2在濾過泡結(jié)膜組織上皮層、固有層可見到強陽性表達(圖6)。

圖5.　正常組織及濾過泡組織中TGF-β1的表達(免疫熒光化學染色×100倍)　A為正常對照組：在正常結(jié)膜組織中可觀察到TGF-β1在結(jié)膜上皮層有較弱陽性表達，固有層基本無表達；B為術后7 d，C為術后28 d：TGF-β1在濾過泡結(jié)膜組織上皮層、固有層，可見到強陽性表達；D為陰性對照組(術后7 d一抗用PBS代替)：無陽性表達

圖6.　正常組織及濾過泡組織中TGF-β2的表達(免疫熒光化學染色×100倍)　A為正常對照組：TGF-β2正常組織結(jié)膜上皮層見較弱陽性表達，固有層基本無表達；B為術后7 d, C為術后28 d：TGF-β2在濾過泡結(jié)膜組織上皮層、固有層，可見到強陽性表達；D為陰性對照組(術后7 d一抗用PBS代替)：無陽性表達

3　討論

我們采用前房引流管植入術成功制作大鼠球結(jié)膜濾過泡模型。與正常組大鼠眼壓相比，大鼠濾過術后1 d眼壓明顯降低，后呈現(xiàn)緩慢上升趨勢，直至術后7 d時達到正常眼壓水平并一直保持穩(wěn)定。Sherwood等[5]在SD大鼠眼前房內(nèi)植入30 G硅膠管將房水引流至結(jié)膜下，制作大鼠球結(jié)膜濾過泡瘢痕化模型，結(jié)果顯示濾過術后眼壓迅速下降，術后5～6 d時恢復至術前平均水平。本實驗研究大鼠術后眼壓回歸術前基線水平長于以上研究的原因：可能在于本實驗所用硅膠管為24 G，略粗于30 G，因此濾過道較為粗大，濾過更為通暢，濾過道因周圍組織瘢痕化而完全閉合所需時間相對較長。

本研究中采用免疫熒光組織化學觀察了正常大鼠及球結(jié)膜濾過泡模型中球結(jié)膜及結(jié)膜下組織中TGF-β1及TGF-β2的表達部位。結(jié)果顯示，TGF-β1及TGF-β2表達部位基本一致，在正常結(jié)膜組織中只有結(jié)膜上皮層有弱陽性表達，固有層基本無表達；而在濾過泡模型的結(jié)膜組織上皮層、固有層均可見到強陽性表達。術后7 d球結(jié)膜濾過泡彌散隆起，結(jié)膜下組織疏松，可見強陽性表達彌散分布；術后28 d球結(jié)膜濾過泡不明顯，結(jié)膜下致密結(jié)締組織也可見到陽性表達。Western印跡法檢測TGF-β1及TGF-β2在濾過區(qū)結(jié)膜及結(jié)膜下組織中的動態(tài)表達，結(jié)果顯示兩者呈明顯峰型變化，術后1 d表達量顯著升高，術后7 d表達量最高，其后呈現(xiàn)逐漸降低趨勢，但仍高于正常對照組。手術操作本身可導致血-房水屏障的破壞，血漿及血小板分泌釋放TGF-β前體至傷口周圍，同時手術區(qū)局部組織亦可分泌TGF-β，因此出現(xiàn)術后1 d的TGF-β局部表達量明顯增加。濾過術區(qū)局部高濃度的TGF-β刺激濾過術區(qū)結(jié)膜囊成纖維細胞，使其分泌TGF-β的功能上調(diào)；然后濾過術區(qū)活化的單核細胞及巨噬細胞等開始分泌TGF-β。因此創(chuàng)傷初期階段局部TGF-β濃度持續(xù)上升，至7 d時達峰值。

學者們試圖以TGF-β抗體來干預青光眼濾過術后瘢痕的形成，預期達到延長濾過泡壽命的效果，做了相關研究[7-9]。在動物模型研究中，應用抗TGF-β2抗體時沒有發(fā)現(xiàn)嚴重并發(fā)癥，對周圍組織也沒有產(chǎn)生明顯毒副作用，組織耐受性好[10-13]。Siriwardena等[9]將人TGF-β2單克隆抗體CAT-152用于臨床試驗，在手術即刻的前后，手術后1、7 d結(jié)膜下分別注射CAT-152或安慰劑，經(jīng)過手術后12個月的隨訪，發(fā)現(xiàn)實驗組青光眼濾過泡形態(tài)彌散、濾過泡組織無囊變及無血管化；眼壓降低的程度在手術后3個月和6個月最為明顯；2組間手術并發(fā)癥的發(fā)生率無顯著性差異，且實驗組也沒有發(fā)生與CAT-152應用相關的嚴重副作用。根據(jù)該實驗結(jié)果，他們認為CAT-152在青光眼濾過術后抗瘢痕化形成中能夠發(fā)揮全新、有效的作用，在臨床應用中具有樂觀的發(fā)展空間。初步的實驗結(jié)果著實令人鼓舞，因此吸引了更多學者參與CAT-152的抗瘢痕化研究中，然而另有學者[14-15]所做CAT-152的Ⅲ期臨床試驗并未得到人們所期待的結(jié)果，研究顯示CAT-152對青光眼患者濾過術后預防濾過術失敗并無明顯作用。分析既然TGF-β可促進濾過泡的瘢痕形成，但抑制TGF-β后并沒有提高濾過手術的成功率，這可能與其復雜的生物學特性及多種細胞因子參與濾過泡的瘢痕形成有關。因此，有必要采用系列研究進一步探討濾過泡的形成及瘢痕化進程中結(jié)膜及結(jié)膜下組織TGF-β的動態(tài)表達及濾過泡形態(tài)學改變的相關性。在前期研究中，我們采用前房引流管植入術成功制作大鼠球結(jié)膜濾過泡模型，發(fā)現(xiàn)術后1周左右，濾過泡表現(xiàn)出活躍的創(chuàng)傷愈合反應；而在2周內(nèi)創(chuàng)傷修復中的瘢痕形成最為關鍵，成纖維細胞增生活躍，致使瘢痕化形成。在本研究濾過泡結(jié)膜及結(jié)膜下組織TGF-β的動態(tài)表達中，我們也發(fā)現(xiàn)術后1周左右，TGF-β1及TGF-β2的表達達高峰，與術區(qū)成纖維細胞的增生及膠原纖維的堆積密切相關且相一致。本研究從TGF-β的角度入手，尋求抑制青光眼濾過術后瘢痕形成的新治療手段或新干預藥物，提供了堅實的理論基礎。

[1]Melamed S, Fiore PM. Molteno implant surgery in refractory glaucoma[J]. Surv Ophthalmol, 1990, 34 (6):441-443.

[2]Chang L, Crowston JG, Cordeiro MF, et al. The role of the immune system in conjunctival wound healing after glaucoma surgery[J]. Surv Ophthalmol, 2000, 45(1):49-68.

[3]Eisenstein R, Grant-Bertacchini D. Growth inhibitory activities in avascular tissues are recognized by anti-transforming growth factor beta antibodies[J]. Curr Eye Res, 1991, 10(2):157-62.

[4]Corderio MF. Beyond Mitomycin: TGF- and wound healing [J]. Prog Retin Eye Res, 2002, 21(1):75-89

[5]Sherwood MB, Esson DW, Neelakantan A,et al. A new model of glaucoma filtering surgery in the rat[J]. J Glaucoma, 2004, 13(5): 407-412.

[6]Kontiola AI, Goldblum D, Mittag T, et al. The induction/impact tonometer: a new instrument to measure intraocular pressure in the rat[ J] . Exp Eye Res, 2001, 73( 6) :781- 785.

[7]Pena RA, Jerdan JA, Glaser BM.Effects of TGF-beta and TGF-beta neutralizing antibodies on fibroblast-induced collagen gel contraction: implications for proliferative vitreoretinopathy[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,1994,35(6):2804-2808.

[8]Cordeiro MF，Gay JA，Khaw PT．Human anti-transforming growth factor-beta2 antibody：a new glaucoma anti-scarring agent[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，1999，40(10)：2225-2234．

[9]Siriwardena D，Khaw PT，King AJ，et a1．Human antitransforming growth factor-beta(2) monoclonal antibody-a new modulator of wound healing in trabeculectomy:a randomized placebo controlled clinical study[J].Ophthalmology, 2002,109(3):427-431．

[10]Cordeiro MF,Gay JA,Khaw PT．Human anti-Transforming growth factor-bata2 antibody：a new glaucoma anti-scarring agent[J].Invest Ophthalmol Vis Sci , 1999, 40(12):2225-2232.

[11]Mead AL ,Wong TT,Cordeiro MF,et a1．Evaluation of anti-TGF-beta2 antibody as a new postoperative anti-scarring agent in glaucoma surgery[J].Invest Ophthalmol Vis Sci ,2003,44(8):3394-340l.

[12]Wong TT,Mead AL,Khaw PT．Prolonged antiscarring effects of ilomastat and MMC after experimental glaucoma filtration surgery[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2005,46(6):20l8-2022.

[13]Siriwarden D，Khaw PT,Kinq AJ，et a1．Human antitransforming growth factor beta(2) monoclonal antibody--a new modulator of wound healing in trabeculectomy：a randomized placebo controlled clinical study[J]. Ophthalmology ,2002,109(3):427-43l.

[14]Mead AL,Wong TT,Cordeiro MF,et a1.Evaluation of anti-TGF-beta 2 antibody as a new postoperative anti-scarring agent in glaucoma surgery[J]．Invest Ophthalmol Vis Sci,2003,44(8):3394-3401．

[15]CAT-152 0102 Trabeculectomy Study Group，Khaw P，Grehn F，et a1．A phase III study of subconjunctival human anti-transforming growth factor beta(2)monoclonal antibody(CAT-152)to prevent scarring after first-time trabeculectomy[J] .Ophthalmology,2007,114(10):1822-1830．

(本文編輯 諸靜英)

Dynamic expression of transforming growth factor β1 and transforming growth factor β2 in conjunctival filtering bleb of rats

WANGLing,YANGLi-ping＊,LIUMeng-ying,WANGDa-bo.

DepartmentofOphthalmology,AffiliatedHospitalofMedicalCollege,QingdaoUniversity,Qingdao266003,China

WANG Ling, Email: tsingtaowl@hotmail.com

ObjectiveTo establish a model of conjunctival filtering bleb in rats and to observe the expression and discuss the effects of transforming growth factor β1 (TGF-β1) and transforming growth factor β2(TGF-β2) in conjunctival and subconjunctival tissue in the filtering bleb formation and scarring. MethodsSixty-four healthy and adult male SD rats were included. Eight rats were randomly selected as the normal control group. The remaining 56 rats were chosen as the experimental group, whose right eyes were established conjunctival bleb model by anterior chamber drainage tube implantation.The experimental group was randomly divided into 7 subgroups. The formations of filtering bleb were observed, and the intraocular pressure fluctuations were monitored after the surgery. The expression and sites of TGF-β1 and -β2 were detected by semi-quantitative Western blot analysis and immunofluorescent staining . Results①Different extents and obviously bulgy filtering blebs can be formed in all the eyes of the rats on the first day after the surgery. All the filtering blebs maintained 7～22 days, with average of 13 days. ②All the intraocular pressures of the eyes declined obviously right after surgery, then slowly rose. The intraocular pressures returned to preoperative level on the 7th day after the surgery on average，and kept normal to the end of the observation period. ③The results of immunofluorescent staining showed that TGF-β1 and -β2 were found to be expressed in conjunctival epitheliumin and subconjunctival tissue in the conjunctival filtering bleb tissue. ④Results of Western blot showed that TGF-β1 began to rise on the first day after the surgery, and kept rising to the peak on the 5th day or 7th day after the surgery, then gradually reduced until 28 days after the surgery, but still higher than that in the control group. There was significant difference between the two groups (F=431.918 ,P<0.01). TGF-β2 began to rise on the first day after the surgery, and kept rising to the peak on the 7th day after the surgery, then gradually reduced until 28 days after surgery, but still higher than that in the control group. There was significant difference between the two groups (F= 674.323,P<0.01).ConclusionsThe rat model of conjunctival filtering bleb can be established by drainage tube implantation.TGF-β1 and -β2 participate in the process of conjunctival filtering bleb formation and scarring. (Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2016,16:313-318)

Glaucoma filtering surgery;Transforming growth factor β1; Transforming growth factor β2; Scarring; Rat

山東省優(yōu)秀中青年科學家科研獎勵基金項目(BS2010SW008)

青島大學附屬醫(yī)院眼科青島266003；＊山東省青島市黃島區(qū)人民醫(yī)院眼科青島266003

王玲(Email: tsingtaowl@hotmail.com)

10.14166/j.issn.1671-2420.2016.05.003

2015-10-29)