唱得龍　賈建平　張偉　胡晨　李洪波

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T細(xì)胞亞群及相關(guān)細(xì)胞因子在變應(yīng)性鼻炎患者外周血中的表達(dá)及意義△

唱得龍賈建平張偉胡晨李洪波

目的探討變應(yīng)性鼻炎(AR)患者外周血中T細(xì)胞亞群及其相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)。方法收集34例AR患者(AR組)和20例健康志愿者(對照組)的外周血。采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測外周血中輔助性T細(xì)胞1(Th1細(xì)胞)、Th2、Th17細(xì)胞和CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)、Foxp3+CD4+CD25+Treg細(xì)胞百分比；同時(shí)檢測血清中白細(xì)胞介素27(IL-27)、γ干擾素(IFN-γ)、IL-4、轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)和IL-17的表達(dá)水平。結(jié)果AR組的Th1、Th17細(xì)胞百分比和Th1/ Th2細(xì)胞比例明顯高于對照組，Th2細(xì)胞百分比明顯低于對照組，Th1/ Th2比例明顯失衡。AR組患者外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞和Foxp3+CD4+CD25+Treg細(xì)胞百分比明顯低于對照組。AR組IL-4和IL-17表達(dá)明顯高于對照組，IFN-γ、IL-27和TGF-β1明顯低于對照組。結(jié)論 AR患者外周血中Th1/Th2、Th17/Treg細(xì)胞失衡是導(dǎo)致AR的重要原因。(中國眼耳鼻喉科雜志，2016，16：319-321)

T淋巴細(xì)胞亞群；細(xì)胞因子；鼻炎，變應(yīng)性

變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis, AR)是耳鼻咽喉科發(fā)病率較高的疾病之一,是特異性個(gè)體接觸致敏原后導(dǎo)致包括免疫球蛋白E(immunoglobulin E, IgE)介導(dǎo)的炎癥遞質(zhì)釋放和多種免疫活性細(xì)胞、細(xì)胞因子參與的鼻黏膜慢性炎癥反應(yīng)性疾病。其發(fā)生的必要條件有3個(gè)：特異性抗原即引起機(jī)體免疫反應(yīng)的物質(zhì)；特應(yīng)性個(gè)體即所謂個(gè)體差異、過敏體質(zhì)；特異性抗原與特應(yīng)性個(gè)體相遇。目前研究認(rèn)為，輔助性T細(xì)胞1(helper T cell 1, Th1)/Th2細(xì)胞免疫失衡是AR發(fā)病機(jī)制中的主要環(huán)節(jié)[1]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells, Tregs細(xì)胞)是一種抑制性T細(xì)胞，在自身免疫耐受中發(fā)揮重要作用，下調(diào)Th1和Th2細(xì)胞的促炎反應(yīng)，阻止從早期的活化階段向Th2細(xì)胞的分化階段轉(zhuǎn)變，限制了針對抗原的氣道變應(yīng)性炎癥反應(yīng)和過多的Th2細(xì)胞反應(yīng)。CD4+Treg細(xì)胞是當(dāng)前最受重視和投入研究最多的一類Treg細(xì)胞。本研究深入探討AR的具體發(fā)病機(jī)制及尋求特異性治療方法是鼻科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。本文對AR的免疫危險(xiǎn)因素進(jìn)行研究分析。

1　材料與方法

1.1材料2015年1～8月本科收治的AR患者34例(AR組)，其中男性18例、女性16例；平均年齡為26.2歲。所有AR患者均符合診斷標(biāo)準(zhǔn)，且不伴哮喘及阿司匹林耐受不良等疾病，未經(jīng)抗組胺和免疫治療。20例來自本院的健康志愿者(對照組)，無呼吸道和變應(yīng)性疾病史，其中男性11例、女性9例；平均年齡為27.6歲。所有受試者均在征得知情同意后接受實(shí)驗(yàn)。

1.2CD4+CD25+Treg細(xì)胞和Foxp3+CD4+CD25+Treg細(xì)胞檢測取乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝血50 μL，分別加入CD4-異硫氰酸熒光素(CD4 fluorescein isothiocyanate, CD4-FITC), CD25-藻紅蛋白(CD25 phycoerythrin, CD25-PE)充分混勻，暗室孵育15 min；加入固定劑100 mL，15 min后，以磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)洗滌，1 500 轉(zhuǎn)/min離心，棄上清液；加入100 μL破膜劑，30 min后，1 500 轉(zhuǎn)/min離心，棄上清液；加入5 μL Foxp3-PE-CY5, 15 min后，加入200 μL PBS，即刻以流式細(xì)胞儀(FACS CANTO II)檢測。

1.3Th1/Th2和Th17細(xì)胞檢測取外周血200 μL，加入等體積1640培養(yǎng)液1∶1稀釋均勻。加入19 μL PMA工作液(濃度為1 μg/mL)、6 μL離子霉素工作液(濃度為50 μg/mL)和6 μL莫能霉素工作液(0.1 mg/mL)。輕輕吹打均勻，置于37 ℃含5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 h。外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)管中加入CD4-FITC、CD8 抗原呈遞細(xì)胞(CD8 antigen presenting cell, CD8-APC)和CD3-PE-CY7單克隆抗體，室溫下避光反應(yīng)15 min。PBS洗滌2次，加入破膜劑100 μL,室溫下避光孵育15 min，PBS洗滌2次。加入IFN-γ-PE-CY5和IL-4-PE單克隆抗體共同混勻，室溫下避光孵育20 min。用PBS洗滌2次后，以PBS 300 μL重懸細(xì)胞，即刻以流式細(xì)胞儀檢測。

1.4Th1/Th2相關(guān)細(xì)胞因子檢測利用流式細(xì)胞微球陣列技術(shù)(cytometric bead array, CBA)檢測外周血中Th1/Th2相關(guān)細(xì)胞因子：白細(xì)胞介素27(interleukin 27, IL-27)、IL-4、IL-17、轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β 1, TGF-β1)和γ干擾素(interferon γ，IFN-γ)。靜脈采血2 mL，分離血清于-70 ℃保存?zhèn)溆谩Ｓ梅磻?yīng)稀釋液將5種細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為5 000、2 500、1 250、625、312、156、80、40、20、10、5和0 pg/mL共12個(gè)梯度制訂標(biāo)準(zhǔn)曲線。取待測血清和標(biāo)準(zhǔn)品50 μL置于上樣管，加入50 μL混勻捕獲微球，室溫避光孵育1 h；然后加入50 μL檢測抗體，室溫避光2 h；加入1 mL洗液以200×g離心5 min，棄上清液；洗滌2次后，每管加入300 μL洗滌液重懸微球，上機(jī)以FACS DIVA軟件獲取數(shù)據(jù)。以FACP Array軟件分析獲取的數(shù)據(jù)。

2　結(jié)果

AR組患者Th1、Th17細(xì)胞百分比和Th1/ Th2細(xì)胞比例明顯高于對照組，Th2細(xì)胞百分比明顯低于對照組，Th1/ Th2細(xì)胞比例明顯失衡。AR組患者外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞和Foxp3+CD4+CD25+Treg細(xì)胞的百分比明顯低于對照組。AR組IL-4和IL-17表達(dá)明顯高于對照組，而IFN-γ、IL-27和TGF-β1明顯低于對照組，詳見表1。

表1　2組外周血各T細(xì)胞亞群百分比及細(xì)胞因子表達(dá)水平

注：a示與正常對照組比較，P<0.01

3　討論

AR是體外環(huán)境因素作用于機(jī)體產(chǎn)生的異常免疫反應(yīng)。T淋巴細(xì)胞是來源于骨髓的多能干細(xì)胞，按照其功能和表面標(biāo)志物的不同，可以分為多個(gè)種類：細(xì)胞毒性T細(xì)胞，調(diào)節(jié)/抑制性T細(xì)胞和記憶T細(xì)胞等。Th細(xì)胞在免疫反應(yīng)過程中扮演中間過渡的角色,主要可以通過增生擴(kuò)散來激活其他類型能產(chǎn)生直接免疫反應(yīng)的免疫效應(yīng)細(xì)胞,其主要的細(xì)胞表面標(biāo)志物是CD4。Th細(xì)胞又可以分為Th1、Th2、Treg和Th17等不同亞型細(xì)胞。Th1/Th2細(xì)胞平衡是維持正常細(xì)胞免疫和體液免疫所必需的，平衡失調(diào)則可能導(dǎo)致異常的免疫應(yīng)答。本研究結(jié)果顯示，AR組患者Th1細(xì)胞明顯高于對照組，Th2細(xì)胞明顯低于對照組，Th1/Th2細(xì)胞比例明顯失衡。Th17細(xì)胞是近年發(fā)現(xiàn)的一種新型CD4+效應(yīng)T細(xì)胞亞群，由TGF-β和IL-6誘導(dǎo)，可分泌IL-17和少量IL-22，介導(dǎo)自身免疫性疾病和組織炎癥。有學(xué)者[2]研究表明,給予花粉變應(yīng)原刺激后的AR患者，其外周血Th17細(xì)胞的比例增高。本研究結(jié)果顯示，AR組患者Th17細(xì)胞百分比明顯高于對照組。

CD4+CD25+Treg細(xì)胞主要來源于胸腺，占正常人外周血CD4+T細(xì)胞的5%～10%。Treg細(xì)胞表達(dá)多種表面分子，其中叉頭/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子3(forkhead box protein-3，F(xiàn)oxp3)是Treg細(xì)胞的特異性標(biāo)志。Th17細(xì)胞屬于“促炎性的細(xì)胞”，而Treg細(xì)胞屬于“抑炎性的細(xì)胞”，兩者的平衡是維持機(jī)體正常穩(wěn)定免疫狀態(tài)所必需。本研究結(jié)果顯示，AR患者外周血Th17細(xì)胞百分比明顯高于對照組，CD4+CD25+Treg細(xì)胞百分比明顯低于對照組,提示Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞免疫失衡可能是AR發(fā)病的重要原因。有學(xué)者[3]研究發(fā)現(xiàn)，AR患者的鼻黏膜及PBMC中的Foxp3+CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)和Foxp3+CD4+CD25+Treg mRNA 表達(dá)明顯低于對照組,與本研究結(jié)果一致。因此我們可以推測,Foxp3+CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)量的減少可能引起Treg細(xì)胞對Th2型細(xì)胞反應(yīng)的抑制作用減弱,從而導(dǎo)致AR的發(fā)生。

IL-27是新型的Th1型細(xì)胞因子，主要功能是促進(jìn)初始CD4+T細(xì)胞向Th1細(xì)胞方向分化, 并抑制其向Th2和Th17細(xì)胞方向分化。Shimanoe等[4]發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)注射IL-27可以明顯緩解小鼠的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng), 且其體內(nèi)IL-17含量較對照組明顯降低。在小鼠哮喘模型中，IL-27抑制Th2型細(xì)胞反應(yīng)和變應(yīng)性炎癥[5]。本研究結(jié)果顯示，IL-27在AR患者中表達(dá)下降，從而導(dǎo)致Th1細(xì)胞因子IFN-γ表達(dá)下降，Th2細(xì)胞因子IL-4表達(dá)升高，引起Th1、Th2細(xì)胞調(diào)節(jié)紊亂而導(dǎo)致AR的發(fā)生。IL-17 是Th17細(xì)胞的重要效應(yīng)因子，其主要功能是促進(jìn)炎性反應(yīng)。有學(xué)者[6]研究發(fā)現(xiàn)，在AR患者的血清中也檢測到IL-17，其表達(dá)水平明顯高于對照組。Ciprandi等[7]研究發(fā)現(xiàn)，AR患者血清中IL-17的水平與AR臨床癥狀的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。TGF-β1是影響Th17 細(xì)胞分化關(guān)鍵的細(xì)胞因子，同時(shí)也是Treg細(xì)胞功能的重要調(diào)節(jié)因子。低水平的TGF-β1能誘導(dǎo)RORγt 的產(chǎn)生，而高水平的TGF-β1 能夠上調(diào)Foxp3的表達(dá)，因此，細(xì)胞因子調(diào)節(jié)的RORγt / Foxp3 平衡決定了初始T細(xì)胞受抗原刺激后向Th17細(xì)胞或Treg細(xì)胞方向分化[8]。本研究結(jié)果顯示,AR組TGF-β1水平低于對照組。由此可推測，TGF-β1是調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞之間平衡穩(wěn)定的重要細(xì)胞因子。

綜上所述，AR患者外周血中Th1/Th2細(xì)胞和Th17/Treg細(xì)胞平衡在AR發(fā)病中可能起著關(guān)鍵作用，進(jìn)一步研究Th1/Th2細(xì)胞和Th17/Treg細(xì)胞功能可為AR的發(fā)病機(jī)制提供新的理論依據(jù)。

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(本文編輯楊美琴)

Expression of T cell subsets and related cytokines in peripheral blood of patients with allergic rhinitis and its significance

CHANGDe-long，JIAJian-ping，ZHANGWei，HUChen，LIHong-bo.

DepartmentofOtolaryngology-HeadandNeckSurgery,thePeople′sLiberationArmyNo. 463Hospital,Shenyang110000 ,China

LI Hong-bo, Email: gemmill1945@qq.com

ObjectiveTo investigate the expression of T lymphocyte subgroups, regulatory T cells and related cytokines in peripheral blood of patients with allergic rhinitis (AR).MethodsPeripheral blood from 34 AR patients (AR group) and 20 healthy volunteers (control group) was collected. Flow cytometry (FCM) was used to detect the percentage of helper T cell 1 (Th1 cell), Th2 cell, Th17 cell, CD4+CD25+regulatory T (Treg cell) and Foxp3+CD4+CD25+Treg cell, and the expression of interleukin 27 (IL-27), interferon γ (IFN-γ), IL-4, transforming growth factor β 1 (TGF-β1) and IL-17 in the peripheral blood. ResultsThe percentage of Th1 cells, Th17 cells and Th1/Th2 was all higher in AR group than those in the control group, while the percentage of Th2 cells was lower than that in the control group. The proportion of Th1/Th2 imbalance was obvious. The percentage of CD4+CD25+Treg cells and Foxp3+CD4+CD25+Treg cells was lower in AR group than those in the control group. The expression of IL-4 and IL-17 was higher in AR group than those in the control group, while IFN-γ, IL-27 and TGF-β1 was lower in AR group than those in the control group. ConclusionsThe imbalances of Th1/Th2 and Th17/Treg cells in the peripheral blood were the important causes of AR. (Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2016,16:319-321)

T-lymphocyte subsets; Cytokine; Rhinitis, allergic

遼寧省博士科研啟動(dòng)基金(201501135)

中國人民解放軍第463醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科沈陽110000

李洪波(Email: gemmill1945@qq.com)

10.14166/j.issn.1671-2420.2016.05.004

2015-10-13)