牛文亞

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院體育教學(xué)部，河南　新鄉(xiāng)　453003)

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康體訓(xùn)練聯(lián)合白藜蘆醇干預(yù)治療血管性癡呆大鼠模型的療效

牛文亞

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院體育教學(xué)部，河南新鄉(xiāng)453003)

目的研究康體訓(xùn)練聯(lián)合白藜蘆醇干預(yù)對(duì)血管性癡呆(VD)的治療作用。方法50只SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、VD模型組、白藜蘆醇組、康體訓(xùn)練組、康體訓(xùn)練聯(lián)合白藜蘆醇組。通過雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎法制備VD模型，各組大鼠按照分組原則進(jìn)行處理。8 w后對(duì)大鼠進(jìn)行認(rèn)知功能檢測(cè),同時(shí)對(duì)大鼠大腦神經(jīng)元進(jìn)行光鏡、電鏡檢測(cè)以及鈣離子檢測(cè)。結(jié)果通過大鼠跳臺(tái)試驗(yàn)、避暗試驗(yàn)和水迷宮試驗(yàn)可觀察到康體訓(xùn)練聯(lián)合白藜蘆醇組跳臺(tái)、避暗潛伏期明顯延長(zhǎng),通過水迷宮平臺(tái)次數(shù)增加明顯(P<0.05)。康體訓(xùn)練聯(lián)合白藜蘆醇組大鼠大腦神經(jīng)元損傷明顯減輕，鈣離子熒光明顯減弱。結(jié)論康體訓(xùn)練聯(lián)合白藜蘆醇干預(yù)對(duì)VD的治療效果優(yōu)于單獨(dú)的藥物治療。

血管性癡呆；康體訓(xùn)練；白藜蘆醇

血管性癡呆(VD)是由于缺血性或出血性腦血管疾病導(dǎo)致腦損害的一種臨床綜合征，以認(rèn)知功能異常為突出表現(xiàn)〔1〕。白藜蘆醇(Res)化學(xué)名為3，4'，5-三羥基芪，主要存在于葡萄、藜蘆、虎杖、漿果和花生等植物中〔2〕，具有抗氧化、改善VD患者認(rèn)知功能等作用〔3～5〕。有文獻(xiàn)報(bào)道，康復(fù)訓(xùn)練能增加VD患者長(zhǎng)時(shí)程記憶效應(yīng)，改善認(rèn)知功能〔6〕。如果Res聯(lián)合康復(fù)治療能夠進(jìn)一步改善VD患者認(rèn)知功能，將對(duì)VD的治療提供新的思路。本實(shí)驗(yàn)擬探討康體訓(xùn)練聯(lián)合Res干預(yù)VD的治療效果。

1　材料與方法

1.1材料雄性清潔級(jí)Sprague-Dawley(SD)大鼠50只，4～5月齡，體質(zhì)量180～220 g，許可證號(hào)：SYXK-豫-005-0012，河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物房溫度18℃～20℃，環(huán)境潔凈度5 000～8 000級(jí)，相對(duì)濕度40%～50%，每小時(shí)換氣20次，空氣流動(dòng)速度0.15～0.2 m/s，多級(jí)定向控制空氣壓差10%～15%，用自動(dòng)定時(shí)器控制光照期為7：00～19：00、黑暗期為19：00～07：00，飼料為常規(guī)大鼠飼料、飲水為二次凈化水。白藜蘆醇(重慶科瑞南海制藥有限責(zé)任公司)。主要儀器：電動(dòng)轉(zhuǎn)動(dòng)倉(安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司)，水迷宮(安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司)。

1．2方法

1．2．1VD模型制備取雄性清潔級(jí)SD大鼠，術(shù)前12 h禁食、4 h禁水。采用10%水合氯醛(0.33 ml/100 g)進(jìn)行腹腔注射麻醉，但保證術(shù)中自主呼吸。將大鼠仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，頸部備皮，消毒后頸部正中切口，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，在頸總動(dòng)脈的近心端及遠(yuǎn)心端分別以雙重“0”號(hào)線進(jìn)行結(jié)扎，從中間離斷，確保動(dòng)脈血流完全阻斷。手術(shù)切口給予2 ml慶大霉素后縫合創(chuàng)口，整個(gè)手術(shù)過程確保無菌操作。術(shù)后將大鼠移至通風(fēng)條件良好的動(dòng)物房繼續(xù)飼養(yǎng)。

1．2．2試驗(yàn)分組每組10只。①正常對(duì)照組：常規(guī)飼養(yǎng)24 w。②VD模型組：采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎(2VO)制備大鼠VD模型。③Res灌胃組：每天清晨空腹予Res溶液灌胃(灌胃濃度1.35 mg/kg，灌胃容量10 ml/kg)，連續(xù)8 w。④ 康體訓(xùn)練組：每日3次在電動(dòng)轉(zhuǎn)動(dòng)倉(轉(zhuǎn)速20 r/min，半徑20 cm)里面運(yùn)動(dòng)20 min，連續(xù)8 w。⑤ 康體訓(xùn)練聯(lián)合Res灌胃組：在電動(dòng)轉(zhuǎn)動(dòng)倉(半徑20 cm，轉(zhuǎn)速20 r/min)里面運(yùn)動(dòng)20 min，3次/d，連續(xù)8 w；每天清晨空腹予Res溶液灌胃給藥(灌胃濃度1.35 mg/kg，灌胃容量10 ml/kg)，連續(xù)8 w。

1.2.3光鏡觀察用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%水合氯醛麻醉處死大鼠，采用4%多聚甲醛固定大鼠的腦組織，石蠟包埋切片(切片厚3～4 μm)，HE染色并于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.4電子顯微鏡樣品制作觀察斷頭處死大鼠，取1 cm3的腦部正方形小塊，4%戊二醛磷酸緩沖液4℃固定，Epon812包埋劑包埋，超薄切片，鉛鈾雙染色，透射電鏡(日立，H-7500)觀察拍片。

1.2.5免疫熒光顯微鏡觀察處死大鼠，制作冰凍切片(厚20 μm)。分別采用Ca2+一抗(1∶800)和熒光標(biāo)記的二抗(1∶200)進(jìn)行孵育，熒光顯微鏡下觀察Ca2+在神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)的表達(dá)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS20.0軟件，計(jì)量資料組間比較采用單因素方差分析，SNK-q法進(jìn)行多重比較。

2　結(jié)　果

2.1大鼠跳臺(tái)試驗(yàn)康體訓(xùn)練組大鼠與VD模型組相比跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)的潛伏期明顯延長(zhǎng)(P<0.05)；康體訓(xùn)練聯(lián)合Res灌胃組與Res灌胃組比較(P<0.05)?？刁w訓(xùn)練組大鼠與VD模型組比較平均5 min錯(cuò)誤次數(shù)明顯減少(P<0.05)；康體訓(xùn)練聯(lián)合Res灌胃組與Res灌胃組相比，也有顯著性差異(P<0.05)。見表1。

表1　跳臺(tái)試驗(yàn)結(jié)果

與VD模型組比較：1)P<0.05；與Res灌胃組比較:2)P<0.05；下表同

2.2大鼠避暗試驗(yàn)康體訓(xùn)練組大鼠與VD模型組比較避暗試驗(yàn)的潛伏期明顯延長(zhǎng)(P<0.05)；康體訓(xùn)練聯(lián)合Res灌胃組與Res灌胃組相比較(P<0.05)?？刁w訓(xùn)練組大鼠與VD模型組比較平均5 min錯(cuò)誤次數(shù)明顯減少(P<0.05)；康體訓(xùn)練聯(lián)合Res灌胃組與Res灌胃組相比較，有顯著性差異(P<0.05)。見表2。

2.3大鼠水迷宮試驗(yàn)康體訓(xùn)練組大鼠與VD模型組比較通過平臺(tái)次數(shù)明顯增加(P<0.05)；康體訓(xùn)練聯(lián)合Res灌胃組與Res灌胃組相比較，也有顯著性差異(P<0.05)。各組的總游泳距離和平均游泳速度比較無明顯差異。見表3。

表2　避暗試驗(yàn)結(jié)果

表3　水迷宮試驗(yàn)結(jié)果

2.4大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元染色Res灌胃組和康體訓(xùn)練組與模型組相對(duì)比，大鼠海馬CA1區(qū)的三層錐體細(xì)胞呈現(xiàn)規(guī)則排列；未發(fā)現(xiàn)明顯細(xì)胞腫脹，細(xì)胞炎癥無明顯浸潤(rùn)，無增生的星形膠質(zhì)細(xì)胞；錐體細(xì)胞形態(tài)基本正常，未見變小或胞體呈三角形，頂樹突無明顯延長(zhǎng)，核固縮現(xiàn)象及核破裂現(xiàn)象不明顯，胞質(zhì)呈均勻的嗜伊紅改變；部分錐體細(xì)胞核形態(tài)無明顯異常，無明顯的胞質(zhì)疏松和微空泡形成現(xiàn)象；在血管周圍無明顯紅細(xì)胞滲出，未見小血管增生現(xiàn)象。表明Res灌胃組及康體訓(xùn)練組對(duì)VD具有明顯的抑制作用并且康體訓(xùn)練聯(lián)合Res灌胃組的抑制作用優(yōu)于Res灌胃組和康體訓(xùn)練組。見圖1。

圖1　大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元染色結(jié)果(HE，×400)

2.5大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元電鏡結(jié)果Res灌胃組和康體訓(xùn)練組對(duì)比，鏡下見血腦屏障內(nèi)膜平滑；海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞體皺縮和膜結(jié)構(gòu)模糊不清現(xiàn)象基本消失。而VD模型組可見細(xì)胞質(zhì)內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體出現(xiàn)腫脹，部分線粒體嵴融合或空泡樣變性，細(xì)胞核固縮，雙層核膜消失，核周呈鋸齒狀，異染色質(zhì)明顯邊集；Res灌胃組及康體訓(xùn)練組對(duì)VD都具有明顯的抑制作用，神經(jīng)元形態(tài)改變不明顯，細(xì)胞內(nèi)線粒體的腫脹較少，細(xì)胞核膜清晰，邊界清楚圓潤(rùn)，無異染色質(zhì)邊集現(xiàn)象?？刁w訓(xùn)練聯(lián)合Res灌胃組的抑制作用優(yōu)于Res灌胃組和康體訓(xùn)練組，其形態(tài)趨于正常對(duì)照組。見圖2。

2.6大鼠海馬區(qū)鈣離子熒光試驗(yàn)結(jié)果VD模型組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元鈣離子熒光顯色明顯增強(qiáng)，而康體訓(xùn)練組和Res灌胃組與模型組相比熒光顯色減弱，康體訓(xùn)練聯(lián)合Res灌胃組熒光減弱更加明顯?？梢奟es灌胃組及康體訓(xùn)練組對(duì)VD具有明顯的抑制作用，并且康體訓(xùn)練聯(lián)合Res灌胃組的抑制作用優(yōu)于Res灌胃組和康體訓(xùn)練組。見圖3。

圖2　大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元電鏡結(jié)果(×12 000)

圖3　大鼠海馬區(qū)鈣離子熒光試驗(yàn)結(jié)果(×100)

3　討　論

VD是腦血管病的常見并發(fā)癥，其發(fā)病機(jī)制目前認(rèn)為主要包括自由基損傷，興奮性氨基酸對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的毒性等。因此，使用自由基清除劑和興奮性氨基酸抑制劑可能會(huì)延緩腦血管病的發(fā)生與發(fā)展并有助于防治VD〔7，8〕。Res具有的抗氧化、神經(jīng)保護(hù)作用能對(duì)癡呆起到延緩效果，通過對(duì)腦神經(jīng)元細(xì)胞器的進(jìn)一步研究表明，Res具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用〔9〕。Res自身為植物雌激素，雌激素對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有促進(jìn)神經(jīng)元再生和抽芽及多種血管調(diào)節(jié)作用。據(jù)國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道，雌激素替代治療可以減輕實(shí)驗(yàn)性腦缺血損傷；流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果也顯示，女性絕經(jīng)期后雌激素水平下降與心腦血管病的發(fā)生有緊密的關(guān)系，補(bǔ)充雌激素可有效減輕缺血性腦損傷且具有神經(jīng)保護(hù)作用。

本研究提示，與VD模型組相比較，康體訓(xùn)練聯(lián)合用藥組跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)和避暗實(shí)驗(yàn)的潛伏期明顯延長(zhǎng)，大鼠通過平臺(tái)次數(shù)與VD模型組比較明顯增加，大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元損傷明顯減輕，鈣離子熒光明顯減弱。提示康體訓(xùn)練聯(lián)合Res治療能明顯改善慢性缺血后大鼠的認(rèn)知功能，效果優(yōu)于單獨(dú)的藥物治療。

康復(fù)訓(xùn)練改善VD大鼠認(rèn)知功能障礙可能與改善雌激素從而減少海馬神經(jīng)元缺血壞死，減輕腦組織不可逆損害有關(guān)〔10～12〕。本研究發(fā)現(xiàn)，康體訓(xùn)練聯(lián)合Res治療對(duì)VD有明顯的抑制作用,這將為更好地了解VD的發(fā)病機(jī)制以及通過康體訓(xùn)練治療VD提供新的靶點(diǎn)。

1Lewis PR,著.高旭光,主譯.MERRT'S 神經(jīng)病學(xué)〔M〕.沈陽:遼寧科學(xué)技術(shù)出版社,2002:6.

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3Hung LM，Chen JK，Huang SS，etal．Cardioprotective effect of resveratrol，a natural antioxidant derived from grapes〔J〕.Cardiovasc Res，2000;47(3)：549-55．

4Goh SS，Woodman OL，Pepe S，etal．The red wine antioxidant resveratml prevents cardiomyocyte injury following ischemia-reperfusion via multiple sites and mechanisrm〔J〕.Antioxid Redox Signal，2007;9(1)：101-13．

5Ekshyyan VP，Hebert VY，Khandelwal A，etal．Resveratrol inhibits rat aortic vascular smooth muscle cell proliferation via estrogen receptor dependent nitric oxide production〔J〕.J Cardiovasc Pharmacol，2007;50(1)：83-93．

6王紅衛(wèi),葉青，黃雁，等.康復(fù)訓(xùn)練對(duì)血管性癡呆大鼠胰島素抵抗及海馬胰島素降解酶的影響〔J〕.中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2013;38(11):1167-71.

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〔2015-12-24修回〕

(編輯袁左鳴)

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81200836)；河南省科技廳科技攻關(guān)項(xiàng)目(132102310247)；新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院重點(diǎn)研究領(lǐng)域招標(biāo)課題資助項(xiàng)目(ZD2011-30)；新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院培育基金(2014QN153、2014YB221)

牛文亞(1981-)，男，碩士，講師，主要從事運(yùn)動(dòng)生理學(xué)研究。

R749.1

A

1005-9202(2016)15-3612-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.15.002