徐小婷　徐應(yīng)淑　王　森　張云莉

(遵義醫(yī)學(xué)院藥劑學(xué)教研室，遵義，563006)

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復(fù)方石斛的提取工藝研究

徐小婷徐應(yīng)淑王森張云莉

(遵義醫(yī)學(xué)院藥劑學(xué)教研室，遵義，563006)

目的：優(yōu)選復(fù)方石斛最佳提取工藝。方法：以粗多糖、總黃酮、石斛堿的含量及干膏率為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)法，利用多指標(biāo)綜合評價的方法及對權(quán)重系數(shù)的設(shè)置，優(yōu)先最佳提取工藝。結(jié)果：復(fù)方石斛最佳提取工藝：10倍量的70%乙醇和水各回流120 min。結(jié)論：該優(yōu)化工藝客觀可行，穩(wěn)定可靠，可為復(fù)方石斛的工業(yè)生產(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

復(fù)方石斛；粗多糖；總黃酮；石斛堿；提取工藝

復(fù)方石斛是本課題組正在研發(fā)的治療高血脂的中藥新藥，其能有效調(diào)節(jié)大鼠血脂代謝水平，且能提高機(jī)體的抗氧化能力和改善肝組織脂肪變性，具有良好的發(fā)展前景。故本實(shí)驗(yàn)以粗多糖、總黃酮、石斛堿和得膏率為指標(biāo)，選擇乙醇濃度、提取時間及溶劑用量為考察因素，通過正交設(shè)計試驗(yàn)優(yōu)選復(fù)方石斛的提取工藝，為該制劑工業(yè)生產(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料

1.1受試藥物金釵石斛購于貴州省赤水市信天中藥產(chǎn)業(yè)開發(fā)有限公司，山楂、決明子等藥材均購自四川新荷花中藥飲片股份有限公司，經(jīng)遵義醫(yī)學(xué)院藥劑教研室王森副教授鑒定均符合《中國藥典》2010年版相關(guān)要求；D-無水葡萄糖對照品：上海君創(chuàng)生物科技有限公司，批號：7443C；石斛堿對照品：中國食品藥品檢定研究院，批號：111876-201102；蘆丁對照品：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司，批號：F20110406；甲醇為色譜純，其余試劑為分析純。

1.2儀器Agilent-7890A型氣相色譜儀：安捷倫科技有限公司；TU-1901雙光束紫外可見光分光光度計：北京普系統(tǒng)用儀器有限責(zé)任有限公司；TDL-80-2B型低速臺式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；ME204E電子天平：梅特勒-托利多儀器上海有限公司。

2　方法

2.1粗多糖含量測定

2.1.1葡萄糖對照品溶液的制備精密稱取D-無水葡萄糖對照品15 mg，加水定容至100 mL。

2.1.2供試品溶液的制備按處方量稱取藥材20 g提取，精密量取提取液3 mL，加無水乙醇15 mL搖勻，4 ℃放置12 h，3 500 r/min離心10 min，沉淀用20 mL無水乙醇洗滌、離心，沉淀物加水定容至50 mL容量瓶中，過0.45 μm濾膜，待測。

2.1.3測定方法在10 mL的具塞比色管中加入400 μL的葡萄糖對照品溶液，并用蒸餾水補(bǔ)至800 μL，加入800 μL的5%苯酚溶液，再加入2 mL的濃硫酸，混勻，室溫放置5 min，沸水中煮15 min，取出，置冰浴中冷卻5 min，同法以蒸餾水為空白對照，于400～700 nm波長范圍內(nèi)掃描得到紫外吸收光譜。在最大吸收波長490 nm處測定吸光度為A。

2.1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密移取葡萄糖對照品溶液160，240，320，400，480，560，640 μL，按照“2.1.3”項下方法測定吸光度值，并根據(jù)A和濃度(c:mg/mL)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程A=2.9229c-0.003，相關(guān)系數(shù)r=0.9995，線性范圍0.030～0.135 mg/mL。

2.2總黃酮含量測定

2.2.1蘆丁對照品溶液的配制精密稱取蘆丁對照品10 mg，用無水乙醇定容至50 mL量瓶中。

2.2.2供試品溶液的制備取“2.1.2”中的上清液及洗滌液用無水乙醇定容至50 mL量瓶中，過0.45 μm濾膜，待測。

2.2.3測定方法在10 mL的具塞比色管中加入1.0 mL蘆丁對照品溶液，并用蒸餾水補(bǔ)至2.4 mL，加入5%亞硝酸鈉溶液0.4 mL，混勻，放置6 min，再移取10%硝酸鋁溶液0.4 mL，搖勻，放置6 min，再取氫氧化鈉試液4 mL，再加水至刻度線，搖勻，放置15 min，同法以蒸餾水為空白對照，于400～700 nm波長范圍內(nèi)掃描得到紫外吸收光譜。在最大吸收波長510 nm處測定吸光度為A。

2.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密移取蘆丁對照品溶液0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mL，按照“2.2.3”項下方法測定吸光度值，并根據(jù)A和濃度(c:mg/mL)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為A=3.1291c+0.0464，相關(guān)系數(shù)r=0.9997，線性范圍0.0589～0.2063 mg/mL。

2.3石斛堿含量測定

2.3.1石斛堿對照品溶液的配制精密稱取石斛堿對照品5 mg，用無水甲醇定容至50 mL量瓶中。

2.3.2供試品溶液的制備精密量取提取液4 mL于25 mL量瓶中，加入0.05%甲酸的甲醇溶液適量，超聲30 min后，放冷，用0.05%甲酸的甲醇溶液定容，混勻，過0.45 um濾膜，待測。

2.3.3陰性溶液的制備稱取處方量缺金釵石斛的其他藥材提取，按“2.3.2”項下方法制備陰性溶液。

2.3.4色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)HP-5毛細(xì)管柱(5%甲基苯硅氧烷為固定相，柱長為30 m，內(nèi)徑為0.32 mm，膜厚度為0.25 μm)，程序升溫：初始溫度為80 ℃，以10 ℃/min的速率升溫至250 ℃，保持5 min；進(jìn)樣口溫度為250 ℃，檢測器溫度為250 ℃；氫氣：30 mL/min，空氣：400 mL/min，尾吹：25 mL/min；進(jìn)樣方式：直接進(jìn)樣。按此色譜條件對供試品溶液進(jìn)行測定，石斛堿色譜峰分離良好，見圖1～3。

2.3.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密移取石斛堿對照品溶液0.5，1，1.5，2，2.5，3 mL，用甲醇定容與10 mL容量瓶中，過濾后分別進(jìn)樣1 μL，測峰面積。以石斛堿的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程Y=2.298X-5.528，r=0.9995，線性范圍0.005～0.030 mg/mL。

圖1　供試品溶液的氣相色譜圖

圖2　石斛堿對照品的氣相色譜圖

圖3　不含金釵石斛的陰性溶液的氣相色譜圖

2.4浸膏得率的測定[1]精密量取樣品液25 mL至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后在105 ℃干燥箱中干燥5 h，于干燥器內(nèi)冷卻至室溫，待恒重時精密稱定，計算總固體得率。

2.5提取工藝研究

2.5.1因素水平的確設(shè)定和正交試驗(yàn)結(jié)果通過查找文獻(xiàn)[2-5]及前期研究中的單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定了該復(fù)方采用先醇提后水提，并篩選出各因素中的三個水平進(jìn)行正交設(shè)計，選取醇濃度(A)、提取時間(B)、溶劑用量(C)為考察因素，以粗多糖、總黃酮、石斛堿和干膏率的綜合評分為指標(biāo)，綜合評分=粗多糖×2.5+總黃酮×3.5+石斛堿×2+干膏率×2。按照處方比例精密稱取5味藥材，共9份，每份20 g，選擇L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，并按上述方法檢測各指標(biāo)，結(jié)果見表1，方差分析見表2。

由直觀分析可知，各因素對粗多糖、總黃酮、石斛堿含量及干膏率的影響順序?yàn)锳>B>C；以極值最小的D因素為誤差項進(jìn)行方差分析，表明A和B因素對提取工藝具有顯著性影響，C因素則無顯著性影響，結(jié)合生產(chǎn)成本考慮，確定最佳工藝組合為10倍量的70%醇和水各回流120 min。

2.5.2驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)按優(yōu)選的提取工藝進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果粗多糖、總黃酮、石斛堿及干膏率的平均值分別為20.50 mg/g、34.03 mg/g、55.17 g/g、31.5%，RSD分別為3.39%、1.70%、2.39%、1.2%，表明該工藝穩(wěn)定可行。

表1　復(fù)方石斛提取工藝的實(shí)驗(yàn)安排與直觀分析結(jié)果

表2　正交設(shè)計方差分析

注：F0.05(2,2)=19。

3　討論

在復(fù)方石斛中山楂和銀杏葉為君藥，其黃酮類化合物可通過不同通道，不同位點(diǎn)阻止脂質(zhì)沉積，到達(dá)防治高血脂癥狀[6-9]，故綜合評分時其權(quán)重系數(shù)為3.5；考慮該復(fù)方后續(xù)將研制成顆粒劑，而金釵石斛、丹參等中的多糖不僅具有降血脂和護(hù)肝作用，還能起到較味功能[10-11]，故權(quán)重系數(shù)為2.5；金釵石斛是珍稀名貴中藥材，為便于控制其在制劑中的含量，防止在生產(chǎn)過程中，貴重藥材不投料或少投料的現(xiàn)象發(fā)生[12]，選取其石斛堿作為檢測指標(biāo)之一，且權(quán)重系數(shù)為2；干膏率的大小與服用量的密切相關(guān)，因而權(quán)重系數(shù)為2。此外，考慮以粗多糖、總黃酮、石斛堿的含量為指標(biāo)，同時兼顧到其均有較成熟、穩(wěn)定的定量方法[13-14]。

中藥提取是生產(chǎn)過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本文的工藝路線設(shè)計充分考慮到處方中各位藥材的主要成分，其即包含脂溶性成分又含有水溶性成分，故采用醇提完再水提，使其有效成分得到有效保留，充分發(fā)揮藥效作用。預(yù)實(shí)驗(yàn)中對該復(fù)方還進(jìn)行了單因素研究，其中也包括對提取次數(shù)的研究，以乙醇和水為溶媒進(jìn)行分別提取為一次，共提取三次，得出當(dāng)提取次數(shù)增加時，其粗多糖、總黃酮、石斛堿的含量基本不變，因而正交試驗(yàn)中不考慮提取次數(shù)這一因素。中藥藥味較多，其中所含的活性成分復(fù)雜，采用多個有效的指標(biāo)考察其提取工藝，能夠更合理、科學(xué)地考察提取工藝。本文以總黃酮、粗多糖、石斛堿及干膏率為評價指標(biāo)，通過其權(quán)重的差異進(jìn)行綜合評分優(yōu)選提取工藝，并進(jìn)行方差分析，結(jié)果顯示優(yōu)選的提取工藝重復(fù)性好，可操作性強(qiáng)，該工藝適合工業(yè)大生產(chǎn)。

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(2015-06-22收稿責(zé)任編輯：張文婷)

The Extraction Process of Compound Dendrobium

Xu Xiaoting, Xu Yingshu, Wang Sen, Zhang Yunli

( Zunyi Medical College, Zunyi 563006, China)

Objective:To establish the optimal extraction technology for compound dendrobium. Methods:To use the content of crude polysaccharide, flavonoids, dendrobine and the extraction rate as indexes and use the method of multi-index comprehensive evaluation and setting of weight coeffficient to choose the best extraction technology by the orthogonal design. Results:The optimum conditions was 10 times of 70% alcohol and water reflux 120min respectively. Conclusion:The optimal extraction is objective, feasible, stable and reliable, which provides experimental basis for industrial production of compound dendrobium.

Compound dendrobium; Crude polysaccharide; Flavonoids; Dendrobine; Extraction process

貴州省赤水市科技局項目(編號：赤中藥科合[2013]號)；貴州省中醫(yī)藥管理局項目(編號：QZYY2012-52)

徐小婷(199007—)，女，本科，初級藥師，在讀研究生，研究方向：新藥研究與開發(fā)，E-mail：920434389@qq.com

徐應(yīng)淑(197609—)，女，碩士，教授，主任，研究方向：新藥研究與開發(fā)，E-mail：527822816@qq.com

R284.2

A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.01.039