范海濤，劉莊，張照康，程湘懿，喬善義

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一種毛尖茶葉多糖MTP06的提取分離及其活性測定

范海濤1,2，劉莊3，張照康4，程湘懿4，喬善義2*

1. 北京電子科技職業(yè)學院生物工程學院，北京 100176；2. 軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所，北京 100850；3. 北京聯合大學校醫(yī)院，北京 100101；4. 華中師范大學物理科學與技術學院生物物理研究所，湖北武漢 100191

本研究對一種毛尖茶葉多糖的結構與活性開展了研究。采用水提醇沉法提取毛尖茶葉粗多糖，經除蛋白后得到精制多糖（MP），以不同的柱層析方法對MP進行多次分離純化，得到1個均一組分的毛尖茶葉多糖（Maojian Tea Polysaccharides No. 06，MTP06）。采用1,1–二苯基–2–三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl) hydrazyl，DPPH）自由基清除、小鼠免疫細胞RAW264.7增殖、吞噬能力和產生NO等試驗方法對MTP06的活性進行研究。結果顯示MTP06對0.1?mmol·L-1DPPH溶液的自由基清除率為30.85%，對小鼠巨噬細胞RAW264.7的增殖、吞噬能力和產生NO的能力均有促進作用，與空白對照組間有顯著差異（＜0.01），且質量濃度為500?mg·L-1時，活性最大。

毛尖茶葉；多糖；活性；免疫細胞

我國茶葉資源豐富，飲用歷史悠久，茶葉中多種有效成分具有降血糖、降血脂、抗氧化、清除自由基、提高免疫力和抗腫瘤等活性[1-2]。多糖（Polysaccharides）是由單糖連接形成的大分子物質。據文獻報道，諸多植物來源的多糖具有抗氧化、清除自由基和免疫活性，是部分天然食品提高免疫力、發(fā)揮保健功能的物質基礎之一[3-4]。茶葉中也含有多糖類成分，并且針對茶多糖的抗氧化、清除自由基等活性的研究多有報道。Wang Y等[5-6]闡明了茶葉多糖抗氧化及作用于人體細胞的藥理活性，為研究和理解茶葉多糖的藥理活性提供了依據。毛尖茶葉作為公認的茶葉重要品種，目前研究內容主要集中在多糖的提取工藝、含量測定、抗氧化活性等方面[7-8]，對毛尖茶葉多糖的免疫活性研究至今未見報道。本研究通過提取和分離純化，從毛尖茶葉中得到1個均一組分MTP06，并對其進行特征分析和免疫活性測定，為毛尖茶葉的開發(fā)利用提供依據。

1材料與方法

1.1 儀器

CARY 50全波長紫外掃描儀（美國Varian公司），WZZ-2S自動旋光儀（上海精密科學儀器有限公司），Agilent 7890A-5975C氣相色譜-質譜聯用儀、DB-5色譜柱（30?m×0.25?mm，0.25?μm）、質譜檢測器、AgilentAgilent1200高效液相色譜儀，G1352A RID檢測器（美國Agilent科技有限公司），TSK?G5000PWXL凝膠色譜柱（300?mm×7.8?mm）、LABORATA 4000旋轉蒸發(fā)儀（德國Heidolph公司），AR224CN電子天平（美國Ohaus公司），TD5A-WS高速離心機（上海安亭科學儀器廠），ZRQ30冷凍干燥機（天津因賽科技發(fā)展有限公司），WF2 UV-2100紫外可見分光光度計（尤尼柯（上海）儀器有限公司）。

1.2 材料與試劑

毛尖茶葉，購于吳裕泰北京北苑店（產地：河南信陽）。留樣標本存于北京聯合大學校醫(yī)院實驗室標本保存室（編號20150822–1）。RAW264.7巨噬細胞由北京大學醫(yī)學部惠贈。

DMEM培養(yǎng)基（中科邁晨（北京）科技有限公司）、胎牛血清（德國PAN優(yōu)級，北京華美蘭博生物科技有限公司）、一氧化氮（NO）測定試劑盒（硝酸還原酶法）（南京建成生物工程研究所）、1,1–二苯基–2–三硝基苯肼（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2- Diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl) hydrazyl, DPPH, 美國Sigma-Aldrich公司）。多糖分子量測定用系列標準品（分子量分別為12?000、25?000、50?000、80?000、270?000、410?000、670?000?Da，美國Sigma-Aldrich公司）。透析袋（截留分子量2?000?Da，美國MYM生物科技有限公司）。葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、氯化鈉、三氯甲烷、正丁醇和無水乙醇等試劑均為分析純。

1.3 實驗方法

1.3.1 毛尖茶葉多糖的提取

稱取1?250?g毛尖茶葉，以無水乙醇回流提取2次，殘渣按照文獻[8]中多糖的提取方法提取粗多糖，并以Sevag法除蛋白直至全波長紫外掃描280?nm處無明顯吸收峰，再以無水乙醇、丙酮反復洗滌得到毛尖茶葉精制多糖。

1.3.2 毛尖茶葉多糖的分離純化

稱取毛尖茶葉精制多糖8.72?g，用蒸餾水溶解，以DEAE DE-52離子交換色譜柱分離，分別采用蒸餾水及0.2、0.4、0.6?mol·L-1NaCl溶液洗脫，每個部位收集約5.0?L。將用0.2?mol·L-1NaCl洗脫的部分濃縮后置于透析袋中，進行透析，之后以Sepharose CL-6B瓊脂糖凝膠柱進行分離純化，以水為流動相進行洗脫，洗脫速度為1?mL·min-1，以收集器收集洗脫部分，每管收集洗脫液約3?mL，將各管洗脫液以高效液相色譜法檢測，合并相同峰的洗脫液，最終得到1個單一對稱峰的毛尖茶葉多糖組分，該組分命名為MTP06（Maojian Tea Polysaccharides No. 06）。

1.3.3 旋光度測定

精密稱定MTP06 10.0?mg置25?mL容量瓶中，用水溶解，配制成質量濃度為0.4?g·L-1的多糖溶液。取20?mL上述溶液置于旋光管中，以水為空白，用自動旋光儀測量MTP06旋光度。

1.3.4 分子量分布的測定

以HPLC法對系列多糖標準溶液和MTP06溶液進行測定。色譜柱為TSK?G5000PWXL（300?mm×7.8?mm）凝膠色譜柱；柱溫40℃；流動相為0.002?mol·L-1磷酸二氫鈉（含0.05% NaN3）；流速為0.8?mL·min-1；RI檢測器檢測。

分別稱取適量的分子量為12?000、25?000、50?000、80?000、270?000、410?000、670?000?Da的Dextran標準品，加入去離子水，配成質量濃度約2?g·L-1的對照溶液，并以0.45?μm水系濾膜過濾，進行HPLC檢測，以保留時間（RT）為橫坐標，分子量的常用對數（以10為底數的對數）值為縱坐標，得標準曲線=－0.332＋10.224（=0.9980）。

稱取一定量的MTP06，加入去離子水，配成質量濃度約2?g·L-1的樣品溶液，按上述方法進行檢測，由MTP06保留時間依上述標準曲線公式進行計算。

1.3.5 單糖組成的測定

按照文獻[9]所述方法對MTP06進行全水解還原乙?；苌?，以標準單糖為參照，對MTP06進行單糖組成的測定。

氣相條件為采用DB-5（30?m×0.25?mm× 0.25?μm）色譜柱；檢測器為質譜檢測器；進樣口溫度250℃；檢測器溫度280℃；氮氣流速0.6?mL·min-1；分流比20∶1；進樣量5?μL；升溫程序為200℃保持2?min，以3℃·min-1的速率升至245℃，再以10℃·min-1的速率升至270℃，保持2?min。

1.3.6 MTP06清除自由基活性測定

按照文獻[10]所述方法對MTP06進行清除自由基活性測定，重復6次，以樣品對DPPH自由基的清除率作為評價指標。

1.3.7 MTP06對小鼠巨噬細胞增殖的影響

按照文獻[11]所述方法，以96孔板測定MTP06對RAW 264.7小鼠巨噬細胞增殖能力的影響。設1個空白對照組和6個給藥組，給藥組細胞分別給予終質量濃度為30、90、150、300、500、800?mg·L-1的多糖溶液。細胞給藥后在5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24?h，然后吸去培養(yǎng)液，每孔加入20?μL MTT，上述條件下繼續(xù)培養(yǎng)4?h，棄上清，每孔加入150?μL DMSO，振蕩器上震蕩10?min，酶標儀570?nm波長檢測吸光值，以空白對照組的吸光值為100%，通過各給藥組與對照組的吸光度比值計算細胞相對增殖率。

1.3.8 MTP06對小鼠巨噬細胞吞噬能力的影響

按照文獻[12]所述方法，以中性紅作為目標異物，以96孔板測定MTP06對RAW264.7小鼠巨噬細胞吞噬能力的影響，分組及給藥情況同1.3.7。細胞給藥后在5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24?h后，每孔加720?mg·L-1的中性紅溶液100?μL，將細胞在5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24?h后，吸去培養(yǎng)液，每孔加入50?μL冰醋酸及50?μL乙醇，置于4℃冰箱中2?h。從冰箱中取出96孔板，置于振蕩器上震蕩10?min，酶標儀495?nm波長檢測吸光值，以空白對照組的吸光值為100%，以各給藥組與對照組的吸光度比值計算細胞相對增殖率。

1.3.9 MTP06對小鼠巨噬細胞產生NO的影響

采用硝酸還原酶法測定細胞培養(yǎng)上清液中NO2－間接反應生成NO的量，分組及給藥情況同1.3.7，增加1個細菌脂多糖（LPS）陽性對照組，給予終質量濃度為10?mg·L-1的LPS。將細胞給藥后在5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24?h后，按照NO檢測試劑盒說明書進行操作，于酶標儀495?nm波長檢測吸光值，以吸光值反映細胞產生NO的能力。

1.4 數據統(tǒng)計分析方法

以正版Graphpad prism 5軟件對數據進行處理和作圖，以雙側檢驗對實驗結果進行統(tǒng)計分析，以<0.01或<0.05為有統(tǒng)計學差異的檢驗標準。

2結果與分析

2.1 MTP06的特征分析結果

經計算，MTP06旋光度為[ɑ]20D=+39.0°。HPLC色譜圖見圖1，經標準曲線計算，其重均分子量（Molecular Weight，Mw）為2.2×105Da。測得MTP06由阿拉伯糖、木糖、葡萄糖和半乳糖組成，摩爾比為2.03∶1∶7.81∶1.18。

圖1 MTP06的高效液相色譜圖

2.2 MTP06清除自由基活性測定結果

MTP06對濃度0.1?mmol·L-1的DPPH溶液的自由基清除率為30.85%（RSD=4.91%）。

2.3 MTP06對小鼠巨噬細胞增殖的影響

不同濃度的MTP06對小鼠巨噬細胞增殖的影響見圖2。從圖中可知，不同濃度的MTP06溶液對細胞的增殖作用影響不同，在30~500?mg·L-1的范圍內，多糖給藥組與空白對照組有顯著性差異，隨著濃度的增大，對細胞的增殖促進作用逐漸增強，并在質量濃度為500?mg·L-1時達到最大值。

注：與空白對照組比較，*：P<0.05；**P<0.01。Note: Compare with control, *:P<0.05, ** P<0.01.

2.4 MTP06對小鼠巨噬細胞吞噬能力的影響

不同濃度的MTP06對小鼠巨噬細胞吞噬能力的影響見圖3。從圖中可知，不同濃度的MTP06溶液對細胞吞噬能力的影響不同，在30~500?mg·L-1的范圍內，多糖給藥組與空白對照組有顯著性差異，且隨著MTP06濃度的增大，細胞的吞噬能力逐漸增強，并在質量濃度為500?mg·L-1時細胞的吞噬能力達到最大值。

注：與空白對照組比較，**：P<0.01。Note: Compare with control, **: P<0.01.

2.5 MTP06對小鼠巨噬細胞產生NO的影響

不同質量濃度給藥條件下NO的產生量結果見圖4。從圖中可知，不同濃度的MTP06溶液對細胞產生NO的影響不同，在300~800?mg·L-1的范圍內，MTP06處理細胞產生NO的量與陽性對照LPS組相當，且與空白對照組間均有顯著差異，并且當MTP06質量濃度為500?mg·L-1時，細胞產生NO的量達到最大。

注：與空白對照組比較，**：P<0.01。1-MTP06 0 mg·L-1，2- MTP06 30 mg·L-1，3- MTP06 90 mg·L-1，4- MTP06 150 mg·L-1，5- MTP06 300 mg·L-1，6- MTP06 500 mg·L-1，7- MTP06 800 mg·L-1，8-LPS。

3討論

本研究首次從毛尖茶葉中分離純化得到1個均一分子量的多糖成分MTP06，并進行了單糖組成與分子量分布的分析，對該多糖成分進行了表征。以不同藥理活性檢測方法，研究了MTP06的藥理活性，為該多糖及其他毛尖茶葉多糖的開發(fā)利用提供了實驗依據。

藥理實驗結果表明，MTP06具有一定的清除DPPH自由基的能力，可能是毛尖茶葉作為茶飲品產生保健功效的活性來源之一，該結果與其他研究者的研究結果趨于一致[8]，進一步肯定了毛尖茶葉多糖成分的清除自由基活性。

在以RAW264.7細胞為體外藥理模型的活性測試中，考察了不同質量濃度MTP06對小鼠巨噬細胞不同生理指標的影響，在30~ 500?mg·L-1范圍內，隨著給藥質量濃度的增加，MTP06促進小鼠巨噬細胞的增殖能力，細胞吞噬和產生NO的能力增強，顯示了毛尖茶葉多糖產生的免疫促進作用，為該多糖的進一步深入研究提供了實驗參考。當MTP06質量濃度過高時，相應以上指標反而出現下降，推測與大劑量MTP06作用于細胞，干擾了細胞代謝或產生了細胞毒作用有關。該實驗結果為客觀認識毛尖茶葉及其多糖成分，以及進一步開發(fā)利用毛尖茶葉提供了參考。

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Purification and Activity Determinationof Polysaccharides MTP06 from Maojian Tea

FAN Haitao1,2，LIU Zhuang3，ZHANG Zhaokang4，CHENG Xiangyi4，QIAO Shanyi2*

1. College of Bioengineering, Beijing Polytechnic, Beijing 100176, China; 2. Institute of Pharmacology and Toxicology, Academy of Military Medical Sciences , Beijing 100850, China; 3. Hospital of Beijing Union University, Beijing 100101, China;4.Department of Physics and Institute of Biophysics, Central China Normal University, Wuhan 100191, China

To investigate the structure and activity of polysaccharides (MTP06), the polysaccharides were extracted and purified from Maojian tea. The refined Maojian tea polysaccharides (MP) were obtained after removing proteins. Different column chromatography methods were used for several times to purify the MP and an uniform polysaccharide named MTP06 was obtained. The effects of MTP06 on DPPH radical-scavenging activity, cell viability, engulfment capability and NO production of RAW264.7 macrophages were investigated . The results showed that the free radical scavenging rate of MTP06 to 0.1?mmol·L-1DPPH solution was 30.85%.The highest viability, engulfment capability and NO production of RAW264.7 macrophages had been stimulated by MTP06 at 500?mg·L-1. The present results confirmed MTP06 can eliminate DPPH radicals and stimulate cell viabilities.

Maojian tea, polysaccharides, activity, macrophages

TS272；Q539

A

1000-369X（2016）05-531-06

2016-02-15

2016-05-30

北京電子科技職業(yè)學院重點課題項目資助、國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項（2013ZX09508-105）資助。

范海濤，男，講師，主要從事天然來源多糖的分離、結構鑒定與活性的研究。

crbj611202@sina.com