丁秀勇　何文欣　張汝祥　陳婧

·實(shí)驗(yàn)研究·

豚鼠電刺激頻率跟隨反應(yīng)初步研究*

丁秀勇1何文欣2張汝祥3陳婧2

目的探索豚鼠聽覺系統(tǒng)對電刺激信號是否存在頻率跟隨現(xiàn)象。方法經(jīng)圓窗龕使用純音和白噪音電信號對豚鼠耳蝸行電刺激，記錄其頭皮電反應(yīng)，經(jīng)Matlab信號疊加和偽跡去除，計(jì)算EFFR信號相對幅度、輸入輸出函數(shù)，處死豚鼠和使用電阻代替豚鼠后記錄EFFR變化驗(yàn)證EFFR來源。結(jié)果純音電信號可誘發(fā)具有明顯的周期性的EFFR信號，在797Hz和1597Hz所記錄EFFR到的相對幅度（RA）均值明顯高于白噪音RA均值（P＜0.05）；797Hz純音電信號輸出幅度隨著刺激電刺激幅度增長呈非線性改變，呈現(xiàn)神經(jīng)反應(yīng)特有的閾值特性與飽和特性；豚鼠死亡前后EFFR的RA值差異具有高度顯著性（P＜0.001），豚鼠EFFR的RA值與使用電阻記錄的RA值差異具有顯著性（P＜0.05）。結(jié)論聽力正常豚鼠聽覺系統(tǒng)對電刺激信號存在頻率跟隨現(xiàn)象。

豚鼠；頻率跟隨；耳蝸；鎖相

鎖相能力是聽覺系統(tǒng)的一項(xiàng)重要功能，對聲音音調(diào)感知、頻率辨別、噪聲中的語音識別等聽覺功能都密切相關(guān)［1］。持續(xù)周期性刺激信號是反映出聽覺系統(tǒng)神經(jīng)鎖相特性的必要條件［2］，而目前人工耳蝸使用電刺激信號均為短時方波電脈沖信號，因此對人工耳蝸植入者來說，聽覺系統(tǒng)能否在電刺激的情況下依然保有與聲刺激下類似的鎖相能力，目前不得而知。Worden等［3］于1968年首次記錄到一系列能夠很好地反映聲波中的周期性成分的一系列動作電位，這種追隨聲波中低頻成分的反應(yīng)被稱為頻率追隨反應(yīng)（frequency-following responses，F(xiàn)FR），后續(xù)研究證實(shí)頭皮記錄聽覺頻率跟隨反應(yīng)（frequencyfollowing response，F(xiàn)FR）可較好的反應(yīng)聽覺系統(tǒng)神經(jīng)鎖相特性［4］，但聽覺系統(tǒng)對電刺激是否仍存在頻率跟隨反應(yīng)，目前沒有可靠證據(jù)，本研究擬對豚鼠聽覺系統(tǒng)對電刺激信號是否存在頻率跟隨現(xiàn)象（Electrically-Evoked Frequency-Following Response，EFFR）做一初步探索。

資料與方法

1一般資料

1.1實(shí)驗(yàn)動物

清潔級Hartley豚鼠8只，雌雄不限，體重250～300g。由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，使用10%水合氯醛（3～4ml/Kg）腹腔注射麻醉，每隔60分鐘酌情追加0.3～0.4ml 10%水合氯醛。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備

記錄設(shè)備為Neuro-MEP-Micro數(shù)字肌電和誘發(fā)電位儀（俄羅斯）。使用DS8000數(shù)字電刺激器及DLS100電刺激隔離器（World Precision Instruments，WPI，USA）輸出電刺激。電刺激器和誘發(fā)電位儀之間觸發(fā)信號線由帶屏蔽BNC線纜自行改造轉(zhuǎn)接2.5mm耳機(jī)接口而成。刺激電極正極為直徑100μm的鉑銥合金球狀電極，電極球形端直徑500μm，除球形端及尾端裸露外，其余電極表面均有Parylene絕緣涂層。刺激電極負(fù)極及記錄電極使用不銹鋼針狀電極，兩端均裸露約3mm，中間被覆Parylene絕緣涂層。電極由上海派樂化學(xué)有限公司加工。

1.3信號生成

使用純音信號、高斯白噪音電信號圓窗龕電刺激，純音信號頻率為797Hz和1597Hz。刺激信號長度為40ms，使用Matlab軟件生成后上傳到電刺激器輸出。每個刺激信號均采取正負(fù)極性交替的方式，包括500次正向刺激和500次負(fù)向刺激，總計(jì)將獲得1000次有效刺激。電刺激的峰峰值為180μA。

記錄及降噪

電刺激幅度為10～100μA，均采取正負(fù)極性交替的方式，包括500次正向刺激和500次負(fù)向刺激，總計(jì)將獲得1000次有效刺激。Neuro-MEPMicro記錄儀記錄原始數(shù)據(jù)導(dǎo)出為XML格式，使用Matlab軟件進(jìn)行讀取疊加去偽跡后，使用快速傅立葉變換后計(jì)算EFFR信號的幅度譜，目標(biāo)頻率處幅度相對于其周圍100Hz范圍的平均幅度定義為EFFR相對幅度（RA）。

2實(shí)驗(yàn)步驟

切開豚鼠外耳道口上、下極，暴露骨性外耳道口直視鼓膜，以耳顯微外科尖針刺破豚鼠鼓膜，暴露圓窗龕，仔細(xì)操作勿損傷圓窗膜。顯微鏡下將刺激電極負(fù)極前端彎成鉤狀固定于圓窗龕骨緣，使球狀電極貼附于圓窗膜表面。刺激電極正極置于外耳道前下方皮下，使用干燥無菌棉球置于外耳道固定電極，避免檢測中移位。EFFR記錄電極位于顱頂正中，參考電極位于同側(cè)乳突皮下，地極位于鼻尖，測試電極阻抗小于2kΩ，極間阻抗小于3kΩ。

實(shí)驗(yàn)一分別用高斯白噪音信號、797Hz的純音和1597Hz的純音作為電刺激信號，記錄不同信號刺激下的誘發(fā)電位。

實(shí)驗(yàn)二采用797Hz的純音電信號每間隔10分鐘記錄一次誘發(fā)電位，記錄三次之后處死豚鼠，然后繼續(xù)記錄豚鼠死亡后10、20、30分鐘后對該電刺激的反應(yīng)信號。

實(shí)驗(yàn)三用1000Ω的電阻替代豚鼠完成實(shí)驗(yàn)，分別用797Hz與1597Hz的純音電刺激信號，刺激電極的正極與記錄電極的正極接在電阻一端，刺激電極的負(fù)極、記錄電極的參考、地極三者一同接到電阻的另外一端。分析該記錄信號是否存在FFRs現(xiàn)象。

3統(tǒng)計(jì)方法

包括線性回歸，雙因素重復(fù)實(shí)驗(yàn)方差分析（Two way repeated measures ANOVA）以及單因素重復(fù)實(shí)驗(yàn)方差分析（One wayrepeated measure ANOVA）。

結(jié)果

1純音與白噪音刺激下EFFRs的對比

如圖1分顯示，純音電信號誘發(fā)波形具有明顯的周期性，而白噪音電信號誘發(fā)波形則沒有明顯周期性，純音誘發(fā)的信號RA在頻譜圖797Hz位置具有明顯的峰值，而白噪音電信號誘發(fā)的信號在頻譜圖上RA無峰值。8只豚鼠由797Hz純音電信號誘發(fā)的EFFR平均相對幅度RA為23.0（SD=2.3），由1597Hz純音電信號誘發(fā)的信號平均RA為16.7（SD=0.9）。白噪音電信號誘發(fā)信號在797Hz處RA為2.2（SD=0.2），在1597Hz處的RA為2.3（SD= 0.2）。雙因素（刺激信號類型和頻率）重復(fù)實(shí)驗(yàn)方差分析表明，純音電信號和白噪音電信號間EFFR平均RA存在顯著差異（P＜0.001），797Hz和1597Hz間EFFR平均RA存在顯著差異（P＜0.05）。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明EFFRs可以反映出聽覺腦干的鎖相活動，同F(xiàn)FRs的研究結(jié)果類似。

圖1　797Hz純音和白噪音電刺激信號EFFRs結(jié)果對比

2EFFRs輸入輸出函數(shù)曲線

刺激信號的波形經(jīng)過快速傅里葉變換得到目標(biāo)頻率處的幅度定義為輸出幅度，繪制刺激強(qiáng)度和輸出幅度間的輸入輸出函數(shù)曲線。結(jié)果如圖2所示，輸出幅度隨著刺激電刺激幅度增長呈非線性改變。采用Greenhouse-Geisser修正的單因素重復(fù)實(shí)驗(yàn)方差分析顯示，電刺激幅度差異具有顯著性（P＜ 0.001）。經(jīng)Bonferroni修正的進(jìn)一步檢驗(yàn)表明：第一，10、20、30μA顯著地低于80、90、100，μA（P＜0.05）；第二，輸出幅度在10、20、30、40、50、60μA之間的差異無顯著性（P＞0.05）；第三，輸出幅度在最高的五個刺激幅度60、70、80、90、100？A之間的差異無顯著性（P＞0.05）。綜上所述，EFFRs信號存在明顯的閾值特性與飽和特性。

圖2　797Hz純音電刺激信號EFFR輸入輸出曲線

3豚鼠死亡前后EFFRs的變化

圖3顯示8只豚鼠的在死亡前后不同時刻的平均RA。從上可以看出，豚鼠存活時的三次EFFRs測量沒有有明顯的不同，同樣死亡之后的三次EFFRs的測量間也沒有明顯的不同，豚鼠死亡前的RA值（22～25）明顯高于死亡后RA值（6～8）的。雙因素重復(fù)實(shí)驗(yàn)方差分析表明，豚鼠死亡前后RA值差異具有高度顯著性（P＜0.001），由此可以看出在活體豚鼠EFFRs的可重復(fù)性，EFFRs是神經(jīng)反應(yīng)而非電刺激偽跡。

圖3　豚鼠死亡前后EFFRs平均相對幅度的變化（n=8）

4電阻替代豚鼠EFFRs記錄

偽跡的另外一個產(chǎn)生來源是其它干擾源的耦合。為了排除這種可能，將豚鼠替換為電阻，然后記錄信號的變化情況。若信號為偽跡，電阻替代后應(yīng)該仍可以記錄到相應(yīng)的信號，而信號為神經(jīng)特有反應(yīng)，則在用電阻替換掉豚鼠之后，記錄到的EFFRs相對幅度明顯減弱。8只豚鼠平均RA值在797Hz純音刺激時為8.6（SD=1.1），在1597Hz純音刺激時為8.1（SD=1.1）。圖4展示了以豚鼠為實(shí)驗(yàn)對象和以電阻為實(shí)驗(yàn)對象時在相同電刺激信號刺激下的平均RA。雙因素重復(fù)實(shí)驗(yàn)方差分析顯示，豚鼠RA值與使用電阻RA值差異具有顯著性（P＜0.05），不同刺激頻率間差異沒有顯著性（P＞0.05）。

圖4　豚鼠（GP）與電阻間（ER）EFFRs平均相對幅度的差異（n=8）

討論

哺乳動物聽覺信息的存在兩種編碼方式，空間編碼及時間編碼?？臻g編碼模式主要依靠內(nèi)毛細(xì)胞調(diào)諧特性和其與聽神經(jīng)纖維的一對一傳輸通道對聲波進(jìn)行分解和傳輸，即頻域分析。時間編碼模式依靠聽神經(jīng)纖維在基底膜波動周期的特定相位發(fā)放沖動，聲波的頻率及其他時間特征因而能以鎖相發(fā)放的形式被傳輸，即時域分析［5］。人工耳蝸植入是雙耳重度感音神經(jīng)性聾患者重建聽覺和語言能力最成功的方法，其原理是通過植入電極取代存在病變的內(nèi)耳毛細(xì)胞功能，直接電流刺激螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和聽神經(jīng)而產(chǎn)生聽覺。目前對于電刺激聽覺的聽覺信息編碼模式因研究手段有限，雖目前所知不多，但理論上兩種編碼模式均發(fā)揮作用［6，7］，空間編碼模式因重度聾患者毛細(xì)胞損傷，頻域分析只能靠電極位置和殘存螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞間的位置關(guān)系實(shí)現(xiàn)，受到影響因素較多，發(fā)揮作用有限［8］；時域分析功能因不受內(nèi)毛細(xì)胞功能影響，只要聽神經(jīng)功能正常，時間編碼模式即可發(fā)揮作用，因此理論上對人工耳蝸植入患者，時間編碼模式較空間編碼模式在聽覺信息傳遞上可能價值更大［9］。但目前尚無可靠證據(jù)直接證實(shí)該現(xiàn)象。Worden等［3］于1968年首次記錄到一系列能夠很好地反映聲波中的周期性成分的一系列動作電位并將之稱為頻率追隨反應(yīng)（frequencyfollowing responses，F(xiàn)FRs），后續(xù)研究證實(shí)頭皮記錄FFRs可較好的反應(yīng)聽覺系統(tǒng)神經(jīng)鎖相特性［4，10］，是研究聽覺系統(tǒng)時間編碼模式的良好方法。本研究利用電信號代替聲信號刺激豚鼠聽覺系統(tǒng)，通過偽跡去除及頻譜提取對在其頭皮的記錄電信號進(jìn)行分析，了解豚鼠聽覺系統(tǒng)是否對電刺激存在頻率跟隨反應(yīng)，驗(yàn)證其聽覺系統(tǒng)對電刺激的鎖相特性，為進(jìn)一步探索電刺激聽覺的的信息編碼模式打下基礎(chǔ)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，我們使用純音電信號刺激豚鼠聽覺系統(tǒng)，所誘發(fā)出的波形和頻譜成分存在明顯周期性，而白噪音作為刺激信號所記錄波形及頻譜則沒有明顯周期性，表明EFFR可以反映出聽覺腦干的鎖相活動，同F(xiàn)FR的研究結(jié)果類似［2］。和Liu等研究結(jié)果認(rèn)為聽神經(jīng)鎖相能力上限是3500Hz，在500Hz-1000Hz間是反應(yīng)其鎖相能力最佳范圍［11］，我們結(jié)果證實(shí)使用797Hz電信號所誘發(fā)信號和1597Hz誘發(fā)出頻率跟隨反應(yīng)信號最明顯，3997Hz則基本觀察不到頻率跟隨反應(yīng)信號（預(yù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)），同Liu等結(jié)果一致，但需要進(jìn)一步研究探索電刺激信號的頻率跟隨反應(yīng)的作用范圍。

為進(jìn)一步驗(yàn)證我們記錄分析的信號為EFFR信號來源于豚鼠的聽覺系統(tǒng)生理反應(yīng)，而不是系統(tǒng)噪聲耦合，我們繪制了FFR信號的輸入輸出曲線特征、處死豚鼠前后EFFR變化和使用電阻代替豚鼠進(jìn)行EFFR記錄，從這三個方面進(jìn)行了驗(yàn)證。797Hz電刺激信號顯示其輸入輸出曲線呈現(xiàn)明顯的的閾值特性與飽和特性，這些特性都是神經(jīng)反應(yīng)所擁有而電刺激偽跡所不具備的；處死豚鼠后10分鐘EFFR信號相對幅度明顯低于活體豚鼠，差異顯著，證明EFFR是活體豚鼠的特有現(xiàn)象；在用電阻替換掉豚鼠之后，記錄到的EFFR相對幅度明顯減弱，證明該信號來源于活體豚鼠，和實(shí)驗(yàn)環(huán)境噪聲無關(guān)。我們從三個方面排除了實(shí)驗(yàn)環(huán)境電磁噪聲耦合的可能，證實(shí)了我們所記錄到的EFFR信號為豚鼠聽覺系統(tǒng)的神經(jīng)反應(yīng)。為后續(xù)進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)。

綜上所述，該研究證實(shí)正常聽力豚鼠聽覺系統(tǒng)對電刺激存在頻率跟隨反應(yīng)，亦即對電刺激存在鎖相特性，間接證明豚鼠電刺激聽覺信息傳遞過程中存在時間編碼模式。該研究搭建了可靠的豚鼠聽覺EFFR研究平臺，對豚鼠聽覺系統(tǒng)存在EFFR現(xiàn)象進(jìn)行了初步的探索，后續(xù)研究在刺激模式、信號處理方式方面還有較大優(yōu)化空間，所觀察到的EFFR現(xiàn)象需要進(jìn)一步在聽力損傷豚鼠進(jìn)一步驗(yàn)證，EFFR中樞機(jī)制也需要進(jìn)一步深入研究。

1Moore BC.Coding of sounds in the auditory system and its relevance to signal processing and coding in cochlear implants.Otol Neurotol，2003，24：243-254.

2Skoe E，Kraus N.Auditory brain stem response to complex sounds：a tutorial.Ear Hear，2010，31：302-324.

3WordenFG，MarshJT.Frequency-following（microphonic-like）neural responses evoked by sound. Electroencephalogr Clin Neurophysiol，1968，25：42-52.

4Bidelman GM.Multichannel recordings of the human brainstem frequency-following response：scalp topography，source generators，and distinctions from the transient ABR.Hear Res，2015，323：68-80.

5梁之安.聽覺信息編碼和傳輸.聽覺感受和辨別的神經(jīng)機(jī)制，1999：81-101.

6Friesen LM，Shannon RV，Baskent D，et al.Speech recognition in noise as a function of the number of spectral channels：comparison of acoustic hearing and cochlear implants.J Acoust Soc Am，2001，110：1150-1163.7Gransier R，Deprez H，Hofmann M，et al.Auditory steady-state responses in cochlear implant users：Effect of modulation frequency and stimulation artifacts.Hear Res，2016，335：149-160.

8Long CJ，Holden TA，McClelland GH，et al.Examining the electro-neural interface of cochlear implant users using psychophysics，CT scans，and speech understanding.J Assoc Res Otolaryngol，2014，15：293-304.

9Luke R，Van Deun L，Hofmann M，et al.Assessing temporal modulation sensitivity using electrically evoked auditory steady state responses.Hear Res，2015，324：37-45.

10Zhu L，Bharadwaj H，Xia J，et al.A comparison of spectral magnitude and phase-locking value analyses of the frequency-following response to complex tones.J Acoust Soc Am，2013，134：384-395.

11Liu LF，Palmer AR，Wallace MN.Phase-locked responses to pure tones in the inferior colliculus.J Neurophysiol，2006，95：1926-1935.

（收稿：2016-07-25）

Electrically-Evoked Frequency-Following Response（EFFR）of Guinea Pigs

DING Xiuyong，HE Wenxin，ZHANG Ruxiang，CHEN Jing
Department of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery，Xuanwu Hospital，Capital Medical University，Beijing，100053，China

Objective To explore the Electrically-Evoked Frequency-Following Response whether exist in guinea pig auditory system.Methods Periodic signals and white noise electrical stimuli were used for guinea pigs cochlear electrical stimulation，The EFFR were recorded in the guinea pigs scalp and analyzed，the EFFR also verified by recording of death guinea pigs and electrical resistance.Results EFFR evoked by periodic signals were significantly higher than those evoked by the white noise；the responses decreased significantly after death of the guineapigs；and the responses decreased significantly when the animal was replaced by an electrical resistance.Conclusions Electrically-Evoked Frequency-Following Response can be recorded in the guinea pigs with normal hearing.

guinea pig；Frequency-Following Response；cochlear；phase-locking

·臨床研究·

10.16542/j.cnki.issn.1007-4856.2016.04.001

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（61473008）；衛(wèi)生行業(yè)科研專項(xiàng)項(xiàng)目（201202001-04）

1首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（北京，100053）

2北京大學(xué)機(jī)器感知與智能教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，言語聽覺研究中心

3首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科

陳婧，研究員.Email：Chen@cis.pku.edu.cn