曹桂秋　李玲玲　劉立志　王貴鵬　徐　潔　駱小梅

(新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院體檢科，新疆 　烏魯木齊　830011)

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高膽固醇飲食聯(lián)合球囊損傷建立兔腹主動(dòng)脈粥樣硬化模型及評價(jià)

曹桂秋李玲玲1劉立志2王貴鵬2徐潔2駱小梅2

(新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院體檢科，新疆 烏魯木齊830011)

目的探討高膽固醇飲食聯(lián)合球囊損傷建立兔腹主動(dòng)脈粥樣硬化模型及評價(jià)方式。方法選擇雄性新西蘭大耳白兔16只，隨機(jī)分為對照組(n=8)和實(shí)驗(yàn)組(n=8)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，兩組均通過手術(shù)造成腹主動(dòng)脈球囊損傷，對照組給予普通飲食(基礎(chǔ)飼料)，實(shí)驗(yàn)組給予高膽固醇飲食，兩組均喂養(yǎng)12 w。分析飼養(yǎng)前后血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)水平。飼養(yǎng)12 w后，采用血管造影和超聲計(jì)算藥物刺激后收縮率；處死試驗(yàn)?zāi)Ｐ停τ不苓M(jìn)行病理學(xué)檢查。結(jié)果飼養(yǎng)后，對照組血脂指標(biāo)與飼養(yǎng)前比較無顯著差異(均P>0.05)，實(shí)驗(yàn)組飼養(yǎng)后TC、TG、LDL水平較飼養(yǎng)前顯著升高，且均高于對照組(均P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組藥物刺激后收縮率均顯著高于同組正常部位與對照組損傷部位(均P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組硬化分級、內(nèi)膜厚度和內(nèi)膜增生面積均顯著高于對照組，管腔面積顯著低于對照組(均P<0.05)。結(jié)論膽固醇飲食聯(lián)合球囊損傷建立兔腹主動(dòng)脈粥樣硬化模型效果良好、穩(wěn)定，血液生化指標(biāo)和組織病理改變典型，并可用血管造影和超聲的方法確定斑塊性質(zhì)，可靠實(shí)用，是研究動(dòng)脈粥樣硬化的良好模型。

膽固醇；球囊損傷；動(dòng)脈粥樣硬化

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是心腦血管疾病的重要病因，粥樣硬化斑塊會增加動(dòng)脈管腔狹窄程度，導(dǎo)致組織供血不足，引發(fā)心腦血管事件的發(fā)生，更嚴(yán)重的是粥樣斑塊破裂導(dǎo)致的急性血栓栓塞〔1〕。研究表明，斑塊破裂導(dǎo)致的血栓形成是導(dǎo)致血管事件的根本原因，其中狀態(tài)不穩(wěn)定、具有高危破裂傾向的斑塊稱之為“易損斑塊”〔2〕。研究“易損斑塊”必須建立在具有特征性的動(dòng)物模型上。兔是食草性動(dòng)物，不易自發(fā)形成AS，但其對高脂飲食敏感，是常見的建模動(dòng)物〔3〕。國內(nèi)外已有許多研究選擇兔作為構(gòu)建AS的模型，但是各研究在模型的構(gòu)建方法、病變的描述和評價(jià)上存在差異，導(dǎo)致研究間難以交流和比較，研究結(jié)果也缺乏良好的兼容性〔4〕。本研究結(jié)合已有研究方法，提出高膽固醇飲食聯(lián)合球囊損傷建立兔腹主動(dòng)脈AS模型，并從血脂、血管超聲和組織病理三個(gè)方面評價(jià)該模型。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物與方法選擇雄性新西蘭大耳白兔(清潔級)16只，4月齡，體質(zhì)量2.2～2.5 kg，由我院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，所有動(dòng)物單籠飼養(yǎng)，自由飲水，保持12 h晝夜節(jié)律，恒定溫度和濕度。隨機(jī)將動(dòng)物分為對照組和實(shí)驗(yàn)組，各8只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，兩組均通過手術(shù)造成腹主動(dòng)脈球囊損傷，對照組給予普通飲食(基礎(chǔ)飼料)，實(shí)驗(yàn)組給予高膽固醇飲食，高膽固醇飼料組成：4%膽固醇+10%豬油+86%基礎(chǔ)飼料。兩組均喂養(yǎng)12 w。

1.2儀器和試劑膽固醇購自Sigma公司，速眠新(2 ml/支，120627，吉林華牧動(dòng)物保健)，鹽酸戊巴比妥那注射液(5 ml：0.1 g/支，121203，上海朝暉藥業(yè))，馬來酸麥角新堿(1.5 ml/支，130307，揚(yáng)子江楊業(yè))，普通球囊導(dǎo)管和附件(球囊3.0～3.5 mm×15 mm，Coridis公司)，球囊擴(kuò)張壓力泵(Coridis公司)，4 F橈動(dòng)脈鞘管和21 G橈動(dòng)脈穿刺針(Coridis公司)，ATW PTCA引導(dǎo)鋼絲(0.014 mm×195 cm，Coridis公司)；全自動(dòng)生化分析儀(日立7600，日本)，超聲診斷儀(GM LOGIQ 400 PRO，美國)，組織脫水機(jī)、石蠟包埋系統(tǒng)、切片機(jī)(ASP300S、EG1150、RM2235，LEICA，德國)。

1.3球囊損傷術(shù)動(dòng)物術(shù)前禁食12 h，3%戊巴比妥鈉1 ml/kg耳緣靜脈聯(lián)合速眠新0.05 ml/kg肌注麻醉，動(dòng)物麻醉成功后表現(xiàn)為呼吸深慢、四肢癱軟、角膜反射遲緩，此時(shí)通過耳緣靜脈注射肝素鈉200 IU/kg，并將兔固定兔臺。剪去兔右側(cè)后腿內(nèi)側(cè)毛發(fā)，常規(guī)皮膚消毒，在股動(dòng)脈搏動(dòng)明顯處切口，沿動(dòng)脈走行方向逐層切開皮膚，鈍性分離皮下組織和肌肉，顯露股動(dòng)脈并分離約3～4 cm，結(jié)扎遠(yuǎn)心端。用21 G橈動(dòng)脈穿刺針進(jìn)行股動(dòng)脈穿刺術(shù)，借助導(dǎo)絲插入4 F橈動(dòng)脈鞘管，抽血4 ml進(jìn)行血生化檢驗(yàn)，分析總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)。在經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成型術(shù)導(dǎo)絲引導(dǎo)下，逆行送入球囊導(dǎo)管，使球囊位于腹主動(dòng)脈，選擇L3-L4腰椎水平的腹主動(dòng)脈作為內(nèi)皮損傷靶點(diǎn)，維持壓力0.61～1.01 MPa充盈球囊，并來回拉動(dòng)增加血管內(nèi)皮損傷程度，若拉動(dòng)阻力較小提示球囊直徑不夠，則替換更大直徑球囊，重復(fù)操作3次，損傷腹主動(dòng)脈內(nèi)膜。推出球囊和導(dǎo)絲，拔出鞘管，壓迫止血5 min，并包扎血管，逐層縫合關(guān)閉切口，術(shù)后連續(xù)3 d肌注青霉素80萬U/d。

1.4影像學(xué)檢查喂養(yǎng)12 w后，麻醉后切開上述相同位置皮膚，采用橈動(dòng)脈穿刺針對右股動(dòng)脈進(jìn)行穿刺，導(dǎo)入鞘管，取血4 ml檢測血脂指標(biāo)，在X射線下經(jīng)鞘管注射4 ml造影劑，在注射前后行正后前位造影，測定球囊損傷部位血管和鄰近部位血管直徑。動(dòng)脈內(nèi)給予麥角新堿，3 min后再次造影，測定藥物刺激后血管直徑，并計(jì)算收縮率=(刺激前血管直徑-刺激后血管直徑)/刺激前血管直徑。

1.5病理檢查檢測完收縮率后，過量麻醉處死，解剖動(dòng)物，截取腹主動(dòng)脈約2 cm，生理鹽水沖洗干凈后保存于4%多聚甲醛中，石蠟包埋切片，蘇木素-伊紅(HE)染色后光鏡下觀察。依據(jù)美國心臟病協(xié)會血管病變委員會推薦的《AS分級標(biāo)準(zhǔn)》〔5〕對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物組織切片進(jìn)行觀察分級：0級，內(nèi)膜光滑，無奶油樣病變；1級，內(nèi)膜有奶油樣病變，但未見突出表面的斑塊；2級，有斑塊突出，面積<3 mm2；3級，有散在斑塊，面積>3 mm2；4級，斑塊融合成片，且面積>3 mm2；5級，斑塊幾乎覆蓋整個(gè)動(dòng)脈內(nèi)膜。通過圖像分析軟件計(jì)算管腔面積、內(nèi)膜厚度、增生內(nèi)膜面積。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS17.0軟件，計(jì)量資料組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料組間比較用χ2檢驗(yàn)。

2　結(jié)　果

2.1兩組動(dòng)物飼養(yǎng)前后血脂水平比較飼養(yǎng)前，兩組動(dòng)物血脂各指標(biāo)均無顯著性差異(均P>0.05)；12 w后，對照組血脂指標(biāo)仍未見顯著差異(均P>0.05)，實(shí)驗(yàn)組TC、TG、LDL水平較飼養(yǎng)前顯著升高，且均高于對照組(均P<0.05)，HDL在飼養(yǎng)前后略有升高，但未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表1。

2.2兩組動(dòng)物藥物刺激后血管收縮率比較主動(dòng)脈造影后，給予藥物刺激，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組球囊損傷部位收縮率為(0.48±0.18)%，與同組正常部位〔(0.08±0.02)%〕比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，與對照組損傷部位〔(0.08±0.03)%〕比較也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。對照組鄰近正常部位血管收縮率為(0.07±0.02)%。

2.3兩組動(dòng)物病理檢查結(jié)果比較直視下可見對照組血管柔軟有彈性，顏色均勻呈粉色，管腔內(nèi)光滑；實(shí)驗(yàn)組血管僵硬，黃白相間，內(nèi)壁增厚凸起。HE染色后可見對照組內(nèi)皮細(xì)胞完整，中層肌細(xì)胞排列整齊，形態(tài)正常，胞質(zhì)呈酸性紅染，可見少量脂質(zhì)沉積；實(shí)驗(yàn)組內(nèi)皮脫落，可見粥樣斑塊，在斑塊中可見新生血管和炎細(xì)胞浸潤，內(nèi)膜下可見泡沫細(xì)胞，平滑肌排列紊亂并增生，胞質(zhì)嗜酸性減少。實(shí)驗(yàn)組硬化分級、管腔面積、內(nèi)膜厚度和內(nèi)膜增生面積與對照組有顯著差異(P<0.05)。見表2。

表1　兩組動(dòng)物飼養(yǎng)前后血脂水平比較

與對照組比較：1)P<0.05；與飼養(yǎng)前比較：2)P<0.05

表2　兩組動(dòng)物病理檢查結(jié)果比較±s,n=8)

3　討　論

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型是研究相應(yīng)疾病的基礎(chǔ)，目前較常用的造模動(dòng)物為小鼠和兔，但是小鼠血漿膽固醇水平較低，且存在于HDL顆粒中，很難誘導(dǎo)AS；載脂蛋白缺陷和(或)LDL受體缺乏的小鼠雖然易形成AS，但是價(jià)格高昂〔6〕。其他動(dòng)物如猴、豬、狗，同樣受限于費(fèi)用和體型，不宜大樣本造模和研究〔7〕。理想的動(dòng)物模型應(yīng)當(dāng)具備如下特征：①具有與人類相似的疾病特征和發(fā)生發(fā)展過程；②動(dòng)物與人類具有共同的致病因素；③造模方法簡單易行，成功率高；④模型穩(wěn)定，疾病特征明顯，可重復(fù)性高；⑤造模成本低〔8〕。

研究表明，高脂飲食可引起兔血脂水平升高，會同時(shí)作用于兔全身血管，但是不同部位血管及不同節(jié)段的血管的病變并不是同步發(fā)生的，胸主動(dòng)脈發(fā)展最快程度最深，其次為主動(dòng)脈根部，再次是腹主動(dòng)脈〔9〕。然而飲食造模的周期比較長，且進(jìn)展緩慢。本研究在傳統(tǒng)飲食法的基礎(chǔ)上調(diào)整膽固醇攝入量為5%，同時(shí)聯(lián)合應(yīng)用球囊損傷法，造成腹主動(dòng)脈內(nèi)膜的損傷，可增加造模成功率并縮短造模時(shí)間，避免長期高脂飲食導(dǎo)致的其他疾病對研究的干擾〔10〕。研究結(jié)果證實(shí)，高膽固醇飲食顯著造成了兔高膽固醇血癥，與以往研究一致〔11〕，LDL的長期高水平可損傷血管內(nèi)皮，增加造模成功率。

動(dòng)物AS模型的評價(jià)，目前主要依據(jù)病理檢查，但此法必須處死動(dòng)物，不利于進(jìn)一步研究斑塊的發(fā)生發(fā)展和藥物干預(yù)〔12〕。本研究結(jié)合血管造影和血管內(nèi)超聲，不僅能觀察到斑塊，還可以檢測斑塊性質(zhì)。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組球囊損傷部位血管收縮率顯著高于正常血管，提示該法評價(jià)斑塊易損性具有較高的判斷價(jià)值。此外，病理學(xué)檢查顯示結(jié)果與現(xiàn)階段所掌握的動(dòng)脈粥樣硬化病變的特點(diǎn)一致〔13〕，提示該造模方法顯著有效。

綜上所述，膽固醇飲食聯(lián)合球囊損傷建立兔腹主動(dòng)脈AS模型造模效果良好、穩(wěn)定，血液生化指標(biāo)和組織病理改變典型，并可用血管造影和超聲的方法確定斑塊性質(zhì)，可靠實(shí)用，是研究AS的良好模型。

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〔2015-11-19修回〕

(編輯袁左鳴)

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.2014211C124)

曹桂秋(1972-)，女，博士，主任醫(yī)師，主要從事心血管疾病、老年疾病診療及營養(yǎng)保健方面的研究。

R541.4

A

1005-9202(2016)18-4426-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.18.010

1新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院超聲科

2新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院心內(nèi)科