郝傳錚　魏　利　趙　旭　陸芳芳　胡　平

(南通大學附屬醫(yī)院中醫(yī)科，江蘇　南通　226001)

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水飛薊素保護腎小球內皮細胞氧化損傷的效應與SIRT1及腺苷酸活化蛋白激酶α的作用機制

郝傳錚魏利1趙旭陸芳芳胡平

(南通大學附屬醫(yī)院中醫(yī)科，江蘇南通226001)

目的研究水飛薊素對腎小球內皮細胞氧化損傷的保護作用及SIRT1和腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)α在其中的作用機制。方法使用1×105nmol/L H2O2處理腎小球內皮細胞,構建氧化應激細胞模型。MTT實驗法檢測水飛薊素對氧化應激造成的腎小球內皮細胞損傷的影響。實時定量RT-PCR法測定水飛薊素對氧化應激損傷的腎小球內皮細胞SIRT1和AMPKα mRNA水平的影響。Western 印跡法測定水飛薊素對氧化應激損傷的腎小球內皮細胞SIRT1，AMPK和AMPKα磷酸化蛋白水平的影響。結果1×105nmol/L H2O2處理腎小球內皮細胞后，細胞存活率顯著降低，而1 μg/ml和5 μg/ml的水飛薊素處理可以顯著提高細胞存活率。實時定量RT-PCR結果顯示，5 μg/ml的水飛薊素處理顯著提高了腎小球內皮細胞SIRT1 mRNA水平，而對AMPKα mRNA水平無顯著影響。Western 印跡結果顯示，H2O2處理后，細胞的SIRT1蛋白水平和AMPKα磷酸化蛋白水平未出現(xiàn)顯著變化，但AMPKα蛋白水平顯著降低。1 μg/ml和5 μg/ml的水飛薊素處理顯著提高了細胞SIRT1蛋白水平和AMPKα磷酸化蛋白水平；H2O2處理后細胞的AMPKα蛋白水平顯著降低，而1 μg/ml和5 μg/ml的水飛薊素處理顯著提高了AMPKα蛋白水平，和對照組無顯著差異。結論水飛薊素可能通過調節(jié)細胞內SIRT1及AMPKα蛋白的表達及AMPKα磷酸化發(fā)揮抗氧化損傷作用而保護腎小球內皮細胞。

水飛薊素;腎小球內皮細胞;氧化應激;SIRT1;AMPKα

由于Sirtuin具有抑制基因轉錄的功能，因此又稱為沉默基因同源蛋白(SIR)〔1〕，其中SIRT1是目前研究的熱點。水飛薊素可以通過激活SIRT1發(fā)揮其對紫外線造成的A375-S2 細胞凋亡的保護作用〔2〕。此外，腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是“細胞能量調節(jié)器”，作為一個重要的信號通路，參與細胞蛋白質合成、機體炎癥反應和氧化應激等過程〔3〕。由于它和SIRT1存在復雜的調控關系，它是否參與SIRT1保護腎臟的氧化應激也值得深入探討。水飛薊素是從菊科植物水飛薊種子中提取的一類黃酮木脂素類成分，主要成分有水飛薊賓、異水飛薊賓、水飛薊寧、水飛薊亭等〔4〕。研究發(fā)現(xiàn)水飛薊素具有抗腫瘤、抗炎、降血脂、治療糖尿病等用途，其機制可能與抗氧化有關〔5〕。本研究以水飛薊素為研究對象，觀察它對腎小球內皮細胞氧化損傷的保護效應，并探索SIRT1和AMPKα在其中的作用機制。

1　材料與方法

1.1細胞株藥物及試劑小鼠腎小球內皮細胞株。DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清購自Gibco公司。水飛薊素、MTT試劑盒購自上海生工，總RNA快速提取試劑盒、逆轉錄試劑盒和定量PCR SYBR Green Master Mix均購自TAKARA公司。蛋白裂解RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒和蛋白上樣緩沖液均購自生工生物，SDS-PAGE配膠溶液購自碧云天公司。PVDF膜和ECL化學發(fā)光液購自Mippore公司。SIRT1一抗：β-actin購自Proteintech公司，SIRT1抗體，AMPKα和p-AMPKα(T172)購自CST公司。二抗：羊抗鼠IgG(H+L)和羊抗兔IgG(H+L)購自Jackson公司。

1.2儀器及耗材定量PCR儀為AB公司ViiA7 Real-Time PCR System。相關耗材(Tip頭、EP管等)購自Thermal Scientific Fisher公司，均為無RNase、DNase和無熱源的分子生物學耗材。蛋白電泳儀購自Bio-Rad公司，酶標儀(SPECTRA max Plus 384)購自Molecular Devices公司。CCD成像系統(tǒng)：Bio-Rad公司。臺式高速冷凍離心機：H1650R，上海盧湘儀。臺式低速離心機：TDZ6B-WS，上海盧湘儀。

1.3細胞培養(yǎng)及水飛薊素處理將胎牛血清和DMEM按1∶9的比例配制成完全培養(yǎng)基用于培養(yǎng)小鼠腎小球內皮細胞，將小鼠腎小球內皮細胞置于37°C，5%CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。3 d傳代一次，在顯微鏡下觀察，細胞呈多角形或長梭形，核淡，胞膜明顯，細胞呈單層。取第3代細胞供實驗用。水飛薊素處理方法：①細胞傳至三代，接6孔板，每孔種相同數量的細胞，每孔細胞數量是1×106個。②培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁。③構建氧化應激細胞模型，1×105nmol/L過氧化氫溶液處理腎小球細胞，設置對照組，處理12 h。④移去培養(yǎng)基，PBS洗兩遍。⑤加入新鮮培養(yǎng)基。⑥水飛薊素溶于DMSO，分別用1 μg/ml和5 μg/ml濃度的水飛薊素處理細胞，同時對照組和過氧化氫模型組添加等量的DMSO，控制DMSO終濃度為0.1%。⑦細胞培養(yǎng)24 h。⑧PBS洗兩遍，胰酶消化下細胞，收取細胞，PBS洗3遍。

1.4MTT比色法檢測水飛薊素對氧化應激造成的腎小球損傷的影響將細胞傳至三代，接板，每孔細胞數量是8×104個。繼續(xù)將細胞培養(yǎng)24 h，用1×105nmol/L H2O2刺激12 h,PBS洗兩次，換成給藥完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，進行MTT實驗。向各孔細胞加入20 μl MTT(5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液，加入150 μl DMSO溶液，室溫下?lián)u床震蕩10 min，使結晶物充分溶解后，用酶標儀測定490 nm波長吸光度A490。計算細胞存活率。

1.5實時定量RT-PCR法檢測水飛薊素對氧化應激損傷的腎小球內皮細胞SIRT1和AMPKα mRNA水平定量PCR引物，均合成于生工生物(上海)股份有限公司。Trizol法提取細胞總RNA，核酸蛋白定量檢測儀測定RNA濃度，94℃預變性5 min，94℃變性30 s，55℃ 退火30 s，72℃延伸45 s，30個循環(huán)后，72℃延伸10 min引物，降至4℃ 反應結束，同時獲取熒光，共40個循環(huán)，每組重復6次，反應結束后行產物的熔解曲線分析，以GAPDH為內參行結果分析。引物序列：SIRT1反義鏈5′-ATG GAC TCC TCA CTA ATG GCT TTC-3′，正義鏈5′-GGTGGAGGAATTGTTTCTGGTAA-3′；AMPK反義鏈5′-GGCACCCTCACATCATCAAA-3′，正義鏈5′-TTC GTCCAACCTTCCATTTT-3′；β-actin反義鏈5′- CCA CAG CTG AGA GGG AAA TC-3′，正義鏈5′- AAGGAAGGCTGGAAAAGAGC-3′。

1.6Western 印跡法測定各組細胞SIRT1及AMPKα磷酸化蛋白水平的表達藥物處理同上。每瓶細胞加2 ml 4℃預冷的PBS，平放輕輕搖動1 min洗滌細胞，然后棄去洗液。用胰酶消化貼壁細胞，并收集至備用的細胞培養(yǎng)液中。4℃離心5 min收集細胞。PBS洗滌一次，吸除上清后加1 ml PBS重懸，將細胞轉移到1.5 ml離心管中，4℃離心5 min收集細胞，吸除上清。按1 ml裂解液加10 μl PMSF(100 mmol/L)，混合均勻。每瓶細胞加100 μl含PMSF的裂解液，4℃裂解30 min。裂解完后，于4℃下12 000 r/min離心10 min,吸取上清，BCA法測定蛋白濃度。凝膠電泳分離蛋白，電壓110 V，加入5×上樣緩沖液混勻，沸水中煮沸5 min，迅速冰浴中冷卻，上樣量為每泳道30 μg；25 mA恒流電泳至溴酚藍跑完濃縮膠層，時間大約為30 min。分離膠電泳電流為30 mA。200 mA穩(wěn)流電轉移，根據所轉蛋白分子量，約1 min/kD。取出PVDF膜，去離子水洗滌。將PVDF膜浸入含5%脫脂奶粉或牛血清白蛋白的封閉液中，置搖床上緩慢搖動，室溫封閉1 h。取出已封閉的PVDF膜，浸于1× TBST緩沖液中，于搖床上緩慢洗滌5 min。然后移入含有一抗〔β-actin購自Proteintech公司，SIRT1抗體自備，AMPKα和p-AMPKα(T172)購自CST公司〕的小袋中，4℃孵育過夜。取出PVDF膜，浸于1×TBST緩沖液中，于搖床上緩慢洗滌3次，每次10 min。將PVDF膜轉移到含二抗(購自Jackson公司，稀釋1 000倍)的玻璃平皿中，于室溫搖床上孵育1 h。然后將PVDF膜浸于1×TBST緩沖液中，于搖床上緩慢洗滌3次，每次10 min。用ECL化學發(fā)光顯影法進行曝光顯影，并用Bin軟件進行圖像灰度分析。

1.7統(tǒng)計學方法采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗。

2　結　果

2.1水飛薊素對腎小球內皮細胞的活力的影響模型組為經過雙氧水處理的細胞，其活力顯著下降(60.835%)和正常對照組相比差異顯著(95.52%，P<0.01)。和模型組相比，5 μg/ml和1 μg/ml的水飛薊素處理皆顯著提高了細胞活力(78.081%，69.705%，P<0.05)，而0.1 μg/ml的水飛薊素(68.11%)則未能明顯提高細胞存活率，說明水飛薊素對氧化損傷后細胞的活力影響呈劑量相關關系。

2.2水飛薊素對氧化應激損傷的腎小球內皮細胞SIRT1 mRNA水平的影響經過雙氧水處理的細胞，其SIRT1 mRNA的相對表達量出現(xiàn)升高。和模型組(1.139)相比，5 μg/ml的水飛薊素處理顯著提高了SIRT1 mRNA的相對表達量(1.712,P<0.05)，而1 μg/ml(1.052)和 0.1 μg/ml(1.012)的水飛薊素則未能明顯改變SIRT1 mRNA的相對表達量。

2.3水飛薊素對氧化應激損傷的腎小球內皮細胞AMPKα mRNA水平的影響經過雙氧水處理的細胞，其AMPKα mRNA的相對表達量未出現(xiàn)顯著變化。和模型組(0.908)相比，各個劑量的水飛薊素處理皆未能明顯改變AMPKα mRNA的相對表達量(1.000,1.050，0.979)。

2.4水飛薊素對氧化應激損傷的腎小球內皮細胞SIRT1蛋白水平的影響經過雙氧水處理的細胞，其SIRT1 蛋白的表達量未出現(xiàn)顯著變化。和模型組相比，5 μg/ml和1 μg/ml的水飛薊素處理顯著提高了SIRT1 蛋白的表達量(P<0.05)，而1 μg/ml的水飛薊素則未能明顯改變SIRT1 蛋白的表達量。見圖1。

2.5水飛薊素對氧化應激損傷的腎小球內皮細胞AMPKα蛋白水平和AMPKα磷酸化水平的影響經過雙氧水處理的細胞，其AMPKα蛋白和AMPKα磷酸化未出現(xiàn)顯著變化。和模型組相比，5 μg/ml和1 μg/ml的水飛薊素處理顯著提高了AMPKα磷酸化水平(P<0.05)，而0.1 μg/ml的水飛薊素則未能明顯改變AMPKα磷酸化水平。5、1 μg/ml和0.1 μg/ml的水飛薊素處理皆顯著提高了AMPKα蛋白水平(P<0.05)。見圖2。

圖1　SIRT1蛋白的表達量

圖2　AMPKα蛋白和AMPKα磷酸化的表達量

3　討　論

年齡老化和能量過剩常導致氧化應激增加和機體的抗氧化功能下降，是引發(fā)腎臟病等多種慢性疾病的重要原因。腎臟內的活性氧(ROS)產生過多，超過機體的抗氧化能力，ROS和細胞內的大分子如脂質、蛋白質和DNA發(fā)生氧化反應，產生氧化損傷〔6〕。ROS是由氧激發(fā)的化學性質十分活潑的分子，是氧化應激的基礎環(huán)節(jié)〔7〕。盡量減少ROS生成和清除過量的ROS是腎臟抗氧化應激的有效策略。然而，對于腎的氧化損傷目前并沒有有效的治療方法。因此，如果能找到一種安全、有效的藥物來防治腎的氧化損傷，對人類健康具有重大意義。

人體本身存在強大的抗氧化系統(tǒng)，包括抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和一些小分子，如維生素C等〔8～11〕。在正常情況下，這些抗氧化酶和小分子可清除體內過剩自由基，保持氧化應激/抗氧化系統(tǒng)的平衡，保持內環(huán)境的穩(wěn)定〔12〕。但是外界進入的ROS過多，或由于機體自身疾病，產生了過多的ROS時，機體的抗氧化作用被削弱，氧化應激/抗氧化系統(tǒng)發(fā)生失衡，就會引起氧化損傷〔13〕。本文顯示了水飛薊素對腎小球內皮細胞的氧化損傷的保護效應。

本文結果驗證了水飛薊素對SIRT1的影響及后者在水飛薊素的保護作用中的可能作用。研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1減少可加重氧化應激導致的腎臟損傷和腎臟的纖維化，而給予SIRT1激動劑可減輕由氧化應激引起的腎臟損傷，顯示了SIRT1在保護腎臟氧化損傷方面的重要作用〔14,15〕。

研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1可通過脫乙酰作用使細胞核中的組蛋白乙酰化水平下降，從而調節(jié)有關基因，如AMPKα的表達〔16〕。AMPK是細胞能量調節(jié)器作為一個重要的信號通路，參與細胞蛋白質合成、機體炎癥反應和氧化應激等過程，在細胞保護機制中發(fā)揮了重要作用〔17〕。本文結果說明，水飛薊素的保護效應的機制不是提高了AMPKα mRNA水平，而是激活了AMPKα 的蛋白表達和磷酸化。水飛薊素提高了腎小球內皮細胞SIRT1 mRNA水平和蛋白水平，后者繼而激活了AMPKα 的蛋白表達和磷酸化。 Suchankova等〔18〕研究發(fā)現(xiàn)，在高糖條件的作用下，HepG2細胞可以抑制SIRT1的活性，從而抑制AMPK的激活。另一項研究發(fā)現(xiàn)，若給予細胞SIRT1的激活劑SRT1720，AMPK也得到激活〔19〕。此外，Ajmo等〔20〕發(fā)現(xiàn)，SIRT1的激活劑白黎蘆醇可以同時激活SIRT1和AMPK，進而抑制核轉錄因子甾體調節(jié)元件結合蛋白1的活性，有效減輕酒精性肝損傷。 對于SIRT1激活AMPK的機制，研究顯示，SIRT1可通過使AMPK上游激酶LKB去乙?；?，從而激活AMPK〔21〕。本研究證實水飛薊素可能通過調節(jié)細胞內SIRT1及AMPKα蛋白的表達及AMPKα磷酸化發(fā)揮抗氧化損傷的作用，為水飛薊素在腎臟疾病方面的應用奠定了基礎。

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〔2014-12-11修回〕

(編輯苑云杰/曹夢園)

南通市社會事業(yè)科技創(chuàng)新與示范計劃(No.HS2012027)

郝傳錚(1960-)，女，碩士，主任醫(yī)師，碩士生導師，主要從事中醫(yī)腎病、老年病防治研究。

R285.5

A

1005-9202(2016)18-4430-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.18.012

1南通大學醫(yī)學院13級研究生