吳　丹　呂　望　虞　莉　周振宇　胡耶基　胡　堅(jiān)

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，浙江　杭州　310006)

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溴結(jié)構(gòu)蛋白4在食管鱗癌中的表達(dá)及JQ-1對(duì)其活性的抑制作用

吳丹呂望虞莉周振宇胡耶基胡堅(jiān)

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，浙江杭州310006)

目的探討溴結(jié)構(gòu)蛋白(BRD)4在食管鱗癌中的表達(dá)特征及靶向抑制內(nèi)源性BRD4的活性對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖的影響及作用機(jī)制。方法免疫組化染色檢測(cè)80例食管鱗癌和配對(duì)癌旁組織中BRD4的表達(dá)情況，分析BRD4的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系，分析其在預(yù)后評(píng)估中的價(jià)值。小分子抑制劑JQ-1作用于食管鱗癌細(xì)胞EC109，MTT分析抑制內(nèi)源性BRD4的活性對(duì)細(xì)胞增殖的影響；流式細(xì)胞術(shù)分析JQ-1干預(yù)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響；Western印跡檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果BRD4陽(yáng)性表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，癌組織較癌旁組織表達(dá)顯著增高；BRD4的表達(dá)與食管鱗癌的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和病理分期顯著相關(guān)(P<0.01)，BRD4高表達(dá)的患者預(yù)后不良。JQ-1顯著抑制食管鱗癌細(xì)胞的增殖；JQ-1干預(yù)24 h，EC109細(xì)胞的凋亡率顯著上升；細(xì)胞凋亡執(zhí)行蛋白cleaved-caspase3和cleaved-PARP1表達(dá)顯著上調(diào)。結(jié)論BRD的表達(dá)與食管鱗癌疾病進(jìn)展明確相關(guān)，是潛在的預(yù)后評(píng)估標(biāo)記物；抑制內(nèi)源性BRD的活性通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制食管鱗癌細(xì)胞的增殖。因此，BRD4是潛在的食管鱗癌治療靶點(diǎn)。

食管鱗癌；溴結(jié)構(gòu)蛋白(BRD)4

食管癌居我國(guó)癌癥死亡率第四位，每年新發(fā)病例超過(guò)25萬(wàn)〔1〕。我國(guó)食管癌的主要病理類型是鱗癌，因食管鱗癌惡性程度高、病程進(jìn)展迅速、易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，患者總體預(yù)后仍然較差〔2〕。溴結(jié)構(gòu)蛋白(BRD)4是box基因家族轉(zhuǎn)錄因子(BET)家族的一員，含有兩個(gè)溴結(jié)構(gòu)域和一個(gè)超末端結(jié)構(gòu)〔3〕。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，BRD4表達(dá)的失調(diào)或功能紊亂與黑色素瘤、急性髓系白血病、結(jié)腸癌、乳腺癌等腫瘤的發(fā)生有關(guān)，BRD4 shRNA或BET抑制劑可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生周期阻滯、凋亡或分化，顯示出強(qiáng)大的抗腫瘤活性〔4～6〕。這些研究表明，BRD4有望成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。本研究探討B(tài)RD4在食管鱗癌中的表達(dá)情況及小分子抑制劑JQ-1對(duì)食管鱗癌細(xì)胞內(nèi)源性BRD4活性的抑制作用。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1一般資料選取2006年1月至2015年12月慈溪市人民醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除的80例Ⅰ～Ⅲ期(AJCC 2009年版)食管鱗癌患者，Ⅰ期6例、Ⅱ期38例、Ⅲ期36例，年齡48～82歲，平均年齡64.7歲。所有病例術(shù)前均未行放化療，無(wú)其他腫瘤史，臨床及病理資料完整；癌旁組織選擇距癌組織邊緣>5 cm處，所有標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛固定，常規(guī)脫水后石蠟包埋，每例病理切片均經(jīng)兩位病理醫(yī)師確診。術(shù)后開始隨訪，截止于2015年12月，失訪5例，隨訪率為93.4%。

1.1.2藥物和細(xì)胞株JQ-1購(gòu)自Selleckchem公司(純度≥98%)；用二甲基亞砜(DMSO)配成50 mmol/L的母液，-20℃保存，使用時(shí)用培養(yǎng)液稀釋至目標(biāo)濃度。人食管鱗癌細(xì)胞EC109購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.1.3試劑胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液、0.25%胰酶-0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)購(gòu)自CORNING公司；噻唑藍(lán)(MTT)、牛血清白蛋白(BSA)購(gòu)自Sigma公司；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BD Pharmingen公司；兔抗人BRD4、cleaved-caspase3、cleaved-PARP1和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)多克隆抗體，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體均購(gòu)自為Abcam公司產(chǎn)品；免疫組化檢測(cè)試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒購(gòu)自DAKO公司；電化學(xué)發(fā)光法(ECL)發(fā)光試劑購(gòu)自Bio-Rad公司。

1.1.4主要儀器石蠟切片機(jī)(Thermo公司)，病理組織烘漂處理儀(Thermo公司)，BX41光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS公司)，顯微成像系統(tǒng)(OLYMPUS公司)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo公司)，iMARK酶標(biāo)儀(Bio-Rad公司)，CytoFLEX流式細(xì)胞儀(Beckman公司)，垂直電泳及蛋白轉(zhuǎn)膜裝置(Bio-Rad公司)，凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1免疫組化染色分析食管組織BRD4蛋白的表達(dá)石蠟切片在60℃烤箱中烤2 h，經(jīng)脫蠟、水化、抗原修復(fù)、3%羊血清封閉后，加兔抗人BRD4多克隆抗體(1∶2 000稀釋)，室溫孵育2 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗片后加生物素化的二抗及鏈霉親合素-生物素-過(guò)氧化物酶(SABC)復(fù)合物，室溫反應(yīng)30 min，洗片后DAB顯色，蘇木素復(fù)染，經(jīng)脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察組織染色情況并拍照。結(jié)果判斷：陽(yáng)性定位，BRD4蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，呈棕黃色顆粒。定性：在切片中染為淡黃色至棕黃色作為陽(yáng)性標(biāo)志；將陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分為4類：(-)為陽(yáng)性細(xì)胞<1%；(+)為陽(yáng)性細(xì)胞占1%～24%；()為陽(yáng)性細(xì)胞占25%～50%；()為陽(yáng)性細(xì)胞>50%；綜合染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)判定食管組織BRD4蛋白高表達(dá)和低表達(dá)。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)EC109細(xì)胞以含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)于37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

1.2.3MTT實(shí)驗(yàn)分析JQ-1的細(xì)胞毒作用EC109細(xì)胞按每孔1×104個(gè)接種于96孔培養(yǎng)板，細(xì)胞貼壁后棄去上清，加入100 μl含20、40、80和120 μmol/L JQ-1的含藥培養(yǎng)液，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，空白對(duì)照組加入等體積的完全培養(yǎng)液。藥物作用24 h，MTT法分析JQ-1對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，酶標(biāo)儀測(cè)定各孔490 nm處吸光度值(A)，計(jì)算細(xì)胞存活率(%)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡率EC109細(xì)胞以每孔3×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板。細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)組加入40、80、120 μmol/L濃度的含藥培養(yǎng)液，空白對(duì)照組加入等體積的完全培養(yǎng)液。JQ-1作用24 h，收集各組細(xì)胞，取100 μl單細(xì)胞懸液，加入Annexin V-FITC(5 μl)和PI(10 μl)混勻，室溫避光孵育15 min，加入400 μl 1×結(jié)合緩沖液，上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.5Western印跡檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理同1.2.4。提取JQ-1作用24 h的各組細(xì)胞總蛋白，DC法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。取各實(shí)驗(yàn)組20 μg蛋白行聚丙烯酰胺凝膠-十二烷基硫酸鈉(PAGE-SDS)電泳，250 mA恒流電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。10%脫脂奶粉溶液封閉1 h，多克隆抗cleaved-caspase3、cleaved-PARP1和GAPDH抗體(1∶1 000)室溫孵育2 h，Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗膜3次，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗膜。滴加ECL試劑于凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)曝光，分析目的蛋白的表達(dá)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS20.0軟件，采用χ2檢驗(yàn)分析BRD4的表達(dá)情況與臨床病理特征的關(guān)系，單因素分析采用Kaplan-Meier法，組間比較用Log-rank檢驗(yàn)，其他計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)。

2　結(jié)　果

2.1食管鱗癌組織和癌旁組織中BRD4的表達(dá)情況80例食管鱗癌組織BRD4高表達(dá)34例(42.5%)，癌旁組織BRD4高表達(dá)有16例(20.0%)，兩者比較差異顯著(P<0.01)。見圖1。

2.2BRD4在食管鱗癌組織中的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系BRD4的表達(dá)與年齡、性別和T分期無(wú)相關(guān)性(P>0.05)，與食管鱗癌的分化程度、N分期和病理分期密切相關(guān)(P<0.05)。見表1。

圖1　食管鱗癌和癌旁組織BRD4表達(dá)(DAB，×200)

臨床病理特征n高表達(dá)低表達(dá)χ2值P值年齡(歲) <653615210.0190.892 ≥65441925性別 男5624320.0100.921 女241014分化程度 中-高分化5719386.8170.009 低分化23158T分期 T1,T2153123.8250.051 T3,T4653134N分期 N04212307.0200.008 N1,N2,N3382216病理分期 Ⅰ,Ⅱ4613338.9800.003 Ⅲ342113

2.3BRD4在食管鱗癌組織中的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系34例BRD4高表達(dá)的患者1年累積生存率為73.5%，3年累積生存率為11.8%，5年累積生存率為8.8%；46例BRD4低表達(dá)的患者1年累積生存率為78.3%，3年累積生存率為50.0%，5年累積生存率為34.8%；BRD4蛋白低表達(dá)組的5年生存率明顯高于高表達(dá)組(P=0.001)。Kaplan-Meier單因素分析提示，BRD4表達(dá)、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移、T分期和病理分期是影響總生存預(yù)后的獨(dú)立因素(P<0.05)，見圖2。

圖2　不同BRD4蛋白表達(dá)食管鱗癌患者的積累生存率比較

2.4JQ-1抑制食管鱗癌細(xì)胞EC109的增殖不同濃度的JQ-1干預(yù)細(xì)胞24 h，明顯抑制EC109細(xì)胞的增殖，呈劑量依賴關(guān)系?？瞻讓?duì)照組設(shè)為1，20、40、80、120 μmol/L JQ-1組EC109細(xì)胞增殖率分別為(101.5±6.5)%、(87.2±5.2)%、(42.3±4.8)%、(5.6±2.2)%。

2.5JQ-1誘導(dǎo)食管鱗癌細(xì)胞凋亡JQ-1作用24 h，EC109細(xì)胞凋亡率(含早期凋亡和晚期凋亡)與空白對(duì)照組〔(2.6±4.5)%〕相比顯著上升(P<0.01)，40、80、120 μmol/L JQ-1組凋亡率分別為(8.1±5.2)%，(49.7±6.3)%，(99.7±1.0)%。

2.6JQ-1上調(diào)食管鱗癌細(xì)胞表達(dá)凋亡相關(guān)蛋白JQ-1干預(yù)24 h，EC109細(xì)胞表達(dá)caspase3和PARP1的剪切活化片段cleaved-caspase3和cleaved-PARP1顯著增加。見圖3。

圖3　JQ-1促進(jìn)EC109細(xì)胞表達(dá)凋亡相關(guān)蛋白

3　討　論

BRD4蛋白是BET家族的一員，bromodomain蛋白BET通過(guò)與乙?；馁嚢彼峤Y(jié)合，參與胞核大分子的裝配及與染色質(zhì)的結(jié)合，調(diào)節(jié)DNA的復(fù)制、DNA損傷修復(fù)、染色質(zhì)重塑和基因轉(zhuǎn)錄等過(guò)程〔7〕。最新研究證實(shí)，BRD4的表達(dá)異常與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔4～6〕。Liao等〔8〕報(bào)道，BRD4的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的組織學(xué)分型、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和病理分期相關(guān)，與患者的預(yù)后不良相關(guān)。Yan等〔9〕發(fā)現(xiàn)，BRD4的表達(dá)與膀胱尿路上皮癌(UCB)的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，是UCS的一個(gè)獨(dú)立預(yù)后因素。目前，BRD4蛋白在食管鱗癌預(yù)后預(yù)測(cè)中的價(jià)值未見報(bào)道，本研究發(fā)現(xiàn)BRD4作為生物標(biāo)記物在食管鱗癌中具有重要的臨床預(yù)測(cè)價(jià)值。由于本研究的樣本量偏少，期待今后的研究能夠增加樣本量，以獲得更有說(shuō)服力的結(jié)果。

BET抑制劑具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯、凋亡以及細(xì)胞分化的作用，顯示出強(qiáng)大的抗腫瘤活性〔5〕。本文發(fā)現(xiàn)，BRD4抑制

劑JQ-1抑制食管鱗癌細(xì)胞EC109的增殖；JQ-1作用24 h，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率和凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase3和cleaved-PARP1表達(dá)水平均顯著增高。在凋亡信號(hào)傳遞過(guò)程中，caspase3處于信號(hào)通路的樞紐位置，具有執(zhí)行細(xì)胞凋亡的功能。酶原形式的caspase3被剪切成17 kD/19 kD的活性二聚體，進(jìn)而將底物PARP1水解成89和24 kD的片段，使其失去修復(fù)DNA損傷的功能，導(dǎo)致受PARP1負(fù)調(diào)控的核酸內(nèi)切酶活性增高，降解核小體DNA引起凋亡〔10〕。本研究提示，抑制內(nèi)源性BRD的活性通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制食管鱗癌細(xì)胞的增殖，因此，BRD4是潛在的食管鱗癌治療靶點(diǎn)。

近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，BRD4的bromodomain Ⅱ可與雙乙?；腡wist(Twist K73ac/K76ac)結(jié)合，同時(shí)BRD4的bromodomain Ⅰ與組蛋白H4 K5ac/K8ac結(jié)合，從而在Wnt5a的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子上形成Twist/BRD4/P-TEFb/RNA-Pol Ⅱ復(fù)合物激活其轉(zhuǎn)錄；促進(jìn)基底樣乳腺癌(BLBC)細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和侵襲性生長(zhǎng)〔11〕。BRD4是否具有介導(dǎo)食管鱗癌獲得EMT表型的功能，JQ-1靶向抑制BRD4的活性是否具有抑制食管鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用效應(yīng)有待進(jìn)一步研究。

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〔2015-09-17修回〕

(編輯袁左鳴)

慈溪市科技計(jì)劃項(xiàng)目(CN2015020)

胡堅(jiān)(1964-)，男，主任醫(yī)師，教授，主要從事消化道腫瘤研究。

吳丹(1978-)，男，副主任醫(yī)師，現(xiàn)工作于溫州醫(yī)科大學(xué)附屬慈溪醫(yī)院，主要從事消化道腫瘤研究。

R735

A

1005-9202(2016)18-4515-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.18.055