鐘　浩，高貴賓，吳良如，*

(1. 國(guó)家林業(yè)局竹子研究開(kāi)發(fā)中心，浙江 杭州 310012；2. 浙江省竹子高效加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310012)

?

部分茶竿竹亞屬竹種親緣關(guān)系的ITS序列分析

鐘浩1，2，高貴賓1，2，吳良如1，2，*

(1. 國(guó)家林業(yè)局竹子研究開(kāi)發(fā)中心，浙江 杭州 310012；2. 浙江省竹子高效加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310012)

為了探討懷集縣鐵厘茶竿竹和白水茶竿竹與其他茶竿竹亞屬竹種之間在分子水平上的差異以及它們的分類地位，對(duì)包括鐵厘茶竿竹和白水茶竿竹在內(nèi)的9個(gè)茶竿竹亞屬竹種的核糖體基因(nrDNA)的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)序列進(jìn)行分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果表明，所有供試材料ITS全長(zhǎng)在559～648 bp，(G+C)含量變化范圍為46.02%～57.65%，其中鐵厘茶竿竹和白水茶竿竹ITS全長(zhǎng)分別為559 bp和614 bp，(G+C)含量分別為55.64%和57.65%。ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示：正種茶竿竹及其變種聚為一個(gè)大支，其中鐵厘茶竿竹和白水茶竿竹聚在一起。以上結(jié)果佐證了鐵厘茶竿竹和白水茶竿竹是正種茶竿竹的2個(gè)變種。

正種茶竿竹；ITS；系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

正種茶竿竹(Pseudosasaamabilis)，屬禾本科竹亞科(Bambusoideae Nees)矢竹屬(Pseudosasa)茶竿竹組的模式種[1]，是我國(guó)特產(chǎn)的珍貴竹種之一，竹稈通直、節(jié)平、壁厚、光滑、堅(jiān)韌、材質(zhì)優(yōu)良，可制作各種竹器家具、雕刻裝飾、釣魚竿、滑雪杖、旗竿、籬笆等。竹材纖維含量達(dá)53.2%，適于造紙和制人造絲漿[2]。正種茶竿竹主產(chǎn)于江西、福建、湖南、廣東、廣西等省區(qū)，近年，江蘇、浙江省有引種栽培，模式標(biāo)本采自廣東廣寧[1]，生于丘陵平原或河流沿岸的山坡。

中國(guó)植物志記載，茶竿竹亞屬有16種5變種[1]，均分布在我國(guó)華南、華東地區(qū)之南部，而徐英寶等[2]報(bào)道，懷集縣有3個(gè)變種，即正種茶竿竹(var.amabilis)、鐵厘茶竿竹(var.ferrea)和白水茶竿竹(var.peshuiensis)，在植物志中沒(méi)有記載，其他文獻(xiàn)也未見(jiàn)報(bào)道。

內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer，ITS)，在被子植物較低的分類階元上具有核苷酸序列的高度變異性和長(zhǎng)度保守性，它能提供詳盡的、系統(tǒng)學(xué)分析所需的可遺傳性狀，在許多被子植物的科內(nèi)、屬內(nèi)和屬間關(guān)系的系統(tǒng)發(fā)育研究中已被證明是十分有用的分子標(biāo)記[3-4]。ITS分子標(biāo)記也已廣泛應(yīng)用于竹類植物[5-8]。ITS序列短(600～700 bp)、兩端連接高度保守區(qū)，而且具有拷貝數(shù)多、長(zhǎng)度保守、一致進(jìn)化、進(jìn)化速率較快等優(yōu)點(diǎn)，適用于被子植物近緣屬間及種間甚至居群間關(guān)系的系統(tǒng)學(xué)研究[3，9]。本文利用ITS分子標(biāo)記對(duì)部分茶竿竹亞屬進(jìn)行親緣關(guān)系分析，從分子水平探討懷集縣鐵厘茶竿竹和白水茶竿竹的分類地位。

1　材料與方法

1.1材料

材料收集包括茶竿竹5個(gè)變種，包括正種茶竿竹、福建茶竿竹(var.convexa)、薄籜茶竿竹(var.tenuis)、鐵厘茶竿竹(var.ferrea)和白水茶竿竹(var.peshuiensis)；還采集了茶竿竹亞屬的其他4個(gè)種，包括斑籜茶竿竹(P.notate)、筆竿竹(P.guangxianensis)、近實(shí)心茶竿竹(P.subsolida)和尖籜茶竿竹(P.acutivagina)(表1)。其中福建茶竿竹、薄籜茶竿竹、筆竿竹、近實(shí)心茶竿竹、斑籜茶竿竹和尖籜茶竿竹采自福建華安竹種園；正種茶竿竹、鐵厘茶竿竹和白水茶竿竹采自廣東省肇慶市懷集縣。采集的樣品均通過(guò)福建省華安縣林業(yè)局華安竹種園鄒躍國(guó)高級(jí)工程師的形態(tài)學(xué)鑒定。采集竹子嫩葉的混合樣，經(jīng)變性硅膠快速干燥后帶回實(shí)驗(yàn)室置于-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1材料名稱及編號(hào)

Table 1The number and name of the samples

編號(hào)種名采樣點(diǎn)1鐵厘茶竿竹P.amabilisvar.ferrea廣東懷集2福建茶竿竹P.amabilisvar.convexa福建華安3近實(shí)心茶竿竹P.subsolida福建華安4薄籜茶竿竹P.amabilisvar.tenuis福建華安5斑籜茶竿竹P.notate福建華安6尖籜茶竿竹P.acutivagina福建華安7正種茶竿竹P.amabilis廣東懷集8筆竿竹P.guangxianensis福建華安9白水茶竿竹P.amabilisvar.peshuiensis廣東懷集

1.2方法

1.2.1基因組DNA的提取

采用改良的CTAB法提取9個(gè)竹種的基因組DNA[10]，用Titertek-Berthold Colibri超微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的濃度和純度，取1 μL在1%TAE瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量，然后定量至100 ng·μL-1，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2ITS序列擴(kuò)增與測(cè)序

根據(jù)文獻(xiàn)[11]由上海生工合成引物ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)，對(duì)ITS1-5.8S rDNA-ITS2區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。20 μL反應(yīng)體系含50～100 ng基因組DNA，0.2 μmol·L-1ITS5，0.2 μmol·L-1ITS4，2 UExTaq聚合酶，1×PCR緩沖液 (10 mmol·L-1Tris-HCl， pH 8.3; 50 mmol·L-1KCl)，1.5 mmol·L-1MgCl2，0.2 mmol·L-1dNTP。反應(yīng)條件如下：94 ℃ 5 min；94 ℃ 60 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min；4 ℃保溫[12]。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收、連接(載體為pMD18-T Vector)、大腸桿菌轉(zhuǎn)化(菌株為DH5α)和菌液PCR檢測(cè)后，將陽(yáng)性克隆的菌液送上海生工進(jìn)行測(cè)序，同時(shí)也進(jìn)行PCR產(chǎn)物直接測(cè)序，克隆測(cè)序與PCR產(chǎn)物直接測(cè)序結(jié)果相同的ITS序列用于研究[13]。

1.2.3數(shù)據(jù)處理

將測(cè)序獲得的序列與GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列用blastn程序進(jìn)行相似性比對(duì)，利用Vector NTI 11.5.1軟件選取Clustal W方法進(jìn)行多重序列比對(duì)，比對(duì)結(jié)果利用MEGA 6.0軟件的非加權(quán)組平均法(UPGMA)構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。通過(guò)DnaSP version 5.10軟件(http://www.ub.es/dnasp/)[12，14]分析核苷酸多樣性。

2　結(jié)果與分析

2.1ITS序列PCR擴(kuò)增結(jié)果

從9個(gè)茶竿竹亞屬竹種基因組DNA中均擴(kuò)增出一條約600 bp的片段，圖1所示為其中7個(gè)竹種的擴(kuò)增結(jié)果。

M： GeneRulerTM 100 bp DNA Ladder； 1～4， 6～8： 見(jiàn)表1； CK： 以水為對(duì)照。圖1　引物ITS5和ITS4對(duì)茶竿竹亞屬竹種的ITS序列擴(kuò)增結(jié)果Fig.1　The amplification result of Chagan-bamboo species by ITS5 and ITS4

2.2PCR產(chǎn)物克隆

獲得的片段轉(zhuǎn)化至大腸桿菌后，以白色菌落培養(yǎng)的菌液為模板，用測(cè)序引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，取PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)[12]，如圖2。

2.3測(cè)序結(jié)果及序列分析

測(cè)序獲得的序列用blastn程序進(jìn)行相似性比對(duì)確定為ITS區(qū)序列。以9個(gè)茶竿竹亞屬竹種為研究對(duì)象，粳稻(Oryzasativassp.japonica)日本晴作為外類群進(jìn)行同源性分析(圖3)。由表2可知，9個(gè)竹種及水稻ITS序列之間的相似性均高于60%，其中福建茶竿竹和薄籜茶竿竹之間達(dá)99%。

M： GeneRulerTM 100 bp DNA Ladder； 1～9： 見(jiàn)表1； CK： 以水為對(duì)照。圖2　菌液PCR鑒定結(jié)果Fig.2　The result after idenfication of the bacteria liquid

表2九個(gè)茶竿竹亞屬竹種ITS序列同源性分析

Table 2Homologous analysis of ITS from 9 Chagan-bamboo species

192478365Os193868684867677726998484838275747263299948978767267494907876726778776737268877777166370686166862560Os

注：表中數(shù)值為ITS序列通過(guò)CLUSTAL W多重序列比對(duì)后計(jì)算所得相似性；1～9：見(jiàn)表1；Os：水稻。

9個(gè)茶竿竹亞屬竹種ITS序列長(zhǎng)度差異較大，為559～648 bp，(G+C)含量變化范圍為46.02%～57.65%。而與外類群日本晴相比，無(wú)論是序列長(zhǎng)度還是(G+C)含量都存在較大的差異(表3)。

9個(gè)茶竿竹亞屬竹種ITS序列中共有118個(gè)單一信息位點(diǎn)(singleton variable sites)，其中二變異體信息位點(diǎn)80個(gè)，三變異體信息位點(diǎn)33個(gè)，四變異體信息位點(diǎn)5個(gè)；142個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)(parsimony informative sites)，其中二變異體信息位點(diǎn)62個(gè)，三變異體信息位點(diǎn)60個(gè)，四變異體信息位點(diǎn)20個(gè)。插入/缺失位點(diǎn)(InDel)141個(gè)(表4)。

表3ITS序列(G+C)含量和長(zhǎng)度多態(tài)性分析

Table 3(G+C) contents and length polymorphism of ITS

植物材料長(zhǎng)度/bp(G+C)含量/%155955.64256555.58364850.93456755.56559146.02663653.62757155.17856555.22961457.65Os79948.56

注：1～9：見(jiàn)表1；Os：水稻。

紅色方框表示引物ITS5和ITS4所在的位置； 1～9： 見(jiàn)表1； Os： 水稻。圖3　九個(gè)茶竿竹亞屬竹種ITS序列同源性分析Fig.3　Homologous analysis of ITS from 9 Chagan-bamboo species

表4ITS序列多態(tài)性位點(diǎn)分析

Table 4Polymorphism and InDel sites of ITS

多態(tài)區(qū)域變異類型位點(diǎn)數(shù)量單一信息位點(diǎn)二變異體信息位點(diǎn)80三變異體信息位點(diǎn)33四變異體信息位點(diǎn)5簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)二變異體信息位點(diǎn)62三變異體信息位點(diǎn)60四變異體信息位點(diǎn)20插入/缺失位點(diǎn)141

2.4ITS序列系統(tǒng)演化分析

利用MEGA 6.0軟件的非加權(quán)組平均法(UPGMA)對(duì)9個(gè)茶竿竹亞屬竹種ITS序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)(圖4)。結(jié)果顯示，正種茶竿竹及其變種聚為一個(gè)大枝(圖中黑框所示，自展值為100%)，其中懷集縣的2個(gè)茶竿竹變種鐵厘茶竿竹和白水茶竿竹聚在一起(自展值為100%)，而筆竿竹也在其中。茶竿竹亞屬的其他3個(gè)種，包括斑籜茶竿竹、近實(shí)心茶竿竹和尖籜茶竿竹各成一枝。

3　討論

從以上結(jié)果來(lái)看，聚類比較清晰，與經(jīng)典的茶竿竹亞屬分類(植物志)有其一致性。如筆竿竹在經(jīng)典的分類中就與正種茶竿竹親緣關(guān)系較近，在進(jìn)化樹(shù)中與正種茶竿竹聚在一起；懷集縣的2個(gè)茶竿竹變種鐵厘茶竿竹和白水茶竿竹以100%的支持率聚在一起，它們又與其他3個(gè)茶竿竹變種以100%的支持率聚在一起，從分子水平上佐證了它們是茶竿竹的2個(gè)變種，而且體現(xiàn)了一定的地理特異性。福建茶竿竹和薄籜茶竿竹之間ITS序列相似性達(dá)99%，在進(jìn)化樹(shù)中也以100%的支持率聚在一起，這與植物志中茶竿竹分變種兩者的分類地位一致。其他3個(gè)竹種(尖籜茶竿竹、近實(shí)心茶竿竹和斑籜茶竿竹)在進(jìn)化樹(shù)中的位置也支持經(jīng)典的茶竿竹亞屬分類。

進(jìn)化樹(shù)是將PCR分離的9個(gè)茶竿竹亞屬竹種的ITS序列通過(guò)多重序列比對(duì)以水稻ITS序列為外類群構(gòu)建；顯示的自展值是1 000。圖4　茶竿竹亞屬ITS序列UPGMA系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4　The UPGMA tree of Chagan-bamboo species by using ITS sequences

竹類植物作為進(jìn)化上的一個(gè)特殊類群，其莖(稈)高度木質(zhì)化，營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，且以營(yíng)養(yǎng)繁殖為主，一旦開(kāi)花，整片竹林死亡，導(dǎo)致繁殖器官很難獲得，常用于分類的外部形態(tài)特征也會(huì)由于環(huán)境的變化而變化，使得竹子分類比較困難也比較混亂。本文采用的ITS分子標(biāo)記從分子水平對(duì)茶竿竹亞屬竹種進(jìn)行鑒定，揭示其遺傳物質(zhì)內(nèi)在的差異，沒(méi)有時(shí)空限制。

ITS序列的進(jìn)化較穩(wěn)定、獨(dú)立，序列分析也較少受主觀影響；ITS序列中氨基酸或DNA堿基替換率能夠?yàn)槲锓N間的分支年齡和多樣化率提供更有效的評(píng)估，從而保證更好的分離效率[13]。由于本身位點(diǎn)內(nèi)(intralocus)和位點(diǎn)間(interlocus)進(jìn)化的同步性，在許多物種內(nèi)ITS不存在位點(diǎn)多態(tài)性，一般較少用于種以下水平的研究。但仍有不少報(bào)道發(fā)現(xiàn)ITS序列種內(nèi)、亞種和居群間存在多態(tài)性[15]。大多數(shù)的被子植物種間ITS差異值為1.2%～10.2%，屬間差異值為9.6%～28.8%[15-16]，而本文的研究結(jié)果表明，茶竿竹亞屬內(nèi)種間差異值較高，達(dá)到10%～32%，可見(jiàn)，ITS分子標(biāo)記適用于茶竿竹亞屬內(nèi)系統(tǒng)發(fā)育的研究，當(dāng)根據(jù)形態(tài)鑒別有困難時(shí)，可提供一種候選的，也是可靠的鑒別方法。

[1]耿伯介， 王正平. 中國(guó)植物志第九卷第一分冊(cè)[M]. 北京: 科學(xué)出版社， 1996: 639-659.

[2]徐英寶， 許本立. 廣東懷集茶稈竹生物學(xué)特性的初步研究[J]. 竹子研究匯刊， 1984， 3(2): 48-61.

[3]李林， 董敦義， 丁雨龍. 竹類分子系統(tǒng)學(xué)中的DNA標(biāo)記[J]. 林業(yè)科技開(kāi)發(fā)， 2009， 23(1): 10-15.

[4]張漢堯， 劉小珍， 龔秀會(huì)， 等. 竹子DNA提取方法改良及ITS-RFLP分析的初步研究[J]. 江西林業(yè)科技， 2006 (3): 3-5.

[5]HODKINSON T R， RENVOIZE S A， CHONGHAILE G N， et al. A comparison of ITS nuclear rDNA sequence data and AFLP markers for phylogenetic studies inPhyllostachys(Bambusoideae，Poaceae)[J].JournalofPlantResearch， 2000， 113(3): 259-269.

[6]GUO Z H， CHEN Y Y， LI D Z， et al. Genetic variation and evolution of the alpine bamboos (PoaceaeBambusoideae) using DNA sequence data[J].JournalofPlantResearch， 2001， 114(3): 315-322.

[7]諸葛強(qiáng)， 丁雨龍， 續(xù)晨， 等. 廣義青籬竹屬(Arundinaria)核糖體DNA ITS序列及親緣關(guān)系研究[J]. 遺傳學(xué)報(bào)， 2004， 31(4): 349-356.

[8]GUO Z H， LI D Z. Phylogenetics of theThamnocalamusgroup and its allies (Gramineae:Bambusoideae): inference from the sequences of GBSSI gene and ITS spacer[J].MolecularPhylogeneticsandEvolution， 2004， 30(1): 1-12.

[9]張峰. 用于植物分子系統(tǒng)學(xué)研究的基因片段[J]. 山東科學(xué)， 2004， 17(1): 55-58.

[10]DOYLE J J， DOYLE J L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue[J].Phytochemistry， 1987， 19(1): 11-15.

[11]WHITE T J， BRUNS T， LEE S， et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics[M]//INNIS M A， GELFAND D H， SNINSKY J J， et al. PCR protocols: A guide to methods and applications. New York: Academic Press. 1990: 315-322.

[12]鐘浩.mariner-like轉(zhuǎn)座子在竹亞科的分布、多態(tài)性、進(jìn)化及轉(zhuǎn)座特性的研究[D]. 杭州: 浙江農(nóng)林大學(xué)， 2010.

[13]尹昭坤， 廖承紅， 徐立新， 等. 基于ITS序列分析對(duì)海南普通野生稻秈粳分化的研究[J]. 生物技術(shù)進(jìn)展， 2012， 2(4): 270-275.

[14]LIBRADO P， ROZAS J. DnaSP v5: A software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data[J].Bioinformatics， 2009， 25(11): 1451-1452.

[15]閆艷華， 金華， 侯和勝， 等. 抗逆速生吳屯楊與近緣種的ITS序列分析[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2011， 39(4): 180-183.

[16]屈良鵠， 陳月琴. 生物分子分類檢索表——原理與方法[J]. 中山大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)， 1999， 38(1): 1-6.

(責(zé)任編輯張韻)

Analysis on genetic relationship of some Chagan-bamboo species by using ITS region sequence

ZHONG Hao1，2， GAO Gui-bin1，2， WU Liang-ru1，2，*

(1.ChinaNationalBambooResearchCenter，Hangzhou310012，China; 2.KeyLaboratoryofHighEfficientProcessingofBambooofZhejiangProvince，Hangzhou310012，China)

The molecular differences amongPseudosasaamabilisvar.ferrea，Pseudosasaamabilisvar.peshuiensisand other Chagan-bamboo species were identified by analyzing internal transcribed spacer sequence in nrDNA ofP.amabilisvar.ferrea，P.amabilisvar.peshuiensisand other 7 Chagan-bamboo species. and the phylogenetic tree was established to clarify their taxonomic status. The results showed that ITS length of all tested species ranged from 559 to 648 bp， and their (G+C) content ranged from 46.02% to 57.65%. ITS length ofP.amabilisvar.ferreaandP.amabilisvar.peshuiensiswas 559 bp and 614 bp, respectively. Their (G+C) content was 55.64% and 57.65%, respectively. The established phylogenetic tree showed thatP.amabilisand its varieties were clustered in one big group， in whichP.amabilisvar.ferreaandP.amabilisvar.peshuiensiswere clustered into one small group. The above results indicated thatP.amabilisvar.ferreaandP.amabilisvar.peshuiensiswere two variants ofPseudosasaamabilis.

Pseudosasaamabilis; ITS; phylogenetic tree

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.02.18

2015-06-01

中國(guó)林科院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(CAFYBB2014QA038)；國(guó)家林業(yè)局竹子研究開(kāi)發(fā)中心研究基金項(xiàng)目(ZXJJ201207)；浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014F10047)

鐘浩(1984—)，男，浙江杭州人，碩士，助理研究員，研究方向?yàn)橹褡臃肿舆z傳。E-mail: 13706710845@163.com

，吳良如，E-mail: boteatree@163.com

Q78；S795.1

A

1004-1524(2016)02-0291-06

鐘浩，高貴賓，吳良如.部分茶竿竹亞屬竹種親緣關(guān)系的ITS序列分析[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，28(2)： 291-296.