張小麗，宋曉育，馬小軍，2，*，陳富強，張　晨，張　欣

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730070；2. 甘肅省草食動物生物技術重點實驗室，甘肅 蘭州 730070)

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甘肅地區(qū)綿羊MHC-DRB1基因第2外顯子多態(tài)性與乳房炎的相關性分析

張小麗1，宋曉育1，馬小軍1，2，*，陳富強1，張晨1，張欣1

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730070；2. 甘肅省草食動物生物技術重點實驗室，甘肅 蘭州 730070)

為研究甘肅地區(qū)綿羊MHC-DRB1基因第2外顯子基因多態(tài)性與綿羊乳房炎的相關性，采用PCR-SSCP方法檢測了200只甘肅高山細毛羊和212只小尾寒羊(其中各有43只和48只乳房炎陽性)MHC-DRB1第2外顯子基因多態(tài)性，分析了群體內各等位基因與綿羊乳房炎的關聯(lián)性。結果表明，兩個品種綿羊群體的MHC-DRB1第2外顯子共檢測到13個等位基因，具有高度多態(tài)性(PIC>0.5)，且偏離了哈德溫伯格平衡定律(P<0.01)。兩個品種綿羊乳房炎陰性和陽性個體的13個單倍型序列的差異顯著性檢驗和相對危險值(RR值)計算發(fā)現(xiàn)，甘肅細毛羊中等位基因D(0.01

甘肅高山細毛羊；小尾寒羊；MHC-DRB1第二外顯子；PCR-SSCP；乳房炎

綿羊乳房炎臨床型及隱性乳房炎的發(fā)病原因很多，主要是由病原微生物經(jīng)乳頭口侵入乳頭管引起的乳腺組織感染，其他疾病，如結核病、布氏桿菌病、巴氏桿菌病等，也可引發(fā)本病。目前，對于綿羊隱性乳房炎的發(fā)生關注較少，但它會使患病母羊產(chǎn)乳量降低，甚至不能產(chǎn)乳，造成羔羊死亡；另一方面許多羊因本病而被淘汰，尤其是壞疽性乳房炎的發(fā)病率和死亡率更高，造成嚴重的經(jīng)濟損失。所以用分子遺傳來篩選出與乳房炎抗性較高的綿羊群體，成為控制綿羊乳房炎疾病的另一切入點。

主要組織相容性復合物(major histocompatibility complex，MHC)是在脊椎動物中發(fā)現(xiàn)的能夠編碼免疫球蛋白受體并具有高度多態(tài)性的基因群[1]。MHC基因的產(chǎn)物不僅能夠在各種細胞表面表達，而且可以控制免疫細胞間的相互作用[2]。綿羊白細胞抗原(ovine lymphocyte antigen， OLA)為綿羊的MHC，位于綿羊第20號染色體上，由classⅠ，classⅡ，classⅢ三類基因組成，具有高度多態(tài)性和連鎖不平衡性。大量研究證明綿羊的MHC主要是classⅡ類分子可以遞呈外源性物質給T細胞，調控免疫應答反應作用，而OLA-MHC的classⅡ類分子的DR和DQ亞區(qū)的DRB和DQB兩個基因位點所編碼的抗原在免疫中發(fā)揮重要作用，尤其是編碼抗原功能區(qū)的第二外顯子，其多態(tài)性和遺傳學在機體保護自我對抗疾病感染中發(fā)揮重要作用。大量有關DRB1第二外顯子的多態(tài)性的研究證實，綿羊的MHC-DRB1具有豐富多態(tài)性[3-4]。目前國內外已有研究表明綿羊MHC-DRB1與綿羊的抗線蟲感染[5]、布魯氏菌病[6]、肺腺癌[7]、山羊流產(chǎn)[8]、包蟲病[9]等疾病密切相關。MHC抗原與奶牛乳房炎密切相關，但目前國內外還未見涉及綿羊MHC-DRB1基因與乳房炎相關性的研究報道。本研究擬借鑒奶牛乳房炎抗性分子標記的研究成果，以MHC-DRB1基因為研究對象，采用PCR-SSCP方法對乳房炎陰性和陽性的甘肅細毛羊和小尾寒羊的MHC-DRB1基因第二外顯子的多態(tài)性和乳房炎疾病的感染情況進行分析，篩選綿羊乳房炎抗性分子標記，探討MHC-DRB1基因與綿羊乳房炎的遺傳易感關系，并將其與綿羊乳房炎臨床發(fā)病情況進行相關性分析，為建立綿羊乳房炎抗性分子標記體系提供基礎資料。

1　材料與方法

1.1材料

采集甘肅地區(qū)綿羊血液樣本412份，包括43份甘肅高山細毛羊乳房炎陽性樣本、48份小尾寒羊乳房炎陽性樣本和157份甘肅高山細毛羊、164份小尾寒羊乳房炎陰性樣本。在頸靜脈采集血液10 mL，裝入內有1 mL滅菌ACD抗凝劑的10 mL滅菌離心管，并用冰盒帶回實驗室，置于-20 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法

1.2.1基因組DNA提取

采用常規(guī)實驗室的酚/氯仿[10]提取法，從血樣中提取基因組DNA并溶解于TE緩沖液，在1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，放于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2引物設計及PCR擴增

引物設計參照文獻并結合GenBank上的序列(NM_001123402)設計：上游引物：5′-ATCCTCTCTCTGCAGCACATTTCC-3′；下游引物：5′-TTTAAATTCGCGCTCACCTCGCCGCT-3′。擴增目的片段約為300 bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

PCR擴增體系：總體積25 μL，其中上下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，滅菌雙蒸水8.0 μL，2×Taqmix 13.0 μL。PCR反應條件：預變性95 ℃，5 min；變性95 ℃，30 s；退火55 ℃，45 s；延伸72 ℃，45 s，33個循環(huán)；最后延伸72 ℃ 10 min。4 ℃保存，PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3PCR產(chǎn)物的SSCP檢測

取2.0 μL PCR產(chǎn)物，8 μL變性上樣緩沖溶液，含98%去離子甲酰胺、0.03%二甲苯青、0.025%溴酚藍、0.5 mol·L-1EDTA(pH 8.0)，98 ℃變性10 min，然后迅速放于冰上10 min。12%非變性聚丙烯酰胺凝膠(Arc∶Bis=39∶1)，4 ℃，160 V條件下，電泳24 h，銀染顯色法結束后拍照判型。

1.2.4OLA-DRB1第2外顯子克隆測序

SSCP分析之后，選取不同基因型個體PCR擴增膠回收產(chǎn)物克隆，克隆選用公司克隆試劑盒并轉入DH5α菌株，陽性菌液送至金唯智生物科技有限公司測序。

1.2.5乳房炎的判定

將采集的乳汁送中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州畜牧與獸醫(yī)研究所，采用小型體細胞自動計數(shù)儀檢測，以40萬個·mL-1為閾值，體細胞數(shù)大于40萬個·mL-1的則判定為隱性乳房炎。

1.2.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 17.0計算甘肅地區(qū)綿羊各個基因型的頻率、等位基因頻率；用POPGNE計算純合度(Ho)、雜合度(He)和有效等位基因數(shù)(Ne)；用PIC軟件計算多態(tài)信息含量(PIC)；用MEGA 5.0進行核苷酸序列及氨基酸序列比對，DNAMAN進行NJ進化樹的構建。

2　結果與分析

2.1PCR擴增結果

對采集的412只綿羊DRB1基因第2外顯子進行PCR擴增，片段大小為300 bp，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)，目的條帶清晰，無雜帶(圖1)，可以進行下一步SSCP檢測。

M: Maker; 1-6: PCR產(chǎn)物圖1　DRB1第2外顯子PCR擴增結果Fig.1　PCR products of DRB1 gene exon 2

2.2PCR-SSCP檢測結果

PCR產(chǎn)物進行SSCP檢測發(fā)現(xiàn)，412只甘肅地區(qū)綿羊個體中共檢測到13個等位基因，其電泳條帶從1條到3條不等，分別命名為等位基因A，B，C…M(圖2)。

2.3DRB1第2外顯子核苷酸位點變異類型與多態(tài)性

對412份甘肅綿羊和小尾寒羊DRB1基因第2外顯子的13個等位基因序列分析發(fā)現(xiàn)，13個等位基因中存在59個變異位點，占核苷酸分析位點19.67%，其中轉換位點22個，占變異位點37.29%，包括A/G轉換14個、T/C轉換8個；顛換25個，占變異位點42.37%，包括A/C顛換8個、A/T顛換5個、G/C顛換8個、G/T顛換2個、C/G和C/A顛換共存2個，轉換和顛換共存位點12個(圖3)。大量的核苷酸位點改變導致氨基酸發(fā)生改變(圖4)。

圖2　MHC-DRB1第二外顯子SSCP檢測結果Fig.2　Electrophoresis map of MHC-DRB1 gene exon 2 by PCR-SSCP

2.4甘肅高山細毛羊和小尾寒羊DRB1基因第2外顯子遺傳信息

遺傳雜合度(He)、有效等位基因數(shù)(Ne)、多態(tài)信息含量(PIC)是評價群體遺傳變異的重要指標。兩個綿羊品種的DRB1基因第2外顯子的遺傳多態(tài)性如表1所示，PIC>0.5，為高度多態(tài)。

圖3　MHC-DRB1基因第2外顯子等位基因核苷酸序列比對結果Fig.3　Nucleotide sequence alignment of MHC-DRB1 gene exon 2 alleles

表1DRB1第二外顯子遺傳多態(tài)性分析

Table 1The genetic polymorphisms ofDRB1 gene exon 2

品種純合度Ho雜合度He有效等位基因數(shù)Ne多態(tài)信息含量PIC甘肅細毛羊0.08600.914011.34260.9049小尾寒羊0.09220.907810.60500.8982

注：0.250.5為高度多態(tài)；PIC<0.25為低度多態(tài)。

2.5甘肅細毛羊和小尾寒羊DRB1第2外顯子與乳房炎相關性分析

兩個綿羊品種的DRB1基因第2外顯子的等位基因頻率見表2、表3。結果表明，兩個品種綿羊乳房炎陽性個體中均不存在等位基因K，而等位基因E在甘肅細毛羊乳房炎陽性個體中存在，等位基因D只在小尾寒羊乳房炎陽性個體中出現(xiàn)。將乳房炎陰性和陽性綿羊等位基因頻率進行差異顯著性分析(t檢驗)和相對危險值計算，結果表明，甘肅細毛羊中等位基因D(0.01

乳房炎陰性和陽性小尾寒羊差異顯著性和相對危險值分析結果顯示(表3)，等位基因K(0.01

2.6DRB1基因第2外顯子進化樹分析

為了解這兩個綿羊種群DRB1基因第2外顯子的等位基因與其他相應等位基因之間的遺傳關系，利用DNAMAN軟件對其DRB1基因第2外顯子序列進行NJ樹構建(圖5)，用作構建系統(tǒng)發(fā)育樹的序列是(括號內為GenBank登錄號)：等位基因MHC-DRB1C1 (DQ659127)，*0702(FM209041)，*1303(FR751085)，MHC-DRB1L(AY884017)，*1301(AM885933)，*0701(KC733423)，*1203(AY691948)，*1402(FN393733)，*1403(JX236662)，1401(FM164421)，*1503(FN870431)，*1502(FM212560)，*1901(KC733431)，*07(KC733420)，*2601(LN613183)，*0901(FN543119)，*09(AB008355)，*0806(JX23666)。圖5顯示DRB1-A與MHC-DRB1C1(DQ659127)聚合在一起，自展值(bootstrap value)為100%，等位基因I與*0701(KC733423)和*1203(AY691948)聚合在一起，自展值為99%，等位基因B與MHC-DRB1L(AY884017)、等位基因K和*1303(FR751085)聚合在一起，自展值為98%，等位基因F與J和*0901(FN543119)聚合在一起，自展值為92%。以上自展值均很高，表明該聚類分析具有較高的可靠性；同時，根據(jù)系統(tǒng)樹上標記的自展值，可以把整個聚類圖分為兩大支，除了等位基因J和*0901聚為一支外，其他等位基因聚在另外一支上。根據(jù)聚類圖也可以看出，本研究發(fā)現(xiàn)的等位基因在2個分支中均有分布，表明甘肅地區(qū)的2個綿羊群體與其他綿羊品種在DRB1基因等位基因上的差異較小，同源性較高。

表2乳房炎陰性和陽性甘肅細毛羊DRB1基因第2外顯子等位基因頻率

Table 2Allele frequencies of theDRB1 gene exon 2 in infected mastitis and healthy Gansu alpine fine-wool sheep

等位基因乳房炎陰性乳房炎陽性數(shù)量等位基因頻率數(shù)量等位基因頻率RR值A190.067140.0930B90.048820.0465C230.073230.0698D160.1098*00.00000.898E80.048840.0930F100.042780.1860*3.360G110.061030.0698H150.152450.1163I110.128060.1395J130.054950.1163K80.091500.0000L30.036610.0233M110.085420.0465

注：乳房炎陰性與陽性甘肅細毛羊DRB1相同等位基因間，*表示差異顯著 0.01

表3乳房炎陰性和陽性小尾寒羊DRB1基因第2外顯子等位基因頻率

Table 3Allele frequencies of theDRB1 gene exon 2 in infected mastitis and healthy Small Tail Han sheep

等位基因乳房炎陰性乳房炎陽性數(shù)量等位基因頻率數(shù)量等位基因頻率RR值A110.067150.1042B80.048840.0833C120.073210.0208D180.109820.0417E80.048800F70.042790.1875**5.176G100.061020.0417H250.1524120.2500I210.128060.1250J90.054930.0625K150.0915*000.030L60.036610.0208M140.085430.0625

注：乳房炎陰性與陽性小尾寒羊DRB1相同等位基因間，**表示差異極顯著P<0.01。

圖5　MHC-DRB1基因第2外顯子核苷酸序列的NJ樹Fig.5　Neighbor-joining trees of gene MHC-DRB1 nucleotide sequences

3　討論

根據(jù)調查，甘肅省規(guī)模化羊場母羊患臨床型乳房炎的比例平均為10%～15%，隱性乳房炎發(fā)病比例更高，給養(yǎng)羊業(yè)帶來了嚴重的經(jīng)濟損失。雖然通過藥物治療等措施，可在一定程度上控制綿羊乳房炎，但不能從根本上完全消除。從遺傳本質上提高綿羊抗乳房炎的能力，從分子遺傳水平上實施抗病育種，從而篩選出動物抗病品系和培育出抗病動物是控制和減少疾病發(fā)生的有效途徑之一，而經(jīng)歷大自然殘酷的生物進化準則選拔出來的抗性品類，具有高度的安全性。

MHC基因是脊椎動物多態(tài)性最高的基因之一，其遺傳基礎是等位基因的點突變，即核苷酸發(fā)生替換[11]。大量綿羊MHC-DRB1基因第2外顯子的研究也證明了該基因具有高度多態(tài)性[12]。Jugo等[13]對 Latxa和Karrantar羊的MHC-DRB1第2外顯子多態(tài)性的研究，發(fā)現(xiàn)了12個等位基因；Ballingall等[14]在400只Valachian 綿羊的DRB1第2外顯子中發(fā)現(xiàn)了25個等位基因；Arrieta等[15]采用PCR-SSCP方法分析Laxta 綿羊的MHC-DRB1第2外顯子遺傳多態(tài)性，檢測到了19個等位基因；王佳泰等[16]在對河西絨山羊的MHC-DRB1第2外顯子基因研究中，發(fā)現(xiàn)了26個等位基因、71個核苷酸多態(tài)位點。Mona等[17]、Rao等[18]認為環(huán)境特別是病原的壓力是導致動物MHC具有高度多態(tài)性的主要因素。本研究首次采用PCR-SSCP方法，發(fā)現(xiàn)甘肅細毛羊和小尾寒羊兩個群體的MHC-DRB1基因外顯子2具有豐富的遺傳多態(tài)性，共檢測到13個等位基因和59個核苷酸變異位點，PIC含量均大于0.5，表現(xiàn)高度多態(tài)。這可能與甘肅地區(qū)以及所采集的兩個綿羊群體所處的嚴酷環(huán)境有關，從而形成了其適應性強、抗病能力強的特性。

大量研究證明，MHC基因與家畜的多種疾病存在強相關，已成為抗病育種首選的基因標記[19-20]。有研究報道MHC的部分等位基因與奶牛的乳房炎存在密切相關[21]。高樹新等[22]采用PCR-SSCP技術，在檢測并分析了9種中國荷斯坦牛 BoLA-DQA基因第2外顯子基因的基因型、15種BoLA-DRB3基因第2外顯子基因的基因型和3種單體型后發(fā)現(xiàn)，DQA-B/DRB3-C，DQA-G/DRB3-F兩種單體型可能與奶牛乳房炎易感性有關。張夫千等[23]對荷斯坦牛的DRB3基因外顯子2研究發(fā)現(xiàn)，其與乳房炎有相關性。本研究結果表明，不同等位基因個體間對乳房炎的抗性和易感性存在差異。在相同的飼養(yǎng)管理以及防疫條件下，等位基因D在甘肅細毛羊乳房炎陽性個體中出現(xiàn)較少(0.01

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(責任編輯張韻)

Analysis of polymorphism of MHC-DRB1 gene and the correlation to mastitis of sheep in Gansu

ZHANG Xiao-li1，SONG Xiao-yu1，MA Xiao-jun1，2，*， CHEN Fu-qiang1， ZHANG Chen1， ZHANG Xin1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，GansuAgriculturalUniversity，Lanzhou730070，China; 2.GansuKeyLaboratoryofHerbivorpousAnimalBiotechnology，Lanzhou730070，China)

To investigate the polymorphism of ovine major histocompatibility complex ⅡDRB1 (MHC-DRB1)and the genetic susceptibility to mastitis， the polymorphism ofDRB1 gene exon 2 in 200 Gansu alpine fine-wool sheep and 212 Small Tail Han sheep (43 and 48 sheep in those groups were diagnosed as mastitis) was analyzed by PCR-SSCP techniques. The correlation of the alleles and mastitis were analyzed. It was found that theDRB1 gene exon 2 had 13 alleles， MHC-DRB1 showed high polymorphism (PIC>0.5) and was significantly deviant from Hardy-Weinberg equilibrium (P<0.01). Allele frequencies between healthy sheep and infected sheep with mastitis and the relative risk (RR) value confirmed that， allele D (0.01

Gansu alpine fine-wool sheep; Small Tail Han sheep; MHC-DRB1 gene exon 2; PCR-SSCP; mastitis

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.02.07

2015-07-02

甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術研究與應用開發(fā)項目(GNSW-2011-22)；甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院教研產(chǎn)學創(chuàng)新基金(GYCX-KX010)

張小麗(1971—)，女，甘肅定西人，博士，副教授，研究方向為動物微生物免疫與抗病。E-mail：zhxl228 @qq.com

，馬小軍，E-mail: maxj@gsau.edu.cn

S858.26

A

1004-1524(2016)02-0221-07

張小麗，宋曉育，馬小軍，等. 甘肅地區(qū)綿羊MHC-DRB1基因第2外顯子多態(tài)性與乳房炎的相關性分析[J].浙江農(nóng)業(yè)學報，2016，28(2)： 221-227.