姜　蒙，王　偉

(華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237)

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重金屬Cr6+耐受細(xì)菌的篩選研究

姜蒙，王偉*

(華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237)

土壤中重金屬Cr6+污染日益嚴(yán)重，其對(duì)植物的影響也越來越大，并可通過食物鏈富集進(jìn)入人和動(dòng)物體內(nèi)，從而危害人畜健康。試驗(yàn)在分別添加0.3和0.5 g·kg-1Cr6+的土樣中進(jìn)行耐性菌株的篩選，以期為微生物修復(fù)重金屬污染提供技術(shù)支持。結(jié)果表明，該研究共獲得了9株具有較好Cr6+耐性的菌株。它們均可在含0.5，1.0 mmol·L-1Cr6+的LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。其中，編號(hào)為J3，J5，J8的菌種耐性達(dá)到2 mmol·L-1，在含2 mmol·L-1Cr6+的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后，培養(yǎng)基中的Cr6+含量分別降低23%，36%，7%。經(jīng)測(cè)定，上述3種菌分別為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、沙福芽孢桿菌(Bacillussonorensis)。

重金屬Cr6+；重金屬耐性；土壤修復(fù)

重金屬鉻主要通過工業(yè)生產(chǎn)被釋放到環(huán)境中，比如皮革鞣制、電鍍和鉻酸鹽生產(chǎn)等[1]。鉻進(jìn)入作物體內(nèi)主要積累在根部細(xì)胞，并使細(xì)胞膜的通透性增大。鉻滲入細(xì)胞后可與細(xì)胞核內(nèi)的核酸等大分子物質(zhì)結(jié)合，抑制包括ATP酶在內(nèi)的多種酶的活性，影響細(xì)胞正常的有絲分裂，并使DNA發(fā)生凝集，導(dǎo)致染色體發(fā)生斷裂和畸變。此外，鉻還可通過食物鏈富集進(jìn)入人和動(dòng)物體內(nèi)，引發(fā)癌癥等疾病，危害人畜健康，如水俁病、骨痛病等都是典型例證。因此，其在食品、水、土壤里的含量應(yīng)受到嚴(yán)格的控制[2]。

目前，我國(guó)部分地區(qū)土壤遭受鉻污染，嚴(yán)重危及糧食生產(chǎn)與人畜安全。傳統(tǒng)的對(duì)重金屬污染進(jìn)行治理的方法主要是物理化學(xué)方法，但是該方法花費(fèi)高，需要消耗大量的資源和專業(yè)設(shè)備，而且可能引發(fā)二次污染[3]。因此，迫切需要針對(duì)鉻污染土壤探索、建立適宜的治理方法。近年來，微生物修復(fù)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。該方法主要利用環(huán)境中的微生物對(duì)土壤進(jìn)行修復(fù)，對(duì)環(huán)境的擾動(dòng)較小，且成本遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)的物理化學(xué)方法。本文主要針對(duì)土壤中以重鉻酸鹽形式存在的六價(jià)重金屬鉻(Cr6+)，篩選耐性細(xì)菌，探討其對(duì)重金屬鉻的耐受性和修復(fù)能力，以期為土壤中Cr6+的生物修復(fù)提供技術(shù)支撐。

1　材料與方法

1.1土壤樣品

于2012年6月取自無重金屬污染的菜田，土壤為典型的灰潮土，pH 7.62。土壤總有機(jī)碳平均含量為(10.38±0.97) g·kg-1。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1土壤樣品的處理

取回的土壤去除雜質(zhì)并自然風(fēng)干后過2 mm篩備用。在每個(gè)盆里放置1 000 g土壤樣品，以重鉻酸鈉的形式向土壤中添加Cr6+，分別調(diào)節(jié)其離子濃度至0.3和0.5 g·kg-1，每個(gè)處理重復(fù)3次。第60天取土壤樣品進(jìn)行耐鉻細(xì)菌的篩選。

1.2.2耐性菌株的篩選及鑒定

菌種篩選采用稀釋平板涂布法，挑選單菌落保存菌種。對(duì)所挑選出的單菌落進(jìn)行菌種形態(tài)鑒定，對(duì)初步篩選的菌株進(jìn)行歸類合并；之后，進(jìn)一步對(duì)菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定和生理生化鑒定。

1.2.3耐性菌株總DNA提取

采用Wilson方法[4]分別提取篩選到的耐性細(xì)菌總DNA。

1.2.4耐性菌株16S rDNA擴(kuò)增

對(duì)提取到的細(xì)菌總DNA進(jìn)行16S rDNA基因PCR擴(kuò)增，選用通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)[5]。擴(kuò)增反應(yīng)體系如下：總反應(yīng)體積50 μL，包括10×loading buffer (Mg2+plus) 5 μL，引物(10 μmol·L-1)各2 μL，dNTP mixture(2.5 mmol·L-1each)4 μL，模板1 μL，5 U·μL-1的TaKaRa rTaq酶0.25 μL，用超純水補(bǔ)足體積至50 μL。細(xì)菌16S rDNA基因的擴(kuò)增條件參照Don等[6]。擴(kuò)增產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠電泳中檢測(cè)。

1.2.516S rDNA回收測(cè)序

對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，在切膠儀中對(duì)目的條帶進(jìn)行切膠回收，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對(duì)回收條帶進(jìn)行純化再回收。并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)純度和亮度。純化后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果與NCBI基因庫(kù)中所有已測(cè)定的原核生物16S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)[7]。用MEGA 5.1軟件對(duì)所測(cè)序列和同源序列進(jìn)行分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.6菌株Cr6+耐受性測(cè)定

為檢測(cè)所篩選菌株對(duì)重金屬Cr6+的耐受程度，將菌株在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，調(diào)節(jié)pH為7.5。培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后，重金屬鉻以Na2Cr2O7形式經(jīng)過濾器消毒滅菌添加，Cr6+終濃度分別設(shè)置為0.5，1，2，3 mmol·L-1。

將含Cr6+培養(yǎng)基上形成的菌落與對(duì)照相比，定性篩選出耐受性較強(qiáng)的菌株。

1.2.7耐受菌種Cr6+降解能力測(cè)定

將上述分離得到的具有較好耐受性的菌株培養(yǎng)在Cr6+濃度分別為1和2 mmol·L-1的液體培養(yǎng)基中，25 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)48 h，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，即將耐受菌株培養(yǎng)在未添加Cr6+的液體培養(yǎng)基中。Cr6+含量采用全譜直讀等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-AES)測(cè)定[8]。

2　結(jié)果與分析

2.1菌株Cr6+耐性及降解力

結(jié)果顯示，本試驗(yàn)從土壤中分離得到的9種菌株在含有0.5和1 mmol·L-1Cr6+的培養(yǎng)基上均有菌落形成，但J1，J2，J4，J6，J7，J9在含1 mmol·L-1Cr6+的培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)已明顯變?nèi)?，只有J3，J5，J8菌株能在含2 mmol·L-1Cr6+的培養(yǎng)基上形成菌落，認(rèn)定這3個(gè)菌株具有較強(qiáng)的Cr6+耐性。

將J3，J5，J8菌株進(jìn)一步轉(zhuǎn)移至含1 mmol·L-1Cr6+的液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，48 h后，J3，J5，J8菌株所在培養(yǎng)基中的Cr6+含量分別降低62%，67%，37%。當(dāng)液體培養(yǎng)中的Cr6+濃度進(jìn)一步增大到2 mmol·L-1時(shí)，J3，J5，J8菌株對(duì)Cr6+的降解能力減弱，培養(yǎng)基中的Cr6+含量分別降低23%，36%，7%。

2.2Cr6+耐受菌株生理生化特性鑒定

根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，本研究所分離得到的耐受細(xì)菌(J3，J5，J8)在LB培養(yǎng)基中菌落形態(tài)明顯不同，不是同一細(xì)菌。經(jīng)革蘭氏染色、鏡檢，均為革蘭氏陽(yáng)性菌，桿狀；細(xì)菌培養(yǎng)3 d可產(chǎn)生芽孢，初步認(rèn)定為芽孢桿菌屬。為進(jìn)一步確定J3，J5，J8的種，根據(jù)伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)(第8版)所述方法開展糖發(fā)酵、V.P試驗(yàn)、耐熱性等生理生化試驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。

表1菌株生理生化試驗(yàn)結(jié)果

Table 1Physiological and biochemical tests of isolated strains

指標(biāo)J3J5J8接觸酶+++厭氧生長(zhǎng)+-+最高生長(zhǎng)溫度/℃～50～55～475%NaCl+++7%NaCl++-V.P試驗(yàn)+++淀粉水解+++明膠水解+++甲基紅試驗(yàn)+++檸檬酸利用試驗(yàn)---水解酪素+++葡萄糖發(fā)酵+++乳糖發(fā)酵---蔗糖發(fā)酵+++pH5.7生長(zhǎng)-+-馬尿酸鹽水解--+

注：“+”表示陽(yáng)性，“-”表示陰性。

2.3Cr6+耐受菌的分子鑒定結(jié)果

將提取的各菌株DNA克隆、測(cè)序，結(jié)果如表2所示。

為進(jìn)一步明確J3，J5，J8的種屬關(guān)系，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹研究其親緣關(guān)系及進(jìn)化水平，結(jié)果如圖2所示。

結(jié)合形態(tài)特征、培養(yǎng)基特征、生理生化特征和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果以及系統(tǒng)發(fā)育樹，J3與Bacillusamyloliquefacienssubsp.plantarumFZB42(T)在系統(tǒng)發(fā)育樹上處于同一分支，親緣關(guān)系最近，相似度達(dá)到98.257%；J5與BacilluslicheniformisATCC14580(T)相似度達(dá)到98.624%，系統(tǒng)發(fā)育樹也顯示親緣關(guān)系最近；J8與BacillussonorensisNRRLB-23154(T)處于系統(tǒng)發(fā)育樹上同一分支，但節(jié)點(diǎn)值較低，而且相似度僅為95.494%。據(jù)此，初步確定J3為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)，J5為地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)，J8為沙福芽孢桿菌(Bacillussonorensis)。

3　討論

Cr6+的毒害作用主要是由于它能引起細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，破壞細(xì)胞膜并損害DNA[9]。鉻鹽有鉻酸鹽和重鉻酸鹽兩種形式，在過去二十年中，幾乎大部分細(xì)菌修復(fù)作用的研究都是針對(duì)鉻酸鹽的耐受性及修復(fù)能力，對(duì)重鉻酸鹽的研究極少[10]。因此，本研究主要針對(duì)重鉻酸鹽污染，篩選耐Cr6+細(xì)菌。

表2菌種測(cè)序結(jié)果

Table 2Sequencing results of tested strains

菌株細(xì)菌學(xué)名菌株獲取號(hào)相似度/%J1BacillusmethylotrophicusCBMB205(T)EU19489798.969Bacillussubtilissubsp.inaquosorumBGSC3A28(T)EU13846798.777BacillussiamensisPD-A10(T)GQ28129998.638J2BacilluslicheniformisATCC14580(T)AE01733398.182Bacillusaerius24K(T)AJ83184398.092BacillussonorensisNRRLB-23154(T)AF30211897.835J3Bacillussubtilissubsp.inaquosorumBGSC3A28(T)EU13846798.825Bacillusamyloliquefacienssubsp.plantarumFZB42(T)CP00056098.257Bacillussubtilissubsp.subtilisNCIB3610(T)FN59764497.672J4BacillussafensisFO-036b(T)AF23485499.291Bacillusstratosphericus41KF2a(T)AJ83184199.134Bacillusaltitudinis41KF2b(T)AJ83184299.134J5BacilluslicheniformisATCC14580(T)AE01733398.624BacillusmethylotrophicusCBMB205(T)EU19489797.222J6BacillusmethylotrophicusCBMB205(T)EU19489799.481Bacillussubtilissubsp.inaquosorumBGSC3A28(T)EU13846799.054J7Bacillustequilensis10b(T)HQ22310798.036BacillusatrophaeusJCM9070(T)AB02118197.950BacillusmojavensisIFO15718(T)AB02119197.950J8BacillussonorensisNRRLB-23154(T)AF30211895.494Bacillussubtilissubsp.inaquosorumBGSC3A28(T)EU13846795.485J9BacillusmethylotrophicusCBMB205(T)EU19489799.120Bacillusamyloliquefacienssubsp.amyloliquefaciensDSM7(T)FN59764498.261BacillusvallismortisDSM11031(T)AB02119898.174

圖2　J3，J5，J8菌株的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2　Neighbor-joining phylogenetic tree showing the relationships for 16S rDNA gene sequences of J3， J5， J8 and their closest relatives

針對(duì)重金屬污染治理，目前普遍使用的還是傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)防治和工程物理化學(xué)方法。如林匡飛等[11]在含鎘100 mg·kg-1的土壤上改種苧麻，5年后，土壤鎘含量平均降低27.6%；Wasay等[12]采用淋洗法，對(duì)比弱有機(jī)酸鹽(檸檬酸和酒石酸鹽)和強(qiáng)螯合劑(EDTA和DTPA)對(duì)重金屬Cr，Mn，Hg，Pb污染土壤修復(fù)的有效性，發(fā)現(xiàn)EDTA和DTPA能有效地去除Hg以外的重金屬元素，但同時(shí)也提取出大量的土壤營(yíng)養(yǎng)元素；而且，EDTA和DTPA被吸附于土壤顆粒表面，易對(duì)土壤造成新的污染。這些方法同時(shí)也大都存在花費(fèi)高、需要消耗大量的資源和專業(yè)設(shè)備，而且可能引發(fā)次生污染等問題。微生物修復(fù)的優(yōu)點(diǎn)是實(shí)施較簡(jiǎn)便，投資較少，更重要的是對(duì)環(huán)境破壞小。所以，近年來微生物修復(fù)重金屬污染的研究越來越受到科研人員的關(guān)注。要采用微生物方法治理重金屬污染，獲得高效的菌種資源是成功的關(guān)鍵。目前在細(xì)菌、真菌、藻類微生物中均有重金屬耐性菌株報(bào)道。如Wang等[13]對(duì)國(guó)內(nèi)外重金屬修復(fù)相關(guān)的微生物，包括細(xì)菌、真菌和藻類，進(jìn)行了比較全面的綜述，并列出各自的修復(fù)能力，從其研究中也可以看出，對(duì)Cr6+具有較好修復(fù)能力的微生物較少。Ziagova等[14]從礦區(qū)篩選出對(duì)Cd2+和Cr6+有較好修復(fù)能力的Pseudomonassp.和S.xylosus兩株細(xì)菌，經(jīng)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，它們對(duì)Cr6+的生物吸附能力分別達(dá)到95.0和143 mg·g-1。目前，已知的能夠修復(fù)Cr6+的真菌種類更少，其能力相對(duì)細(xì)菌來說也較弱，主要包括：釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、青霉菌屬(Penicilliumsp.)和曲霉菌屬(Aspergillussp.)。如Ozer等[15]研究發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)在25 ℃時(shí)對(duì)Cr6+吸附達(dá)到最大值，但也僅為32.6 mg·g-1。Say等[16]在研究產(chǎn)紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)對(duì)水溶液中Cr6+生物吸附時(shí)，發(fā)現(xiàn)pH對(duì)其影響較大，大約在pH 6.0時(shí)，生物吸附量最大，達(dá)36.5 mg·g-1。目前，報(bào)道的對(duì)重金屬Cr有修復(fù)能力的藻類只有小球藻(Chlorellavulgaris)[17-18]、馬尾藻類海草(Sargassumsp.)[19-20]和斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)[18]。

本研究中篩選到3株對(duì)Cr6+具有較強(qiáng)耐性的菌株(J3，J5，J8)，均可耐受2 mmol·L-1的Cr6+；并具有較好的修復(fù)能力，在含2 mmol·L-1Cr6+的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，Cr6+含量分別降低了23%，36%和7%，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。經(jīng)鑒定，它們均屬于芽孢桿菌屬，J3為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)，J5為地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)，J8為沙福芽孢桿菌(Bacillussonorensis)。國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有關(guān)于地衣芽孢桿菌對(duì)Cr6+有修復(fù)能力的報(bào)道，如Zhou等[21]研究死亡的地衣芽孢桿菌細(xì)胞對(duì)Cr6+的生物吸附動(dòng)力學(xué)時(shí)，發(fā)現(xiàn)含鉻300 mg·L-1、pH 2.5、溫度為50 ℃的處理液，其生物吸附量最大，達(dá)60.5 mg·g-1。本研究篩選到的3株細(xì)菌其耐受Cr6+的原理及修復(fù)原理有待進(jìn)一步研究，對(duì)于其修復(fù)動(dòng)力學(xué)的研究也將進(jìn)行，以便在今后的修復(fù)應(yīng)用中發(fā)揮最大效用。

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(責(zé)任編輯高峻)

Screening of heavy metal Cr6+resistant strains

JIANG Meng， WANG Wei*

(StateKeyLaboratoryofBioreactorEngineering，EastChinaUniversityofScienceandTechnology，Shanghai200237，China)

Cr6+is a hazardous heavy metal element to plant growth， and can endanger human and animal health through food chain enrichment. In the present study， Cr6+resistant strains were screened from soils added with 0.3， 0.5 g·kg-1Cr6+， in order to provide technical support for microbial remediation of heavy metal pollution. It was shown that 9 Cr6+resistant strains were screened， all of which could grow normally in media with 0.5， 1.0 mmol·L-1Cr6+. Among them， strains named as J3， J5 and J8 were able to grow in media with 2 mmol·L-1Cr6+. Besides， after 48 h cultivation in media with 2 mmol·L-1Cr6+， Cr6+content in media with J3， J5， J8 was reduced by 23%，36%， 7%， respectively. Sequencing analysis showed that J3， J5， J8 wereBacillusamyloliquefaciens，Bacilluslicheniformis，Bacillussonorensis， respectively.

heavy metal Cr6+; heavy metal resistance; soil remediation

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.02.24

2015-10-16

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)課題(2012AA101401)

姜蒙(1988—)，男，山東濟(jì)寧人，碩士，主要從事微生物學(xué)研究工作。E-mail: jiang-meng-1988@163.com

，王偉，E-mail: weiwang@ecust.edu.cn

S154.39

A

1004-1524(2016)02-0324-06

姜蒙，王偉. 重金屬Cr6+耐受細(xì)菌的篩選研究[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，28(2)： 324-329.