黃笑梅，金建峰，張　雪，朱思眉，朱柯柯，趙羅鵬，蔣　明，*

(1.臺(tái)州學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 椒江 318000；2.浙江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 浙江 杭州 310058)

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青花菜CC-NBS-LRR抗病基因BoCNL1的克隆與分析

黃笑梅1，金建峰2，張雪1，朱思眉1，朱柯柯1，趙羅鵬1，蔣明1，*

(1.臺(tái)州學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 椒江 318000；2.浙江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 浙江 杭州 310058)

根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)PCR引物，從青花菜中克隆1個(gè)NBS-LRR(核苷酸結(jié)合位點(diǎn)-富含亮氨酸重復(fù))抗病基因BoCNL1；在生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上，利用RT-PCR研究該基因在不同器官中的表達(dá)模式。測序結(jié)果表明，BoCNL1基因的編碼區(qū)全長為2 550 bp，編碼849個(gè)氨基酸；編碼蛋白具CC(卷曲螺旋)、NBS和LRR結(jié)構(gòu)域；進(jìn)化分析結(jié)果表明，BoCNL1與不結(jié)球白菜的關(guān)系最近，在進(jìn)化樹上處于同一分支，與醉蝶花的關(guān)系最遠(yuǎn)；RT-PCR結(jié)果表明，BoCNL1在根、花莖、葉、花蕾、開放的花和嫩角果中均有表達(dá)，但表達(dá)量低。

青花菜；抗病基因；CC-NBS-LRR；基因克隆

植物在生長過程中通常會(huì)遭受真菌、細(xì)菌、線蟲、昆蟲和病毒等的侵襲，通過漫長的進(jìn)化，植物已形成復(fù)雜的防衛(wèi)機(jī)制以抵御各種生物脅迫[1]。病害是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)蒙受重大損失的主要生物脅迫之一，植物抗病能力取決于病原物無毒基因和寄主抗病基因產(chǎn)物的識(shí)別，以及隨后相關(guān)防衛(wèi)途徑的激活，這一過程通常由抗病基因(resistance gene， R基因)控制[2]。R基因在植物中以基因家族的形式存在，根據(jù)編碼蛋白的特征，可分為NBS-LRR(nucleotide-binding site plus leucine-rich repeat， 核苷酸結(jié)合位點(diǎn)-富含亮氨酸重復(fù))、eLRR-TM(extracellular leucine-rich repeat plus transmembrane receptor， 胞外富含亮氨酸重復(fù)跨膜受體)、eLRR-TM-pkinase(extracellular leucine-rich repeat transmembrane protein kinase， 胞外富亮氨酸重復(fù)跨膜蛋白激酶)和STK(serine-threorine kinase， 絲氨酸-蘇氨酸激酶)等類型[3]。

NBS-LRR在R基因中所占的比例最大，編碼蛋白的NBS結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)ATP的水解及信號(hào)的釋放，LRR則充當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)相互作用的平臺(tái)和蛋白活化的元件[4]。NBS-LRR參與多種病原菌的防御，在抗病信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和防衛(wèi)反應(yīng)激活過程中起著重要作用[5]。目前已從擬南芥(Arabidopsisthaliana)、甘蔗(Saccharumofficinarum)、森林草莓(Fragariavesca)、亞麻(Linumusitatissimum)、水稻(Oryzasativa)、蘋果(Malus×domestica)和番茄(Solanumlycopersicum)等植物中克隆或鑒定到大量NBS-LRR基因[6-12]。將八棱海棠(Malus×robusta)的CC-NBS-LRR基因?qū)胩O果，后者抗火疫病的能力顯著增加[13]；水稻Pi64基因編碼一個(gè)新的CC-NBS-LRR蛋白，該基因與水稻葉瘟和穗瘟病抗性相關(guān)[14]。青花菜(Brassicaoleraceavar.italica)是一種深受人們喜愛的保健蔬菜，在生產(chǎn)過程中，受多種病菌的危害，造成產(chǎn)量和品質(zhì)下降，開展抗病分子育種有著重要的意義，而有關(guān)NBS-LRR基因的克隆未見報(bào)道。本研究從青花菜中克隆一個(gè)NBS-LRR基因的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了序列比對(duì)和表達(dá)分析，為該基因的功能鑒定和分子育種利用奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

青花菜材料Bo0112由實(shí)驗(yàn)室栽植，該材料生育期為75 d左右，花球緊實(shí)，花蕾深綠色，具較強(qiáng)的霜霉病和灰霉病抗性。于花期采集根、葉、花莖、花蕾、開放的花和嫩角果，置于-80 ℃冰箱備用。從NCBI下載7條十字花科植物的同源序列用于比對(duì)，它們分別來自不結(jié)球白菜(B.rapa)(登錄號(hào): XP_009147850.1)、大白菜(B.rapasubsp.pekinensis)(ACP30592.1)、甘藍(lán)型油菜(B.napus)(CDY22783.1)、高山南芥(Arabisalpina)(KFK34203.1)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)(AED95001.1)、亞麻薺(Camelinasativa)(XP_010456005.1)和醉蝶花(Tarenayahassleriana)(XP_010554983.1)

1.2RNA的提取和cDNA合成

RNA提取用TRIzol法；cDNA的合成采用TaKaRa公司的試劑盒，第一鏈和第二鏈的合成根據(jù)其提供的說明書進(jìn)行。

1.3BoCNL1基因的克隆

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的大白菜(登錄號(hào)：FJ842840.1)和不結(jié)球白菜(B.rapa)(XM_009149572.1)的NBS-LRR基因序列設(shè)計(jì)PCR引物，分別為CNL1：5′-ATGGGAGGCTGTGTATCACTAGA-3′和CNL2：5′-TTACTCCTGTTCGTGTCTCTGAAAC-3′。反應(yīng)體系中含1×phusion HF緩沖液，phusion DNA聚合酶0.5 μL(NEB， USA)，0.25 μmol·L-1的dNTPs(生工生物工程(上海)股份有限公司)，各0.25 μmol·L-1上、下游引物，60 ng葉片cDNA模板，最后加無菌ddH2O至50 μL。PCR程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性30 s；98 ℃變性10 s，57.5 ℃退火20 s，72 ℃延伸35 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，割取含目的條帶的膠塊，利用碧云天生物技術(shù)研究所的DNA凝膠回收試劑盒回收純化，操作根據(jù)其提供的說明書進(jìn)行。采用生工生物工程(上海)股份有限公司的平端DNA片段添dA試劑盒，根據(jù)其提供的操作手冊(cè)進(jìn)行回收產(chǎn)物的平末端加A反應(yīng)。取3 μL加A產(chǎn)物與pGEM-T easy載體(Promega， USA)連接，于42 ℃通過熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，取4個(gè)陽性克隆用于測序。

1.4生物信息學(xué)分析

等電點(diǎn)和分子量利用在線工具h(yuǎn)ttp://web.expasy.org/compute_pi預(yù)測；序列比對(duì)用ClustalX 1.83軟件；MEGA 3.1用于系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，建樹方法為鄰接法(neighbor joining method)，自舉檢測次數(shù)為1 000。

1.5表達(dá)分析

根據(jù)測序結(jié)果，設(shè)計(jì)RT-PCR引物，分別為CNL3：5′-AGTTCGTGCGCATCTATTGATG-3′和CNL4：5′-TCGATAATCCAAAGGTGTTGAACACA-3′，預(yù)期PCR產(chǎn)物大小約為700 bp。反應(yīng)體系中含1×PCR buffer，0.5 U的TaqDNA聚合酶(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，0.3 μmol·L-1的dNTPs(生工生物工程(上海)股份有限公司)，各0.2 μmol·L-1的CNL4和CNL5引物，60 ng根、葉、花莖、花蕾、開放的花或嫩角果cDNA，最后加無菌ddH2O至20 μL。PCR程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56.5 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，35個(gè)循環(huán)；最后于72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳、拍照，RT-PCR實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以肌動(dòng)蛋白基因(登錄號(hào): AF044573.1)為內(nèi)標(biāo)，引物分別為5′-TCTCGATGGAAGAGCTGGTT-3′和5′-GATCCTTACCG-AGGGAGGTT-3′，PCR程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55.6 ℃退火45s，72 ℃延伸90 s，共33個(gè)循環(huán)。

2　結(jié)果與分析

2.1BoCNL1基因及其編碼蛋白的特征

以CNL1/CNL2為引物對(duì)，從青花菜葉片cDNA中擴(kuò)增到目的條帶。測序結(jié)果表明，BoCNL1基因的編碼區(qū)全長為2 550 bp，分別以ATG與TAA為起始和終止密碼子，GC值為39.73%。BoCNL1編碼849個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)為7.20，分子量大小為96.5 kD。序列分析結(jié)果表明，BoCNL1在+26～+63位具一個(gè)CC(coiled coil， 螺旋卷曲)結(jié)構(gòu)域；在+158～+438處具一個(gè)NBS結(jié)構(gòu)域，另有一個(gè)LRR結(jié)構(gòu)域位于+534～+594處(圖1)。

2.2BoCNL1的進(jìn)化分析

為明確BoCNL1的進(jìn)化地位，從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載了7條十字花科植物的同源序列，并利用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。結(jié)果表明，8個(gè)CNL序列之間的遺傳距離為0.199～0.731，甘藍(lán)型油菜與醉蝶花的遺傳距離最大，擬南芥和醉蝶花次之，為0.720，青花菜與不結(jié)球白菜之間遺傳距離最小。它們?cè)谙到y(tǒng)發(fā)育樹上可分為3組，同為蕓薹屬的青花菜、大白菜、不結(jié)球白菜和甘藍(lán)型油菜聚為一組(Ⅰ)；擬南芥、高山南芥和亞麻薺聚為一組(Ⅱ)；而醉蝶花單獨(dú)處于一個(gè)分支(Ⅲ)。

2.3BoCNL1基因的表達(dá)分析

為研究BoCNL1在不同器官中的表達(dá)模式，分別以等量的根、葉、花莖、花蕾、開放的花或嫩角果cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。RT-PCR結(jié)果表明，BoCNL1在各個(gè)部位均有表達(dá)，但表達(dá)量均處于較低的水平(圖3)。

3　討論

植物抗病基因以超家族的形式存在，大約有數(shù)百甚至數(shù)千個(gè)分布于基因組中，其中以NBS-LRR類型的R基因最為豐富，它們以基因簇的形式分布在染色體上[15]。在擬南芥(哥倫比亞生態(tài)型)中有207個(gè)R基因，其中149個(gè)為NBS-LRR基因[6]；從亞麻基因組鑒定得到147個(gè)NBS-LRR，其中CC-NBS-LRR類型49個(gè)，TIR-NBS-LRR類型98個(gè)[9]；番茄有252個(gè)NBS-LRR，分布于12條染色體上[12]；蘋果和大豆(Glycinemax)中的NBS-LRR基因數(shù)量十分龐大，分別有505和319個(gè)[16-17]。最近，Zhang等[18]分別從琴葉擬南芥(A.lyrata)、不結(jié)球白菜(B.rapa)、薺菜(Capsellarubella)和鹽芥(Thellungiellasalsuginea)基因組中鑒定出198，204，127和88個(gè)NBS-LRR基因。本研究從青花菜中克隆到一個(gè)NBS-LRR基因，該基因的編碼區(qū)全長為2 550 bp，編碼849個(gè)氨基酸。

根據(jù)編碼蛋白N端的結(jié)構(gòu)特征，NBS-LRR可分為TIR-NBS-LRR(TNL)和CC-NBS-LRR(CNL)兩種類型，TIR為果蠅Toll及哺乳動(dòng)物白細(xì)胞介素1受體(DrosophilaToll and mammalian interleukin-1 receptors)的縮寫，CC則為卷曲螺旋(coiled coil)的簡稱[19]。TNL和CNL蛋白在序列和信號(hào)傳導(dǎo)途徑上存在顯著差異，但它們均參與病原菌的識(shí)別，在監(jiān)控效應(yīng)子(effector)誘導(dǎo)蛋白狀態(tài)方面起著重要作用[20-21]。本研究中，BoCNL1的N端具一個(gè)CC結(jié)構(gòu)域，隨后為NBS和LRR結(jié)構(gòu)域，它是一個(gè)典型的CC-NBS-LRR蛋白。

下劃線部分為螺旋卷曲結(jié)構(gòu)域；陰影部分為NBS結(jié)構(gòu)域；方框部分為LRR結(jié)構(gòu)域。圖1　BoCNL1基因及其編碼蛋白序列Fig.1　Gene sequence of BoCNL1 and its deduced protein sequence

圖2　BoCNL1及其同源序列的系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.2　Phylogenetic tree of BoCNL1 and its homologous sequences

1～6: 根、花莖、葉、花蕾、開放花和嫩角果； Ⅰ: BoCNL1 在不同器官中的表達(dá); Ⅱ: 肌動(dòng)蛋白內(nèi)標(biāo)。圖3　BoCNL1基因的表達(dá)分析Fig.3　Expression analysis of BoCNL1

大部分NBS-LRR基因在未感染的健康植株中組成型表達(dá)，但表達(dá)量較低，僅少部分基因的表達(dá)具有組織特異性[21]。在特定病原菌的侵染下，NBS-LRR基因的表達(dá)上調(diào)，并誘導(dǎo)抗病相關(guān)基因的表達(dá)[22]。向日葵(Helianthusannuus)自交系QIR8 CC-NBS-LRR基因的表達(dá)受霜霉菌(Plasmoparahalstedii)誘導(dǎo)，并激發(fā)了一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)[23]。本研究中，BoCNL1在青花菜的根、花莖、葉、花蕾、開放花和嫩角果中均有表達(dá)，具有組成性表達(dá)的特點(diǎn)，但表達(dá)量較低。本課題組將對(duì)該基因開展進(jìn)一步研究，以明確BoCNL1在不同病原菌侵染下的表達(dá)模式，解析其在抗病反應(yīng)中的生物學(xué)功能。

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(責(zé)任編輯張韻)

Cloning and characterization of a CC-NBS-LRR disease resistance gene of BoCNL1 from Brassica oleracea var. italica

HUANG Xiao-mei1， JIN Jian-feng2， ZHANG Xue1， ZHU Si-mei1， ZHU Ke-ke1， ZHAO Luo-peng1， JIANG Ming1,*

(1.CollegeofLifeSciences，TaizhouUniversity，Jiaojiang318000，China; 2.CollegeofLifeSciences，ZhejiangUniversity，Hangzhou310058，China)

Primer pairs were designed according to known sequences， and a nucleotide-binding site plus leucine-rich repeat (NBS-LRR) disease resistance gene， designatedBoCNL1， was isolated from broccoli (Brassicaoleraceavar.italic). Bioinformatic analysis were performed， and RT-PCR was used to reveal expression patterns ofBoCNL1 in different organs. Results indicated that the complete coding sequence ofBoCNL1 was 2 550 bp in length， encoding 849 amino acids; and the deduced protein sequence contained coiled coil(CC)， NBS， and LRR domains. Phylogenetic analysis results showedBoCNL1 was grouped with the homologous gene inB.rapa， indicating their closest relationship， and the longest genetic distance was observed betweenB.oleraceavar.italicaandTarenayahassleriana. RT-PCR results demonstrated thatBoCNL1 expressed with low levels of transcripts in roots， flower stalks， leaves， flower buds， flowers， as well as young siliques.

Brassicaoleraceavar.italica; disease resistance gene; CC-NBS-LRR; gene cloning

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.02.13

2015-07-04

浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(LY13C150003)；浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動(dòng)計(jì)劃(新苗人才計(jì)劃)(2014R428011)；浙江省本科院校中青年學(xué)科帶頭人學(xué)術(shù)攀登項(xiàng)目(pd2013420)

黃笑梅(1993—)，女，浙江義烏人，本科生，從事植物分子生物學(xué)研究。E-mail: 369393248@qq.com

，蔣明，E-mail：jiangming@tzc.edu.cn

S635.3；Q78

A

1004-1524(2016)02-0259-05

黃笑梅，金建峰，張雪，等. 青花菜CC-NBS-LRR抗病基因BoCNL1的克隆與分析[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，28(2)： 259-263.