陳詠君，陳詠玫，張立群，吳麗霞，郭　晶

(1.沈陽醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院 檢驗(yàn)科，遼寧 沈陽110002；2.北京海淀婦幼保健院；3.沈陽醫(yī)學(xué)院)

?

亞胺培南耐藥銅綠假單胞菌產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶基因的流行病學(xué)研究

陳詠君1，陳詠玫2，張立群3，吳麗霞1，郭晶1

(1.沈陽醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院 檢驗(yàn)科，遼寧 沈陽110002；2.北京海淀婦幼保健院；3.沈陽醫(yī)學(xué)院)

目的明確我院臨床分離的銅綠假單胞菌耐亞胺培南基因型。方法收集臨床分離的銅綠假單胞菌 219株，篩選亞胺培南耐藥株；采用雙紙片協(xié)同試驗(yàn)對(duì)臨床分離的35株耐亞胺培南銅綠假單胞菌進(jìn)行金屬β-內(nèi)酰胺酶(MBL)表型檢測；用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測MBL基因型別，并對(duì)PCR擴(kuò)增陽性株進(jìn)行測序。結(jié)果219株銅綠假單胞菌中35株為耐亞胺培南銅綠假單胞菌，35株耐亞胺培南銅綠假單胞菌共檢出14株MBL表型陽性，占40% 。其中IMP-1型陽性7株、VIM-2型陽性2株。結(jié)論產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶是銅綠假單胞菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥的主要機(jī)制之一，臨床應(yīng)根據(jù)藥敏結(jié)果及產(chǎn)酶情況綜合考慮合理用藥，以減少耐藥菌株的產(chǎn)生。

銅綠假單胞菌；亞胺培南；金屬β-內(nèi)酰胺酶

(Chin J Lab Diagn,2016,20:1471)

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa,PA)是一種條件致病菌，廣泛分布于自然界，即使在健康人的皮膚，腸道及呼吸道仍可檢測到其存在。銅綠假單胞菌能夠引起人和動(dòng)物的感染，但是伴隨抗生素的應(yīng)用，銅綠假單胞菌的耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重。銅綠假單胞菌復(fù)雜的耐藥機(jī)制，給臨床治療帶來了極大的困難。亞胺培南是臨床上常用于治療銅綠假單胞菌引起重癥感染的藥物，隨著亞胺培南在臨床的廣泛應(yīng)用，銅綠假單胞菌對(duì)其耐藥率逐漸上升，已成為全球關(guān)注的重大問題[1]。目前關(guān)于銅綠假單胞菌對(duì)亞胺培南的耐藥機(jī)制主要包括如下可能機(jī)制：(1) 銅綠假單胞菌能夠產(chǎn)生金屬β-內(nèi)酰胺酶(MBL)和OXA型β-內(nèi)酰胺酶等碳青霉烯水解酶，發(fā)生耐藥；(2) 銅綠假單胞菌外膜孔蛋白OprD的表達(dá)缺失或表達(dá)下降；(3) 銅綠假單胞菌主動(dòng)外排系統(tǒng)表達(dá)增高。在這些主要的耐藥機(jī)制中，金屬β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生是銅綠假單胞菌對(duì)亞胺培南耐藥的重要機(jī)制之一。本研究回顧性對(duì)我院2012年-2013年間臨床分離非重復(fù)的亞胺培南耐藥的銅綠假單胞菌進(jìn)行了MBL的表型及基因型檢測，現(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1菌株來源

收集我院2012年1月-2013年12月臨床分離銅綠假單胞菌219株，從中篩查出耐亞胺培南銅綠假單胞菌35株，所有菌株均保存在-40℃冰箱，臨用前復(fù)蘇。其中送檢標(biāo)本包括：痰液、尿液等等。

1.2試劑及儀器

細(xì)菌基因組提取試劑盒(上海生工有限公司)；Taq酶及PCR相關(guān)試劑(上海生工有限公司)；ATB半自動(dòng)微生物分析儀及配套試劑(法國生物梅里埃公司)、PCR9700(ABI)、電泳儀(美國Bio-Rad公司)；紫外凝膠成像儀(美國AlphaInnotech)；乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)(沈陽化學(xué)試劑公司)；IPM(10mg/ml)藥敏紙片購自英國OXOID公司。

1.3質(zhì)控菌株

質(zhì)控菌株為銅綠假單胞菌ATCC27853，購自衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。

1.4鑒定與藥敏

細(xì)菌的培養(yǎng)和鑒定方法均嚴(yán)格按照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》(第3版)進(jìn)行，采用法國梅里埃半自動(dòng)ATB配套鑒定及藥敏板，按照2013年美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所(CLSI)[2]標(biāo)準(zhǔn)判斷藥敏結(jié)果。

1.5MBL耐藥表型檢測

雙紙片協(xié)同實(shí)驗(yàn)檢測金屬酶：參照文獻(xiàn)[3]報(bào)道的方法。

1.6引物設(shè)計(jì)與合成

引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)[4]，由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列見表1。

表1　IMP、VIM、SPM、GIM基因引物一覽表

1.7DNA擴(kuò)增

1.7.1DNA提取采用細(xì)菌基因組提取試劑盒，購于上海生工有限公司，按照操作說明提取基因組DNA。

1.7.2PCR擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件 擴(kuò)增反應(yīng)總體積為25μl，6×Buffer緩沖液5μl，Taq酶(5U/H1)0.25μl，dNTP3μl，引物各4μl，模板5μl，加滅菌去離子水至25μl。反應(yīng)條件為：94℃ 4min，94℃1s，55℃1s，72℃1.5s，72℃延伸10s。

1.7.3瓊脂糖凝膠電泳PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中電泳40min(140V)。紫外燈下觀察結(jié)果，凝膠成像系統(tǒng)成像。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，對(duì)上述檢測結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)或方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.12012年1月-2013年12月本院共分離銅綠假單胞菌219株，其中對(duì)亞胺培南耐藥或中介的共35株，占16%；其中EDTA法檢測金屬酶表型結(jié)果陽性14株，占40%。

2.235株耐亞胺培南PA共檢出7株IMP-1基因(見圖1)。

圖1部分IMP-1型金屬β-內(nèi)酰胺酶編碼基因電泳圖

M:為marker;S:為標(biāo)本

2.335株耐亞胺培南PA共檢出2株VIM-2基因(見圖2)。

圖2VIM-2型金屬β-內(nèi)酰胺酶編碼基因電泳圖

M:為marker;S:為標(biāo)本

3　討論

銅綠假單胞菌是假單胞菌屬中最具代表性的菌種。廣泛存在于自然界，即使正常人體的皮膚、腸道和呼吸道等部位也是銅綠假單胞菌的定植部位，這導(dǎo)致銅綠假單胞菌是常見的條件致病菌，亦是院內(nèi)感染的主要致病菌。近年來，隨著大量的廣譜抗生素在臨床的廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致銅綠假單胞菌對(duì)抗生素的耐藥率不斷升高，隨之而來的銅綠假單胞菌引起的感染成為臨床治療的一大難題。目前臨床用于治療銅綠假單胞菌的主要抗生素有三代頭孢菌素、β-內(nèi)酰胺類、含酶抑制劑、碳青霉烯類抗菌藥物如亞胺培南(Imipenem,IMP)來治療，其中亞胺培南應(yīng)用最為廣泛。碳青霉烯類抗菌藥物抗菌譜廣，無論是革蘭陽性菌還是革蘭陰性菌，而且對(duì)需氧菌、厭氧菌亦有很強(qiáng)的抗菌活性。但是，隨著亞胺培南在臨床的廣泛應(yīng)用，銅綠假單胞菌對(duì)亞胺培南的耐藥率也逐年上升。本實(shí)驗(yàn)中我院銅綠假單胞菌對(duì)亞胺培南的耐藥率為14.9%[5]，均低于張諱博、施曉群、陳越等[6-8]報(bào)道2010、2011、2012年中國CHINET銅綠假單胞菌耐藥性監(jiān)測的耐藥率，這一結(jié)果與我們選取的樣本數(shù)量或本院使用碳青霉烯類藥物的情況密切相關(guān)。

銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物產(chǎn)生耐藥的主要機(jī)制是金屬β-內(nèi)酰胺酶(MBL)的產(chǎn)生。本實(shí)驗(yàn)采用紙片EDTA實(shí)驗(yàn)分離MBL陽性的菌株，結(jié)果分離得到陽性表型菌株14株，占所收集耐亞胺培南PA的40%(14/35)，稍低于國內(nèi)其他地區(qū)[9]。這一結(jié)果提示引起本院感染的銅綠假單胞菌已經(jīng)有金屬酶的產(chǎn)生，但是相對(duì)于其他地區(qū)處于較低水平。銅綠假單胞菌一旦有金屬β-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生，就會(huì)對(duì)所有的β-內(nèi)酰胺類抗生素和碳青霉烯類抗生素產(chǎn)生耐藥，這一結(jié)果將導(dǎo)致臨床抗感染治療失敗。在本研究中，銅綠假單胞菌的分離率居首位的是干診三病房，其次為心外科病房[9]。

雖然國際上在銅綠假單胞菌中已經(jīng)檢測到VIM、IMP、SPM、GIM、NDM和SIM型MBL基因[10]，但國內(nèi)銅綠假單胞菌的檢測中以IMP、VIM和SPM型MBL基因?yàn)橹?，因此本?shí)驗(yàn)僅針對(duì)VIM、IMP、SPM、GIM型金屬β-內(nèi)酰胺酶基因進(jìn)行了研究。我們的研究結(jié)果提示：其中初篩陽性的14株菌株中，有7 株攜帶有IMP-1 基因，2 株攜帶有VIM-2 基因，其它菌株的擴(kuò)增結(jié)果為陰性。導(dǎo)致擴(kuò)增陰性的可能原因如下：(1) 使用EDTA法表型篩選時(shí)，EDTA自身的殺菌作用導(dǎo)致假陽性；(2)存在其他耐藥機(jī)制，例如OproD的缺失及MExXY-OprM外排泵的過度表達(dá)[11-15]，另外，產(chǎn)生過多Ampc酶，獲得性β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生，細(xì)胞內(nèi)酶的改變，細(xì)胞外膜主動(dòng)外排系統(tǒng)、靶位的突變，細(xì)菌生物被膜的形成等也都是PA耐藥的機(jī)制。

鑒于銅綠假單胞菌日益增加的耐藥產(chǎn)生[8]，尤其是以產(chǎn)MBL的銅綠假單胞菌耐藥，一直困擾廣大臨床醫(yī)生。并且這一耐藥的產(chǎn)生容易通過整合子進(jìn)行耐藥性傳播，因此臨床醫(yī)生有必要按有關(guān)規(guī)定，嚴(yán)格規(guī)范使用抗菌藥物，尤其是碳青霉烯類抗生素，以達(dá)到降低抗菌藥物選擇壓力，避免醫(yī)院產(chǎn)MBL銅綠假單胞菌感染的產(chǎn)生。同時(shí)有研究證明，過度使用消毒劑也是銅綠假單胞菌耐藥產(chǎn)生的機(jī)制之一[16，17]。因此，規(guī)范合理的消毒程序，同樣是我們工作中需要進(jìn)一步提高的地方。另外，隨意將耐藥PA的污水及垃圾的排放，也是PA耐藥發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)之一[18]。所以醫(yī)院應(yīng)加強(qiáng)對(duì)醫(yī)療垃圾及污水的消毒措施，以減少耐藥菌的增加。

綜上所述，MBL相關(guān)基因的存在與銅綠假單胞菌對(duì)亞胺培南的耐藥性有關(guān)。為了降低這一風(fēng)險(xiǎn)的發(fā)生，我們除了應(yīng)該規(guī)范使用抗生素外，在消毒劑的使用方面也應(yīng)該注意，以其達(dá)到降低銅綠假單胞菌的耐藥。

[1]Kucisec-TepesN.Pseudomonasaeruginosa-asignificanthospitalpathogenandresistancetocarbapenem[J].ActaMedCroatica,2004,58(4):313.

[2]ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute.PerformancastandardsforantimicrobialsusceptibiIitytesting:seventeenthinformational[S].CLSIdocumentM100-S19,2009,3:44-45.

[3]LeeK,ChongY.ShinHB,etal.ModifiedHodgeandEDTA-disksynergyteststoscreenmetallo-beta-lactamaseproducingstrainsofPseudomonasandAcinetobacterspecies[J].ClinMicrobiolInfect，2001,7(2):88.

[4]陳瑞,唐英春,朱家馨,等.耐亞胺培南銅綠假單胞菌的耐藥性和金屬酶研究[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志,2006,18(3):209.

[5]蘇維奇,朱元祺,孔繁榮，等．青島地區(qū)耐亞胺培南銅綠假單胞菌金屬β-內(nèi)酰胺酶檢測及耐藥性分析[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2009,9(2):205.

[6]張諱博,倪語星,孫景勇,等.2010年中國CHINET銅綠假單胞菌耐藥性監(jiān)測[J].中國感染與化療雜,2012,3(12)161.

[7]施曉群,孫景勇,倪語星,等.2011年中國CHINET銅綠假單胞菌耐藥性監(jiān)測[J].中國感染與化療雜,2013,3(13)219.

[8]張?jiān)?孫景勇,倪語星,等.2012年中國CHINET銅綠假單胞菌耐藥性監(jiān)測[J].中國感染與化療雜,2015,3(15)199.

[9]陳詠君,陳詠玫,張立群,等.219株銅綠假單胞菌感染分布與耐藥性分析[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新,2014,4(11):80.

[10]JovcicB，LepsanovicZ，SuljagicV，etal．EmergenceofNDM-1metallo-β-lactamaseinPseudomonasaeruginosaclinicalisolatesfromSerbia[J],AntimicrobAgentsChemother，2011,55(8):3929.

[11]Vatcheva-DobrevskaR,MuletX,IvanovI,etal.MolecularEpidemiologyandMultidrugResistanceMechanismsofPseudomonasaeruginosaIsolatesfromBulgarianHospitals[J].MicrobDrugResist,2013,19(5):355.

[12]史偉峰,王玉月,姜慶波,等.多重耐藥性銅綠假單胞菌耐藥基因及菌株聚類分析[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2007,17(9):1057.

[13]劉樹華,劉平洪,薛曉,等.燒傷病房亞胺培南耐藥銅綠假單胞菌的耐藥性及耐藥基因分析[J].中華燒傷雜志,2014,30(1):25.

[14]王歡,黃慶,黃君,等.銅綠假單胞菌OprD2基因環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測技術(shù)的研究[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2013,36(6):543.

[15]劉濤,修清玉.耐碳青霉烯銅綠假單胞菌金屬β-內(nèi)酰胺酶和外膜蛋白機(jī)制研究[J].國際呼吸雜志,2015,9(35):1361.

[16]曾麗,曾文,鄧文喻,等.耐亞胺培南銅綠假胞菌耐藥性分析及耐消毒劑基因檢測[J].國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2012,8(15):1795.

[17]顏英俊,糜祖煌,劉華,等.耐亞胺培南銅綠假單胞菌的耐藥特征及耐消毒劑基因的檢測分析[J].中國抗生素雜志,2007,32(4):249.

[18]SlekovecC,PlantinJ,CholleyP,etal.TrackingdownantibioticresistantPseudomonasaeruginosaisolatesinawastewaternetwork[J].PLoSOne,2012,7(12):e49300.

StudyOnmetalintheβ-lactamaseresistancegenesresistantPseudomonasaeruginosaimipenem

CHEN Yong-jun,CHEN Yong-mei,ZHANG Li-qun,et al.

(Second Affiliated Hospital of Shenyang Medical College,Shenyang 110002 ,China)

ObjectiveToinvestigatetheimipenem-resistantPseudomonasaeruginosagenotypeinourhospitalclinicalisolates.MethodsAtotalof219Pseudomonasaeruginosawerecollectedinourhospital.Double-disksynergytestwasusedto35ofimipenem-resistantPseudomonasaeruginosaphenotypebyMBLdetection.Polymerasechainreaction(PCR)wasusedtodetectMBLgenotypes.PCRmplificationpositivestrainswassequenced.ResultsAmong219ofPaeruginosa,imipenem-resistantwas35cases.Amongtheimipenem-resistant,MBL-positivephenotypewas21case(16%).WhichIMP-1-typepositive7,VIM-2type2positive.Conclusionβ-lactamaseproducingmetalPseudomonasaeruginosaisoneofthemainmechanismswithintheβ-lactamantimicrobialresistanceofclinicalrational.Itshouldberationallyusemedicinessothattoreduceresistancestrainsgenerating.

pseudomonasaeruginosa；imipenem；Metallo-β-lactamase

遼寧省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(L2013399)；沈陽醫(yī)學(xué)院科技基金項(xiàng)目(2013020)

1007-4287(2016)09-1471-04

R378.99+1

A

2015-04-11)