張凱倫，羅祖良，郭玉華，石宏武，馬小軍，2*

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥用植物研究所 云南分所，云南 景洪 666100)

·基礎(chǔ)研究·

不同生長(zhǎng)時(shí)期羅漢果果實(shí)轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄組分析及酵母單雜交文庫(kù)的構(gòu)建△

張凱倫1，羅祖良1，郭玉華1，石宏武1，馬小軍1，2*

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥用植物研究所 云南分所，云南 景洪 666100)

目的研究羅漢果果實(shí)中的轉(zhuǎn)錄因子(transcription factors，TFs)。方法在授粉后3、50、70 d(days after flowering，DAF)的羅漢果果實(shí)轉(zhuǎn)錄組中查詢注釋為轉(zhuǎn)錄因子的所有非重復(fù)Unigene，并在表達(dá)譜中查找其表達(dá)情況；應(yīng)用Matchmaker Yeast One-Hybrid Library Construction系統(tǒng)構(gòu)建酵母單雜交cDNA文庫(kù)。結(jié)果羅漢果表達(dá)譜數(shù)據(jù)中共有38個(gè)家族的119個(gè)轉(zhuǎn)錄因子Unigene具有表達(dá)差異，其中以70 DAF/3 DAF和50 DAF/3 DAF組中具有差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子數(shù)目較多，且上調(diào)和下調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子Unigene數(shù)目相近。此外，初步篩選到4個(gè)可能參與羅漢果甜苷合成調(diào)控的bHLH(basic helix-loop-helix，bHLH)轉(zhuǎn)錄因子Unigene(bHLH014、bHLH025、bHLH093、bHLH096)及8個(gè)可能參與黃酮類化合物合成調(diào)控的MYB轉(zhuǎn)錄因子Unigene；成功構(gòu)建了酵母單雜交文庫(kù)pGADT7-Rec2-Lib，其庫(kù)容量為2.3×106 cfu，插入片段的平均長(zhǎng)度約為1.5 kbp。結(jié)論轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析和酵母單雜交實(shí)驗(yàn)有助于篩選羅漢果果實(shí)中具有調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子。

羅漢果；轉(zhuǎn)錄因子；轉(zhuǎn)錄組；酵母單雜交文庫(kù)

羅漢果是多年生藤本植物葫蘆科(Cucurbitaceae)羅漢果屬(Siraitia)羅漢果Siraitiagrosvenorii的果實(shí)，主要分布于中國(guó)廣西壯族自治區(qū)，其主要化學(xué)成分為葫蘆烷型三萜皂苷羅漢果甜苷。作為藥食同源植物，羅漢果一方面長(zhǎng)期作為傳統(tǒng)中藥具有鎮(zhèn)咳平喘、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等療效[1]；另一方面由于其成熟果實(shí)提取物的高甜度(比蔗糖還要甜300倍)[2]，在作為食品添加劑及糖尿病患者的非糖甜味劑方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

轉(zhuǎn)錄因子(transcription factors，TFs)即反式作用分子，在細(xì)胞核內(nèi)能夠特異性識(shí)別并結(jié)合基因啟動(dòng)子上的順式作用元件(cis-acting element)，調(diào)控基因的時(shí)空表達(dá)。它們與植物的生長(zhǎng)發(fā)育[3]、次生代謝[4]和抗逆反應(yīng)[5]有著密切的關(guān)系。典型的植物轉(zhuǎn)錄因子是由核定位信號(hào)區(qū)(nuclear localization signal，NLS)、DNA結(jié)合區(qū)(DNA binding domain，DBD)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)(transcription regulation domain，TRD)和寡聚化位點(diǎn)(oligomerization site，OS)組成。根據(jù)其中DNA結(jié)合區(qū)氨基酸序列的不同，可分為具有不同結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子家族，如MYB、bHLH、WRKY、bZIP、AP2/EREBP等。常用的分離轉(zhuǎn)錄因子的方法為酵母單雜交法(yeast one-hybrid，Y1H)，它是在體外分析DNA(目的基因順式作用元件)與蛋白質(zhì)(轉(zhuǎn)錄因子)相互作用的有效方法，主要通過(guò)構(gòu)建誘餌載體和酵母單雜交文庫(kù)，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序從而篩選出與基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子?，F(xiàn)已用酵母單雜交技術(shù)克隆到多種植物中的轉(zhuǎn)錄因子，如豌豆[6]、長(zhǎng)春花[7]、中國(guó)紅豆杉等[8]。

2011年，Tang等[9]應(yīng)用Solexa高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)授粉后3、50、70 d(days after flowering，DAF)的羅漢果果實(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和表達(dá)譜分析，開(kāi)啟了關(guān)于羅漢果分子生物學(xué)的研究。現(xiàn)已從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中鑒定了羅漢果甜苷骨架生物合成途徑中的所有酶基因，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了多個(gè)家族轉(zhuǎn)錄因子的存在。本研究主要通過(guò)分析轉(zhuǎn)錄組和表達(dá)譜數(shù)據(jù)中的轉(zhuǎn)錄因子及建立酵母單雜交cDNA文庫(kù)，旨在為羅漢果果實(shí)中轉(zhuǎn)錄因子的篩選及其調(diào)控機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料為于30 DAF經(jīng)500 μmol·L-1茉莉酸甲酯(methyl jasmonate，MeJA)誘導(dǎo)后24 h的羅漢果果實(shí)及已提取的果實(shí)cDNA(均保存于-80 ℃)，3、50、70 DAF的羅漢果果實(shí)轉(zhuǎn)錄組和表達(dá)譜數(shù)據(jù)[9]。

1.2 試劑

Trizol Reagent(Invitrogen)、熒光定量試劑盒SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(TliRNaseH Plus)(TaKaRa，Dalian，China)、酵母單雜交系統(tǒng)MatchmakerTMOne-Hybrid Library Construction & Screening Kit(Catalog No.630304，Clontech)、酵母質(zhì)粒提取試劑盒(D1160-100，Solarbio)。DNA合成由生工生物工程股份有限公司完成；各種酶制劑及大腸桿菌感受態(tài)購(gòu)自Takara公司(大連)。

1.3 儀器

NanoDrop 2000 spectrophotometer (Thermo Scientific，USA)、AB 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystem，USA)、電轉(zhuǎn)化儀(Bio-Rad)、PCR儀(Bio-Rad)。

2 方法

2.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中轉(zhuǎn)錄因子的分析

對(duì)羅漢果3、50、70 DAF轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中注釋為轉(zhuǎn)錄因子的Unigene進(jìn)行整理，然后在表達(dá)譜中查找包括50 DAF/3 DAF、70 DAF/3 DAF和70 DAF/50 DAF組中所有表達(dá)有差異的轉(zhuǎn)錄因子Unigene并進(jìn)行分類。

2.2 熒光定量PCR篩選可能參與甜苷合成的bHLH轉(zhuǎn)錄因子

由于羅漢果甜苷V的含量在羅漢果果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育的后期才開(kāi)始激增(50～70 DAF)，有表達(dá)差異的轉(zhuǎn)錄因子Unigene中bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族數(shù)目最多，因此選擇在70 DAF/3 DAF和50 DAF/3 DAF組中均有表達(dá)差異的bHLH轉(zhuǎn)錄因子Unigene作為研究對(duì)象，用經(jīng)驗(yàn)證施加MeJA后甜苷含量和合成酶基因表達(dá)量均增加的羅漢果果實(shí)cDNA作為實(shí)驗(yàn)材料，應(yīng)用熒光定量PCR檢測(cè)表達(dá)譜中表達(dá)差異較大(2個(gè)組的基因表達(dá)量log2值均大于2)的6個(gè)候選bHLH轉(zhuǎn)錄因子Unigene在MeJA誘導(dǎo)下的表達(dá)情況，選擇UBQ5為內(nèi)參基因，引物見(jiàn)表1。

表1 用于熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)的引物

2.3 總RNA的提取及mRNA的分離

選用前期實(shí)驗(yàn)室已驗(yàn)證經(jīng)MeJA處理后，甜苷含量及合成酶基因表達(dá)量有明顯提高的羅漢果果肉，用改良Trizol法[10]提取樣品中的總RNA。使用Oligotex mRNA Kits(Qiagen)分離純化樣品的mRNA。

2.4 cDNA的合成與純化

將分離得到的樣品mRNA轉(zhuǎn)移到RNase free離心管1中，加入7 μL mRNA、1 μL 3′RTPrimer(30 pmol)和1 μL dNTPs(10 mmol·L-1)，65 ℃處理5 min，立即置于冰上。在一個(gè)新的RNase free 離心管2中加入4 μL 5×RT Buffer、2 μL 0.1 mol·L-1DTT、5 μL RT 酶，并置于冰上待用。待管1降至45 ℃后，維持在45 ℃2 min，再加入管2中的混勻液，繼續(xù)在50 ℃條件下孵育1 h合成第一鏈cDNA。

繼續(xù)在反應(yīng)管中加入92 μL DEPC-treated water、30 μL 5×Second Strand Buffer、3 μL 10 mmol·L-1(each) dNTPs、1 μLE.coliDNA Ligase(10 U·μL-1)、4 μLE.coliDNA Polymerase I和1 μLE.coliRNaseH(2 U·μL-1)，在16 ℃孵育2 h。然后加入2 μLT4DNA Polymerase，于16 ℃孵育5 min，加入10 μL 0.5 mol·L-1EDTA(pH8.0)及160 μL酚-三氯甲烷-異戊醇(25∶24∶1)溶液，充分混勻30 s，在室溫條件下，于14 000 r·min-1離心5 min，小心將上清液倒入新的離心管中，用乙醇沉淀，最后溶于105 μL DEPC水中。

在新的反應(yīng)管中加入34 μL cDNA、5 μL 10×T4 ligase Buffer、10 μL 5′ Adapter(1 μg·μL-1)和1 μL T4 DNA Ligase(40 U·μL-1，NEB)?；靹蚝?，在16 ℃放置16～24 h。使用低熔點(diǎn)瓊脂糖電泳cDNA，切膠回收1000 bp以上的條帶，乙醇沉淀后溶于14 μL水中，并進(jìn)行電泳檢測(cè)。

2.5 cDNA與載體的連接

在1.5 mL離心管中加入14 μL cDNA、2 μL pGADT7(300 ng·μL-1)和4 μL 5×Infusion enzyme mix，混勻后置于50 ℃孵育30 min，然后向重組反應(yīng)體系中加入2 μL的ProteinaseK，在37 ℃孵育15 min，繼續(xù)在75 ℃孵育10 min，補(bǔ)水到100 μL。

然后向反應(yīng)體系中依次加入1 μL Glycogen(20 μg·μL-1)、50 μL 7.5 mol·L-1NH4OAc和375 μL 100% ethanol，混合均勻后置于-80 ℃ 1 h，于4 ℃、16 000 r·min-1離心30 min；小心去上清液，加入150 μL的70%乙醇，于4 ℃、16 000 r·min-1離心3 min；重復(fù)上述步驟1次，去盡上清液，在室溫下將cDNA晾干5～10 min；用10 μL的DEPC水重懸cDNA沉淀，用移液槍吹吸30～40次。瞬時(shí)離心2 s收集cDNA，立即放置于冰上。

2.6 酵母單雜交文庫(kù)的構(gòu)建及質(zhì)量鑒定

將2 μL的重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化50 μL大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，取轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌原液10 μL稀釋100倍，從中取出10 μL涂布LB平板(含氨芐抗性)，第二天計(jì)數(shù)，計(jì)算公式為：總克隆數(shù)=平板上克隆數(shù)×稀釋倍數(shù)×菌液體積。挑取平板上的單克隆，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并用凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物大小。使用Qiagen大抽試劑盒提取質(zhì)粒，保存于-80 ℃冰箱內(nèi)。

3 結(jié)果與分析

3.1 羅漢果轉(zhuǎn)錄組與表達(dá)譜數(shù)據(jù)中轉(zhuǎn)錄因子的分析

3.1.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析 在羅漢果轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)已注釋家族的轉(zhuǎn)錄因子共468個(gè)，其中數(shù)目最多的3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族為bHLH、WRKY和MYB轉(zhuǎn)錄因子，它們的數(shù)量分別為79、57、50個(gè)。此外，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中還有其他類型的轉(zhuǎn)錄因子，包括19個(gè)HSF、16個(gè)TCP、9個(gè)HB、6個(gè)MYB-related和5個(gè)bZIP等轉(zhuǎn)錄因子家族。

3.1.2 表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析 對(duì)3、50、70 DAF的羅漢果果實(shí)表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以任意一個(gè)組有差異變化為標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)了共38個(gè)家族的119個(gè)轉(zhuǎn)錄因子Unigene(占總轉(zhuǎn)錄因子數(shù)目的25.4%)具有表達(dá)差異，其中數(shù)目最多的3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族為bHLH、WRKY和MYB轉(zhuǎn)錄因子，它們的數(shù)量分別為22、14、14個(gè)。在70 DAF/3 DAF、50 DAF/3 DAF和70 DAF/50 DAF 3個(gè)組中具有表達(dá)差異的Unigene數(shù)目分別為86、91和40個(gè)，且在70 DAF/3 DAF、50 DAF/3 DAF組中上調(diào)和下調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子Unigene數(shù)目相近，在70 DAF/50 DAF組中上調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子Unigene數(shù)目比下調(diào)的數(shù)目多(見(jiàn)圖1)。對(duì)3個(gè)組進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在3個(gè)組中均有表達(dá)差異的轉(zhuǎn)錄因子Unigene個(gè)數(shù)為10；對(duì)2個(gè)組分別進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在70 DAF/3 DAF和50 DAF/3 DAF組中均有表達(dá)差異的轉(zhuǎn)錄因子Unigene共58個(gè)，在70 DAF/3 DAF和70 DAF/50 DAF組中均有表達(dá)差異的轉(zhuǎn)錄因子Unigene共18個(gè)，在50 DAF/3 DAF和70 DAF/50 DAF組中均有表達(dá)差異的轉(zhuǎn)錄因子Unigene共27個(gè)。

由于羅漢果甜苷V的含量在果實(shí)生長(zhǎng)后期50～70 DAF激增，因此為了篩選可能參與甜苷合成的轉(zhuǎn)錄因子，選擇在70 DAF/3 DAF和50 DAF/3 DAF組中均上調(diào)表達(dá)的共16個(gè)家族的33個(gè)轉(zhuǎn)錄因子Unigene進(jìn)行分析，它們的表達(dá)變化范圍為1.03～13.89。其中包括12個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子，其他家族還包括TCP、MYB、WRKY、GRAS等，數(shù)量均≤3(見(jiàn)表2)。

圖1 羅漢果表達(dá)譜中具有表達(dá)差異的轉(zhuǎn)錄因子

表2 70 DAF/3 DAF和50 DAF/3 DAF組中均上調(diào)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子Unigene

3.1.3 參與調(diào)控羅漢果甜苷合成途徑的bHLH轉(zhuǎn)錄因子的篩選 選擇在70 DAF/3 DAF和50 DAF/3 DAF組中表達(dá)差異較大的6個(gè)注釋為bHLH轉(zhuǎn)錄因子的Unigene(bHLH014、bHLH025、bHLH061、bHLH071、bHLH093、bHLH096)，以經(jīng)MeJA誘導(dǎo)后的羅漢果果實(shí)作為實(shí)驗(yàn)材料，應(yīng)用qRT-PCR篩選與甜苷合成關(guān)鍵酶基因協(xié)同表達(dá)的bHLH轉(zhuǎn)錄因子。結(jié)果顯示除了bHLH061和bHLH071基因外(結(jié)果未顯示)，其他4個(gè)bHLH基因bHLH014、bHLH025、bHLH093、bHLH096的表達(dá)量均被不同程度地上調(diào)(見(jiàn)圖2)，表明它們可能參與甜苷合成的調(diào)控。其中，bHLH093和bHLH096基因在6 h的表達(dá)量較0 h相比，增加了9～10倍；bHLH025在6 h則增加了1.8倍。bHLH014基因的表達(dá)量在2 h達(dá)到最大值，為0 h的2.5倍。

注：A.bHLH014；B.bHLH025；C.bHLH093；D.bHLH096。圖2 4個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子的熒光定量PCR測(cè)定結(jié)果

3.1.4 參與調(diào)控果實(shí)中黃酮類化合物合成途徑的MYB轉(zhuǎn)錄因子的初步篩選 已報(bào)道羅漢果果實(shí)中含有少量的黃酮類化合物，且總黃酮的含量隨著果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育先逐漸增長(zhǎng)，在50 DAF時(shí)達(dá)到含量的峰值，然后下降[11]。MYB類轉(zhuǎn)錄因子是調(diào)控植物中黃酮類化合物生物合成的主要轉(zhuǎn)錄因子家族[12]。因此，在表達(dá)譜50 DAF/3 DAF組數(shù)據(jù)中找到了8個(gè)MYB類轉(zhuǎn)錄因子Unigene，可能參與羅漢果果實(shí)中黃酮類化合物的生物合成，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 8個(gè)可能參與羅漢果果實(shí)中黃酮類化合物生物合成的MYB轉(zhuǎn)錄因子Unigene

3.2 酵母單雜交的構(gòu)建

3.2.1 總RNA與ds cDNA的質(zhì)量檢測(cè) 采用trizol試劑提取羅漢果果實(shí)中的總RNA，凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖3。從圖中可看到兩條清晰的主帶28S和18S，且28S條帶的亮度大于18S的亮度，表明所提取的RNA無(wú)降解現(xiàn)象，質(zhì)量良好。核酸定量檢測(cè)結(jié)果顯示總RNA的A260/A280值為1.98，符合要求，濃度為830 ng·μL-1。

注：M.1 kbplus DNAladder；1、2.提取的總RNA。圖3 羅漢果果實(shí)中提取的總RNA電泳分析

將純化的ds cDNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，見(jiàn)圖4。從圖4中可看到ds cDNA呈明亮的彌散狀條帶，符合文庫(kù)的構(gòu)建要求。

注：M.1kb plus DNA ladder；1.純化的ds cDNA。圖4 羅漢果果實(shí)中純化后的ds cDNA電泳分析

3.2.2 酵母單雜交文庫(kù)的質(zhì)量檢測(cè) 將10 μL原始電轉(zhuǎn)化菌稀釋100倍后，取10 μL涂板，在平板上共長(zhǎng)了約230個(gè)克隆子，共計(jì)5 mL的轉(zhuǎn)化后原始菌液，因此總庫(kù)容量為：5×230/10×100×1000=2.3×106cfu。插入片段的凝膠電泳圖見(jiàn)圖5，結(jié)果顯示插入片段的平均長(zhǎng)度約1.5 kbp。

注：M.1kb plus DNA ladder；1～24.插入片段。圖5 酵母單雜交文庫(kù)插入片段電泳分析

4 討論

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組學(xué)已經(jīng)逐漸成為研究者探索生物體生理生化過(guò)程機(jī)制的有效手段。本研究利用不同時(shí)期羅漢果果實(shí)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析果實(shí)中的轉(zhuǎn)錄因子，篩選到4個(gè)與甜苷含量及合成酶基因表達(dá)變化協(xié)同一致的bHLH轉(zhuǎn)錄因子Unigene，提示它們可能參與調(diào)控羅漢果甜苷的合成。接下來(lái)可以對(duì)它們進(jìn)行克隆表達(dá)，利用酵母單雜交、凝膠遷移實(shí)驗(yàn)(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)等方法分析它們與甜苷合成酶基因啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合能力；或?qū)λ鼈冞M(jìn)行RNA干擾及過(guò)表達(dá)以確認(rèn)它們的功能。

在羅漢果轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中同時(shí)找到了50個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子，MYB轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)控高等植物中黃酮類成分的積累和相關(guān)基因的表達(dá)。在羅漢果果實(shí)中除了含有三萜皂苷外，還含有黃酮類化合物，主要成分為羅漢果素(grosvenorine)和槲皮素苷及它們的苷元山柰酚和槲皮素[13]。對(duì)不同時(shí)期羅漢果果實(shí)中總黃酮的含量進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其含量先逐漸增長(zhǎng)，在50 DAF達(dá)到最大值，然后在60 DAF迅速下降至20 DAF水平[11]。因此本研究利用表達(dá)譜數(shù)據(jù)篩選了在50 DAF/3 DAF組中表達(dá)量上調(diào)的8個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子Unigene，它們可能參與調(diào)控羅漢果果實(shí)中黃酮類化合物的生物合成。接下來(lái)，可以通過(guò)克隆已鑒定的羅漢果查爾酮合成酶基因SgCHS的啟動(dòng)子序列[14]，檢測(cè)這8個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子Unigene與SgCHS基因啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合情況。

在羅漢果的同屬植物黃瓜中，發(fā)現(xiàn)了與氧化鯊烯環(huán)化酶基因Bi(登陸號(hào)：KM655855.1)基因啟動(dòng)子區(qū)E-box結(jié)合的bHLH轉(zhuǎn)錄因子[15]，Bi與羅漢果甜苷合成關(guān)鍵酶基因CS(登錄號(hào)：HQ128567.1)有86%的同源性，且CS基因啟動(dòng)子區(qū)也含有E-box，提示羅漢果中可能也存在能夠與CS基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合的bHLH類轉(zhuǎn)錄因子。然而，本課題組通過(guò)CS基因啟動(dòng)子區(qū)E-box構(gòu)建的誘餌載體及已成功建立的cDNA文庫(kù)，利用酵母單雜交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子的篩選時(shí)，在52個(gè)陽(yáng)性克隆中未發(fā)現(xiàn)bHLH轉(zhuǎn)錄因子，這可能與所選取的E-box與bHLH轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合能力較弱有關(guān)：已知能被bHLH蛋白識(shí)別的核心序列為E-box(5′-CANNTG-3′)，中間兩個(gè)核苷酸的不確定性使E-box有不同的種類，其中80%以上的序列為G-box(5′-CACGTG-3′)[16]。CS基因啟動(dòng)子區(qū)不含有G-box，而含有不同類型的E-box，有文獻(xiàn)對(duì)這些E-box與bHLH蛋白的結(jié)合能力進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)與G-box相比它們的結(jié)合能力下降了50%以上[17]。

本研究成功構(gòu)建了酵母單雜交文庫(kù)，有助于通過(guò)建立誘餌載體進(jìn)行酵母單雜交實(shí)驗(yàn)，篩選與誘餌DNA序列結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，為尋找羅漢果果實(shí)中具有調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子，闡明羅漢果中相關(guān)活動(dòng)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

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TranscriptomeAnalysisonTranscriptionFactorsofSiraitiagrosvenoriiFruitsatDifferentGrowingStagesandConstructionofYeastOne-HybridLibrary

ZHANG Kailun1，LUOZuliang1，GUOYuhua1，SHIHongwu1，MAXiaojun1，2*

(1.InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege，Beijing100193，China；2.YunnanBranchofInstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalSciences，Jinghong666100，China)

Objective：To study transcription factors (TFs)in the fruits ofSiraitiagrosvenorii.MethodsNon repeating TFs unigenes were selected in transcriptome ofS.grosvenoriifruits at 3，50 and 70 DAF and their expressions were investigated in gene expression profiles；Matchmaker Yeast One-Hybrid Library Construction system was applied to construct yeast one-hybrid cDNA library.Results119 differentially expressed TFs unigenes which belong to 38 TFs families were found out.The numbers of TFs unigenes in 70 DAF/3 DAF and 50 DAF/3 DAF groups were greater and the numbers of the up-regulated and down-regulated TFs unigenes were similar.What’s more，4 bHLH (basic helix-loop-helix，bHLH) TFs unigenes (bHLH014、bHLH025、bHLH093、bHLH096) which might involve in the regulation of mogrosides synthesis and 8 MYB TFs unigenes which might involve in the regulation of flavonoids synthesis were screened.The yeast one-hybrid library pGADT7-Rec2-Lib was successfully constructed with 2.3×106cfu storage capacity.And the inserted PCR fragments sizes are about 1.5 kbp.ConclusionTranscriptome analysis and yeast one-hybrid system are able to help the selection of transcription factors with regulatory effect inS.grosvenoriifruits.

Siraitiagrosvenorii；transcription factor；transcriptome；yeast one-hybrid library

2016-05-04)

國(guó)家自然科學(xué)基金(81373914，81573521)

*

馬小軍，研究員，研究方向：分子生物學(xué)；E-mail：mayixuan10@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.8.001