孫雪杉　楊仁杰　董桂梅　周長宏　楊延榮　 張偉玉

( 天津農(nóng)學院工程技術(shù)學院, 天津 300384)

?

基于二維熒光相關(guān)譜的多環(huán)芳烴重疊峰解析

孫雪杉楊仁杰*董桂梅周長宏楊延榮 張偉玉

( 天津農(nóng)學院工程技術(shù)學院, 天津 300384)

以激發(fā)波長為外擾，基于二維熒光相關(guān)譜技術(shù)對蒽芘混合溶液中重疊的熒光峰進行有效解析。采集了蒽、芘單組份無水乙醇溶液的激發(fā)譜，選擇了蒽和芘熒光強度單調(diào)變化的5個激發(fā)波長：270nm、320nm、325nm、330nm和340nm。在此基礎上，采集濃度為5×10-5g/L蒽芘無水乙醇混合溶液在5個激波長下的熒光譜，并以選擇的激發(fā)波長為外擾，構(gòu)建同步和異步二維熒光相關(guān)譜。結(jié)果表明：在同步譜上出現(xiàn)5個較強的自相關(guān)峰，位置分別在369 nm、379 nm、391 nm、400 nm和424 nm處；依據(jù)未被覆蓋的蒽在424nm的處熒光與各波長處熒光交叉峰的正負，指出379 nm和400nm處的熒光峰來自混合溶液中的蒽，而369 nm和391 nm處的熒光峰來自混合溶液中的芘。同時，又根據(jù)異步二維熒光相關(guān)譜交叉峰的有無，進一步確認和驗證了混合溶液中各熒光峰的來源。

二維熒光相關(guān)譜蒽芘無水乙醇

多環(huán)芳烴(PAHs)是兩個或兩個以上苯環(huán)以及稠環(huán)和非稠環(huán)連接在一起的化合物。PAHs在環(huán)境中無處不在，許多PAHs具有致癌性、致畸性、致突變性，并且具有生物累積性，能長期留存在環(huán)境中，因此對多環(huán)芳烴的檢測已得到很多國家的重視。其中，美國環(huán)保暑已將16種多環(huán)芳烴列為優(yōu)先控制的污染物。近年來，霧霾頻發(fā)，“PM2.5”猖獗，北京、天津等城市經(jīng)常被霧霾籠罩，人們的健康受到威脅。讓人們談之色變的“PM2.5”，其主要成分之一就是PAHs，因此尋求一種快速、精確、便捷的檢測PAHs的方法已成為環(huán)保部門急需解決的中重大問題之一。

由于環(huán)境中的PAHs多處于復雜體系中，且含量較低，給PAHs的分析帶來一定的困難。目前，已經(jīng)有不少研究多環(huán)芳烴的方法，如氣相色譜法、高效液相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)、超臨界流體層析色譜等[1]，這些方法多是將環(huán)境樣品經(jīng)過復雜的前處理進行分離提純，再進行分析。操作繁瑣，且需要大量的有機試劑，費時費力，因此開發(fā)一種簡便快速檢測環(huán)境中多環(huán)芳烴的方法一直是研究者們研究的焦點。

熒光光譜是光譜分析中靈敏度高，選擇性較好的分析方法，已經(jīng)被廣泛的應用于環(huán)境中多環(huán)芳烴定性定量分析[1-4]。但由于大部分多環(huán)芳烴的激發(fā)和發(fā)射波長非常接近，特征熒光峰相互重疊，嚴重制約了熒光分析法的選擇性。蒽和芘是美國EPA推薦優(yōu)先控制的16種多環(huán)芳烴中的兩種。王晗[3]，蔡宗群[4]等指出蒽、芘混合溶液常規(guī)一維譜中熒光峰相互重疊，基于恒波長同步熒光光譜技術(shù)對混合溶液中蒽和芘重疊的熒光峰進行解析。雖然同步熒光光譜技術(shù)相對于常規(guī)的熒光譜，在靈敏度和選擇性上都有所提高，但多組分的PAHs特征熒光峰重疊現(xiàn)象仍然很嚴重，而且對于最佳Δλ和ΔE的選擇，需要連續(xù)不斷掃描嘗試，且時間較長。

與常規(guī)一維譜相比，二維相關(guān)譜具有高光譜分辨率、高選擇性和高圖譜解析能力，已被廣泛的應用于物理、化學、材料、生物、醫(yī)學、食品等各個領(lǐng)域[5，6]。近年來，作者所在的課題組將二維相關(guān)譜技術(shù)應用在乳制品質(zhì)量檢測中，取得階段性成果[7-11]。將二維相關(guān)譜技術(shù)和熒光光譜技術(shù)相結(jié)合—二維相關(guān)熒光光譜技術(shù)，可以有效地解決常規(guī)熒光譜的局限性。余婧等[12]對二維相關(guān)熒光光譜技術(shù)的操作性和應用進行了系統(tǒng)闡述，并與普通一維熒光光譜比較，說明了二維相關(guān)熒光光譜技術(shù)的優(yōu)勢。田萍等[13，14]采用二維相關(guān)熒光光譜技術(shù)對不同種類的食用植物油進行有效鑒別，指出二維相關(guān)熒光光譜技術(shù)在食用植物油的種類識別及摻假鑒別中具有廣闊的應用前景。關(guān)娜和等[15]設計并配置了9個蒽、芘混合溶液，以濃度為外擾，構(gòu)建二維相關(guān)熒光譜，實現(xiàn)蒽芘混合溶液中重疊熒光峰的解析。Nakashima等[16，17]采用二維熒光相關(guān)譜研究了多環(huán)芳烴的熒光特性，指出對于嚴重重疊的復雜體系，傳統(tǒng)熒光譜無法分辨的熒光峰在相關(guān)譜中則分辨得相當清楚。

本實驗以激發(fā)波長為外擾，研究蒽芘混合溶液的熒光特性，對蒽芘重疊的熒光峰進行有效解析，為復雜環(huán)境多環(huán)芳烴的檢測提供實驗和理論基礎。

1　實驗儀器與材料

儀器：熒光分光光度計LS-55(美國PerkinElmer公司)，脈沖氙燈，1 cm帶塞石英比色皿。熒光測定條件：激發(fā)和發(fā)射單色儀狹縫寬度均為5 nm，掃描速度為1000 nm/min。所用試劑無水乙醇、蒽和芘都為分析純。

1.1樣品配置

分別稱取0.05g的分析純蒽和芘粉末，用適量的無水乙醇溶解，轉(zhuǎn)移至500mL棕色容量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻定容，分別配置濃度均為0.1g/L的蒽和芘的儲備液，置于陰涼處。移取不同量的蒽和芘儲備液，采用逐步稀釋法配置濃度均為1×10-5g/L蒽和芘單組份溶液以及濃度為5×10-5g/L蒽和芘的混合溶液。

1.2同步和異步二維熒光相關(guān)同步譜的計算

假設原始常規(guī)一維熒光光譜A(m×n)包含m個光譜，根據(jù)二維相關(guān)Noda理論[14]，則同步二維熒光相關(guān)譜Φ(ν1,ν2)可表示為：

(1)

異步二維熒光相關(guān)異步譜Ψ(ν1,ν2)可表示為：

(2)

式中，T表示轉(zhuǎn)置，N為m階方陣(m是光譜數(shù))，稱為Hilbert-Noda矩陣，其矩陣元為：

2　結(jié)果與討論

根據(jù)文獻[15]可知，在320nm波長光的激發(fā)下，蒽的無水乙醇溶液在379 nm、400 nm和424 nm處存在3個較強熒光峰，其中400nm處熒光峰最強；而芘的無水乙醇溶液在373 nm和393 nm處存在兩個較強熒光峰，其中393nm處熒光峰最強。因此，在400nm和393nm熒光峰位置，分別采集了單組份蒽和芘無水乙醇溶液的激發(fā)譜(見圖1a)。從圖中可以看出，蒽在325nm和340nm存在較強的激發(fā)峰，其中340nm處最強；而芘在270nm、318nm和334nm存在較強的熒光峰，其中270nm處最強。

本實驗的研究目標是通過激發(fā)波長外擾的二維相關(guān)熒光譜，實現(xiàn)蒽芘混合溶液重疊熒光峰的解析。為了實現(xiàn)上述目標，需要對激發(fā)波長進行選擇。由于二維相關(guān)熒光譜體現(xiàn)的是隨外擾變化的特征信息，因此選擇激發(fā)波長的原則是：①在選定激發(fā)波長下，蒽和芘的熒光強度反向變化，且是單調(diào)變化(即蒽的乙醇溶液的熒光強度隨外擾激發(fā)波長的變化單調(diào)增加或減小，而芘的乙醇溶液的熒光強度隨外擾激發(fā)波長的變化單調(diào)減小或增加)；②為了提高信噪比，所選定的激發(fā)波長中包括蒽和芘的最佳激發(fā)波長(最強激發(fā)峰多對應的波長)?；谏鲜鲈瓌t，實驗中，選擇了5個激發(fā)波長λ1～λ5，分別為270nm、320nm、325nm、330nm和340nm。圖1b給出了蒽(400nm)和芘(393nm)的無水乙醇溶液在λ1～λ55個激發(fā)長下熒光強度的變化。很顯然，隨著激發(fā)波長的變化，蒽在400nm位置處的熒光強度單調(diào)增加，芘在393nm位置處的熒光強度單調(diào)減小。

采集λ1～λ55個波長270nm、320nm、325nm、330nm、340nm激發(fā)下，蒽芘混合溶液(5×10-5g/L)的常規(guī)一維熒光譜(見圖2)。顯然，在270nm光的激發(fā)下，蒽芘混合溶液的熒光峰主要來自芘，僅在424nm處出現(xiàn)弱的蒽熒光峰，這與圖1a激發(fā)譜所提供的信息一致。隨著激發(fā)波長的增大，芘的熒光信息逐漸被蒽的熒光峰覆蓋，當激發(fā)波長為340nm時(蒽的最佳激發(fā)波長)，混合溶液的熒光峰主要來自蒽，在400nm和424nm處都出現(xiàn)較強的熒光。

圖2　蒽芘混合溶液在λ1，λ2，λ3，λ4和λ5分別激發(fā)下的熒光譜

為了實現(xiàn)對蒽芘混合溶液中重疊的熒光峰進行解析和指認，以上述所選擇的5個激發(fā)波長為外擾，以平均譜為參考譜，在350～450 nm范圍內(nèi)對圖2中5個動態(tài)光譜依據(jù)式(1)和式(2)進行相關(guān)計算，得到同步和異步二維熒光相關(guān)譜。在相關(guān)譜圖中，陰影部分是負相關(guān)區(qū)域，而非陰影部分是正相關(guān)區(qū)域。

同步二維熒光相關(guān)譜是關(guān)于主對角線對稱的，表征的是所研究體系隨激發(fā)波長變化的“相似性”信息。隨著激發(fā)波長的變化，若兩個波長λi和λj處的熒光峰強度變化方向相同，則在(λi，λj)處同步交叉峰為正；反之，同步交叉峰為負。由于在5個波長光的激發(fā)下，蒽的無水乙醇溶液熒光強度單調(diào)增加，而芘的熒光強度單調(diào)減小。根據(jù)Noda規(guī)則：蒽和芘各自熒光的同步交叉峰都為正(用“+”表示)；蒽與芘相互間熒光的同步交叉峰為負(用“-”表示)。因此，可通過同步二維熒光相關(guān)譜中交叉峰的正負來對蒽芘混合溶液中重疊的熒光峰進行確認。

圖3是濃度為5×10-5g/L蒽芘無水乙醇混合溶液的同步二維熒光相關(guān)譜。顯然，在主對角線上出現(xiàn)5個較強的自相關(guān)峰，其位置分別在369nm、378nm、391nm、400nm和424nm處，說明這5個波長處的熒光峰強度隨著外擾激發(fā)波長改變而變化。在主對角線外側(cè)存在幾個較強的交叉峰，表1給出了各同步交叉峰的正負情況。根據(jù)參考文獻[15]，并結(jié)合圖2，可知424nm處蒽的熒光峰并未被覆蓋，所以可以根據(jù)該峰與其它峰相關(guān)的正負來對混合溶液中的重疊峰進行確認。從圖3和表1可以看出，在(424，369)nm和(424，391)nm處存在負的交叉峰，表明369nm、391nm與424nm處熒光峰強度隨激發(fā)波長變化方向相反，因此，369nm和319nm的熒光峰來自混合溶液中的芘。在(391，369)nm處存在正的交叉峰，進一步說明其來源相同。在(424，378)nm、(424，400)nm處存在正的交叉峰，表明378nm、400nm與424nm處熒光強度隨激發(fā)波長變化方向相同，因此，378nm和400nm的熒光峰來自混合溶液中的蒽。(378，369)nm、(400，369) nm處的負相關(guān)峰以及(400，378)nm的正相關(guān)峰也都進一步說明了混合溶液中各熒光峰的來源。

圖3　激發(fā)波長外擾，同步二維相關(guān)熒光譜

波長369378391400424369+378-+391+-+400-+-+424-+-++

圖4是濃度為5×10-5g/L蒽芘無水乙醇混合溶液的異步二維熒光相關(guān)譜。異步二維熒光相關(guān)譜是關(guān)于主對角線反對稱的，沒有自相關(guān)峰，表征的是研究體系隨外擾激發(fā)波長變化的“差異性”信息。若兩個波長(λi，λj)處存在異步交叉峰，表明λi和λj處熒光峰強度隨激發(fā)波長變化的快慢不同；若不存在異步交叉峰，則表明λi和λj處熒光峰強度隨激發(fā)波長變化的快慢相同，不存在差異性，即λi和λj處的熒光峰來源可能相同。表2給出了各異步交叉峰的正負或有無情況。從圖4和表2中可以看到，在(424，369)nm和(424，391)nm處出現(xiàn)負的交叉峰，表明369nm、391nm與424nm處熒光峰強度隨外擾激發(fā)波長變化的速率不同，因此369nm和391nm處的熒光峰來自混合溶液中的芘。在(424，378)nm和(424，400)nm處并沒有交叉峰出現(xiàn)，表明378nm、400nm與424nm隨外擾激發(fā)波長變化的速率相同，因此378nm和400nm處的熒光峰來自混合溶液中的蒽。同時，(391，369)nm和(400，378)nm處不存在異步交叉峰，都進一步證明了上述結(jié)論。

圖4　激發(fā)波長外擾，異步二維相關(guān)熒光譜

波長369378391400424369378-391無+400-無-424-無-無

3　結(jié)論

研究結(jié)果表明，激發(fā)波長為外擾的二維熒光相關(guān)譜實現(xiàn)蒽芘混合溶液重疊熒光峰的解析是可行的。與常規(guī)熒光譜相比，該方法操作簡單，而且能提供不同熒光團之間相互作用信息。將二維熒光光譜技術(shù)與平行因子等算法結(jié)合實現(xiàn)3種或更多組分多環(huán)芳烴混合溶液中重疊熒光峰有效解析，還有待于后續(xù)研究工作的進一步開展。該研究為檢測復雜環(huán)境中多組分的多環(huán)芳烴污染物提供理論和實驗基礎。

[1] Keshav K, Mishra A K. Simultaneous quantification of dilute aqueous solutions of certain polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) with significant fluorescent spectral overlap using total synchronous fluorescence spectroscopy (TSFS) and N-PLS, unfolded-PLS and MCR-ALS analysis[J]. Analytical Methods, 2011, 3(11):2616-2624.

[2] Goicoechea H C, Yu S, Moore A F, et al. Four-way modeling of 4.2 K time-resolved excitation emission fluorescence data for the quantitation of polycyclic aromatic hydrocarbons in soil samples[J]. Talanta, 2012, 101(15):330-336.

[3] 王晗，遲燕華，尚麗平，等. 膠束增敏同步熒光光譜法測定水中微量芘和蒽[J]. 理化檢驗-化學分冊, 2010, 46(7)：803-806.

[4] 蔡宗群，鹿貞彬，朱亞先，等. 同步熒光法同時測定水溶解態(tài)的蒽和芘[J], 分析試驗室, 2006, 25(4):61-64.

[5] Noda I. Frontiers of two-dimensional correlation spectroscopy. Part 1. New concepts and noteworthy developments [J]. J Mol Struct, 2014, 1069: 3-22.

[6] Noda I. Frontiers of two-dimensional correlation spectroscopy. Part 2. Perturbation methods, fields of applications, and types of analytical probes [J]. J Mol Struct, 2014, 1069: 23-49.

[7] 楊仁杰，楊延榮，劉海學，等. 二維相關(guān)譜在食品品質(zhì)檢測中的研究進展[J]. 光譜學與光譜分析，2015，35(08)：2124-2129.

[8] Yang R J, Dong G M, Sun X S, et al. Synchronous-asynchronous two-dimensional correlation spectroscopy for the discrimination of adulterated milk [J]. Analytical Methods, 2015, 7(10): 4302-4307.

[9] Yang R J, Liu R, Xu K X, et al. Discrimination of adulterated milk based on two-dimensional correlation spectroscopy (2D-COS) combined with kernel orthogonal projection to latent structure (K-OPLS) [J]. Appl. Spectrosc, 2013, 67(12): 1363-1367.

[10] Yang R J, Liu R, Xu K X, et al. Detection of adulterated milk using two-dimensional correlation spectroscopy combined with multi-way partial least squares [J]. Food bioscience, 2013, 2:61-67.

[11] Yang R J, Liu R, Xu K X, et al. Classification of adulterated milk with the parameterization of 2D correlation spectroscopy and least squares support vector machines [J]. Anal Methods, 2013, 5:5949-5953.

[12] 余婧, 武培怡. 二維相關(guān)熒光光譜技術(shù)[J]. 化學進展，2006, 18(2):1691-1702.

[13] 田萍，陳斌，陸道禮，等. 二維相關(guān)熒光光譜鑒別4種實用植物油種類的研究[J]. 食品安全質(zhì)量檢測學報，2011, 2(6):294-298.

[14] 田萍. 二維相關(guān)熒光光譜分析技術(shù)在食用植物油摻雜鑒別中的應用研究[D]. 江蘇大學碩士學位論文,2013.

[15] 關(guān)娜和，楊仁杰，董桂梅，等. 蒽芘混合溶液二維熒光相關(guān)譜解析, 光散射學報, 2015, 27(3):305-310.

[16] Nakashima K, Yasuda S, Ozaki Y, et al. Two-dimensional fluorescence correlation spectroscopy I: analysis of polynuclear aromatic hydrocarbons in cyclohexane solutions[J]. J Phys Chem, 2000, 104:9113-9120.

[17] Nakashima K, Yuda K, Ozaki Y, et al. Two-dimensional fluorescence correlation spectroscopy III: spectral analysis of derivatives of anthracene and pyrene in micellar solutions [J]. Spectrochim Acta A, 2004, 60:1783-1791.

Resolution of overlapping PAH peaks based on two-dimensional fluorescence correlation spectroscopy.

Sun Xueshan,Yang Renjie*，Dong Guimei, Zhou Changhong， Yang Yanrong, Zhang Weiyu

(CollegeofEngineeringandTechnology,TianjinAgriculturalUniversity,Tianjin300384,China)

Two-dimensional (2D) fluorescence correlation spectroscopy was applied to the resolution of highly overlapping fluorescence peaks of anthracene and pyrene in ethanol solution under the perturbation of excitation wavelength. At the same time, the origin of fluorescence bands of anthracene and pyrene were verified in terms of the existence or inexistence of corss peaks in asynchronous spectrum.

two-dimensional fluorescence correlation spectroscopy; anthracene; pyrene; ethanol

天津市自然科學基金(14JCYBJC30400)，天津市教委科技發(fā)展基金(20140621)和國家自然科學青年基金(No.31201359)資助

孫雪杉，1992年生，碩士，研究方向：光譜檢測技術(shù)及其應用，E-mail: 953170743@qq.com。

楊仁杰，1978年生，副教授，研究方向：光譜檢測技術(shù)及其應用，E-mail: rjyang1978@163.com。

10.3936/j.issn.1001-232x.2016.05.007

2015-11-09