馮曉青　汪　怡　王　芹　王　露　宋　鑫　徐　瑞　杭學(xué)宇

(淮安市疾病預(yù)防控制中心，淮安 223001)

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儀器應(yīng)用

凝膠滲透色譜-高效液相色譜法測定食用菌中呋喃丹農(nóng)藥殘留

馮曉青汪怡王芹王露宋鑫徐瑞杭學(xué)宇*

(淮安市疾病預(yù)防控制中心，淮安 223001)

建立了凝膠滲透色譜凈化高效液相色譜法檢測食用菌類中呋喃丹農(nóng)藥殘留量的方法。 樣品經(jīng)乙腈提取，氮?dú)獯蹈?，環(huán)己烷-乙酸乙酯(1∶1，V/V)溶液溶解后，凝膠滲透色譜進(jìn)行凈化，C18反相高效液相色譜柱分離后，采用液相色譜熒光檢測器進(jìn)行測定，外標(biāo)法定量。 呋喃丹在0.2～5.0 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r大于0.999，測定低限為0.01 mg/kg。對空白食用菌樣品進(jìn)行3個濃度水平0.5、1.0和2.0 mg/kg的加標(biāo)回收試驗(yàn)，呋喃丹的加標(biāo)回收率為78.3%～97.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.26%～11.69%。 本實(shí)驗(yàn)所建立的方法簡單, 靈敏度高，適用于食用菌樣品中的呋喃丹農(nóng)藥殘留的分析檢測。

高效液相色譜食用菌呋喃丹凝膠滲透色譜

1　引　言

呋哺丹屬于氨基甲酸酯類農(nóng)藥( carbamates，NMCs)，是一類應(yīng)用廣泛的殺蟲、殺螨、除草劑，由于其具有高效、殘留期短的優(yōu)點(diǎn)，在食用菌種植中廣泛應(yīng)用[1]。目前國內(nèi)外對該類農(nóng)藥殘留有很嚴(yán)格的要求，食用菌中最低為0.1 mg/kg[2]。因此，建立食用菌中快速、準(zhǔn)確、簡便、靈敏度高的呋喃丹殘留檢測方法十分必要。

在氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留分析中，樣品凈化有GPC(gel permeation chromatography)凈化[3-6]、SPE(Solid Phase extraction)凈化[7-11]及傳統(tǒng)的液-液分配[12-14]和柱層析法[15]。GPC凈化具有結(jié)果重現(xiàn)性好、凈化效率高等優(yōu)點(diǎn)，為提高工作效率，節(jié)省人力，目前越來越多的檢測機(jī)構(gòu)選擇采用GPC凈化等新型凈化方式取代傳統(tǒng)的液-液分配和柱層析法。但目前各標(biāo)準(zhǔn)中的GPC凈化均為離線GPC，即在樣品萃取后，需要實(shí)驗(yàn)人員手動轉(zhuǎn)移，凈化、濃縮等一系列操作后，轉(zhuǎn)移至GC/MS進(jìn)行分析。采用全自動凝膠凈化色譜及濃縮聯(lián)用系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn) GPC和濃縮同時進(jìn)行，自動化操作，簡化操作步驟，避免有機(jī)污染[16]。

本實(shí)驗(yàn)選擇8種有代表性的蔬菜為研究基質(zhì)，建立了GPC凈化、高效液相色譜(HPLC)檢測的測定方法，方法簡便快速、凈化效果好，可滿足食用菌中呋喃丹殘留的檢測要求。

2　 材料與方法

2.1儀器與試劑

HPLC-1260液相色譜儀(美國安捷倫公司)配熒光檢測器(G1321B)；全自動凝膠凈化色譜及濃縮聯(lián)用系統(tǒng)(美國J2 Scientific公司)；氮吹儀(英國TECHENE公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國Heidolph公司)； 渦旋混勻器(美國Scientific Industries公司)；食品粉碎機(jī)(中國歐科電器公司)。

呋喃丹標(biāo)準(zhǔn)溶液：100μg/mL，購自農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所。

乙腈、甲醇(色譜純, Merck公司)；環(huán)己烷、乙酸乙酯(分析純，國藥集團(tuán))；無水硫酸鈉(分析純，上海久億化學(xué)試劑有限公司)；0.22 μm有機(jī)系濾膜(天津東康科技有限公司)；實(shí)驗(yàn)室用水為Millipore超純水。

2.2試驗(yàn)方法2.2.1溶液配制

呋喃丹標(biāo)準(zhǔn)溶液配制: 準(zhǔn)確移取100 μL的呋喃丹農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇做溶劑，配制成10μg/mL儲備液， -20 ℃保存。使用時根據(jù)呋喃丹對應(yīng)響應(yīng)值，吸取適量儲備液，用甲醇配制成濃度為0.2 ng/mL、0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、2.0 ng/mL、5.0 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，供高效液相色譜測定。

乙酸乙酯-環(huán)己烷(1∶1，V/V)：取500 mL乙酸乙酯，加入環(huán)己烷500 mL混勻。

2.2.2樣品處理

①試樣制備

采集有代表性的8種食用菌樣品，取可食部分，經(jīng)縮分后，切碎，充分混勻后放入食品粉碎機(jī)粉碎，制成待測樣品。分裝后置于-20 ℃下保存，待提取。

②提取

稱取25.00 g(精確到0.01 g)粉碎的食用菌樣品，加入50 mL乙腈，高速勻漿2 min后用濾紙過濾。濾液收集到裝有5～7 g氯化鈉的具塞量筒中，收集濾液40～50 mL，蓋上塞子。劇烈振蕩l min，在室溫下靜置10 min，使乙腈相和水相分層。吸取10mL乙腈溶液在80℃水浴中氮吹干。加10 mL已配好的乙酸乙酯-環(huán)己烷(50+50)溶解殘?jiān)?jīng)無水硫酸鈉脫水，待GPC凈化。

③凈化

GPC凈化條件：流動相乙酸乙酯-環(huán)己烷(50+50，V/V)，流速為4.6 mL/min，選擇性收集10～20 min流出液，經(jīng)GPC在線濃縮，最后用2.0 mL甲醇-水(體積比5∶5)溶解殘?jiān)?，收集至進(jìn)樣瓶，過0.22 μm有機(jī)濾膜，待測。

2.2.3色譜參考條件

色譜柱：C18(安捷倫，4.6 mm×25 cm，5μm)； C18預(yù)柱(4.6 mm×4.5 cm)。柱溫：35℃。激發(fā)波長285 nm；發(fā)射波長320 nm。流動相：甲醇-水(1∶1，V/V)。

3　結(jié)果與分析

3.1色譜條件優(yōu)化3.1.1流動相的選擇

有實(shí)驗(yàn)研究采用乙腈-水作為流動相，但乙腈毒性較高，對色譜柱損傷大。本實(shí)驗(yàn)以甲醇-水為流動相，以甲醇與水混合溶液的體積比(分別為30∶70、40∶60、50∶50)為條件進(jìn)行測試，甲醇比例較低時，保留時間延長，峰面積減小，結(jié)果表明甲醇-水體積比為50∶50時，樣品的出峰時間、峰形、靈敏度較適宜，與文獻(xiàn)報道一致。呋喃丹標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖1。

圖1　呋喃丹標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖

3.1.2檢測波長選擇

取呋喃丹標(biāo)準(zhǔn)使用液在2.2.3條件下進(jìn)樣，在波長200～900范圍內(nèi)對呋喃丹進(jìn)行多發(fā)射和多激發(fā)掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)呋喃丹在激發(fā)波長320 nm和發(fā)射波長為285 nm處最強(qiáng)。故方法選定320 nm為發(fā)射波長，285 nm為激發(fā)波長。

3.1.3柱溫的選擇

研究中固定其他色譜條件，將色譜柱溫度從20 ℃升至40 ℃，結(jié)果顯示呋喃丹保留時間逐漸提前，為有效確保柱效及色譜柱使用壽命，方法采取柱溫35 ℃。

3.2GPC條件優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)研究應(yīng)用GPC作為無損的半自動凈化方法，選用Bio-Beads S-X3(300 mm×10 mm)作為填料。選用體積比為1∶1的乙酸乙酯-環(huán)己烷為流動相，設(shè)定流速為4.6 mL/min，分段采集。實(shí)驗(yàn)中，為確定呋喃丹收集步驟，采用加標(biāo)樣品通過GPC紫外檢測器，紫外掃描數(shù)據(jù)顯示目標(biāo)化合物集中在9 min至13 min，故收集此段時間內(nèi)提取液(圖2)。

圖2　呋喃丹GPC洗脫色譜圖

實(shí)驗(yàn)中采用草菇樣品加標(biāo)樣品經(jīng)GPC凈化，檢測結(jié)果顯示，經(jīng)GPC凈化后雜質(zhì)干擾成分明顯減少，目標(biāo)化合物檢測靈敏度提高，同樣其他食用菌樣品也能得到較好的凈化效果。以草菇為例，見圖3、圖4。

3.3線性關(guān)系及檢測限

呋喃丹標(biāo)準(zhǔn)工作液系列，按方法的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)樣，以所得峰面積A對濃度C(μg/mL)進(jìn)行回歸分析，結(jié)果表明在0.2～5.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度范圍內(nèi)，呋喃丹濃度與響應(yīng)值有良好的線性關(guān)系(圖4)，其回歸方程為：Y=6.179X-0.2884；相關(guān)系數(shù)r=0.9993。根據(jù)色譜響應(yīng)值S/N≥3標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算，呋喃丹最低檢出濃度為0.01 mg/kg。

圖3　草菇呋喃丹色譜圖a.未經(jīng)GPC凈化草菇呋喃丹加標(biāo)色譜圖；b.經(jīng)GPC凈化草菇呋喃丹加標(biāo)色譜圖

圖4　呋喃丹標(biāo)準(zhǔn)工作曲線圖

3.4精密度實(shí)驗(yàn)

以呋喃丹標(biāo)準(zhǔn)溶液5.0 μg/mL，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10 μL，測得呋喃丹平均峰面積為30.96，RSD為0.108% 。

3.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

以標(biāo)準(zhǔn)溶液5.0 μg/mL，每隔2 h 進(jìn)樣，每次10 μL，測得呋喃丹平均峰面積為30.81，RSD為0.131%。結(jié)果表明：供試品溶液在12 h內(nèi)所測得的結(jié)果基本一致。

3.6重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一加標(biāo)食用菌樣品6份，按2.2.2的方法制成供試溶液。在上述色譜條件下，測定呋喃丹平均含量為1.78 μg/kg，RSD為1.58%。

3.7方法回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取陰性樣品進(jìn)行低濃度的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1。該陰性樣品中加標(biāo)0.50、1.00、2.00 μg/kg，回收率在78.3%～97.6%之間，RSD在3.26%～11.69%之間。

表1　空白樣品中呋喃丹的添加回收率、精密度(n=3)

4　結(jié)論

采用全自動凝膠凈化色譜及濃縮聯(lián)用系統(tǒng)處理樣品，可以有效去除大部分色素及干擾物，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：本方法具有凈化效果好、檢測限低、操作簡單、實(shí)用等特點(diǎn)，有效避免有機(jī)污染，可用于市場常見食用菌的呋喃丹農(nóng)藥殘留量的測定研究，適用于基層單位開展呋喃丹的監(jiān)測分析，具有廣泛的應(yīng)用前景。

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Determination of carbofuran in mushrooms by gel permeation chromatography-high performance liquid chromatography.

Feng Xiaoqing, Wang Yi, Wang Qin, Wang Lu, Song Xin, Xu Rui, Hang Xueyu

*(Huai’anCenterforDiseaseControlandPrevention,Huaian223001,China)

The samples were first extracted with acetonitrile, then dried by nitrogen. The remaining residues were dissolved with ethyl acetate-cyclohexane mixture (50:50，V/V) and followed with a GPC cleanup.The identification of carbofuran was performed by HPLC with an external standard method. The results showed that the correlation coefficients (r) of carbofuran were greater than 0.999 in the concentration range of 0.2-5.0 ng/mL. The limits of quantitation (LOQ) were 0.01 mg/kg. It was found that the average recoveries ranged from 78.3% to 97.6%, and the relative standard deviations (RSD) were in the range of 3.26% to 11.69% at three spiked levels 0.5, 1.0 and 2.0 mg/kg. The established method is sensitive and simple, and suitable for the determination of carbofuran in mushrooms.

high performance liquid chromatography; mushrooms; carbofuran; gel permeation chromatography

馮曉青，碩士，技師，主要從事食品分析工作，Email:fengxiaoqing-20@163.com。

杭學(xué)宇, 副主任技師, 主要研究方向?yàn)槔砘瘷z驗(yàn)，E-mail:664686545@qq.com。

10.3936/j.issn.1001-232x.2016.05.002

2016-04-08