萬 娟，張 莉，張冰洋，武 力，周 盟

（1.中南民族大學(xué) 檢測與儀器校級工程中心，武漢 430074；2.中南民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，武漢 430074；3.中南民族大學(xué) 實驗教學(xué)與實驗室管理中心，武漢 430074）

檢測與監(jiān)控

基于TMCM-6110和LabVIEW的全自動酶聯(lián)免疫前處理儀的設(shè)計

萬 娟1，張 莉2，張冰洋3，武 力2，周 盟1

（1.中南民族大學(xué) 檢測與儀器校級工程中心，武漢 430074；2.中南民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，武漢 430074；3.中南民族大學(xué) 實驗教學(xué)與實驗室管理中心，武漢 430074）

依據(jù)酶聯(lián)免疫法工藝，我們設(shè)計了一款基于TMCM-6110和LabVIEW的全自動酶聯(lián)免疫前處理儀。采用SolidWorks三維軟件對儀器機(jī)械結(jié)構(gòu)進(jìn)行設(shè)計；自動控制部分以TMCM-6110為主控板控制步進(jìn)電機(jī)、隔膜泵、蠕動泵和加熱片等執(zhí)行單元；儀器操作界面采用LabVIEW開發(fā)，具有操作工序錄入、工作狀態(tài)監(jiān)控、可供用戶自定義樣品處理流程等功能。該儀器實現(xiàn)了酶聯(lián)免疫法檢測的實驗室全自動化，具有機(jī)箱體積小、運行速度快、移液精度高、操作界面友好等特點，完全滿足中小型實驗室及社區(qū)醫(yī)院的樣本檢測需求，具有良好的市場前景。

樣品前處理；酶聯(lián)免疫法；SolidWorks；TMCM-6110；LabVIEW

0　引言

酶聯(lián)免疫測定法（ELISA）相較于高效液相色譜法（HPLC）、薄層色譜法（TLC）、液相色譜質(zhì)譜串聯(lián)分析技術(shù)（LC-MS/MS）等檢測方法而言，具有靈敏度高、反應(yīng)時間短、特異性強(qiáng)、樣品量小、污染小、回收率高、重現(xiàn)性好等特點，能有效的測定酶和抗體活性、結(jié)合物中酶含量和免疫球蛋白含量、酶與免疫球蛋白摩爾比值以及結(jié)合率［1］。

酶聯(lián)免疫測定法（ELISA）現(xiàn)已成功地廣泛應(yīng)用于生物分析、檢驗檢疫、醫(yī)學(xué)分析領(lǐng)域，尤其在體液檢測領(lǐng)域中發(fā)揮重要作用。目前，國內(nèi)大多數(shù)中小型分析檢測實驗室和縣區(qū)級醫(yī)院主要采用手工操作來完成酶聯(lián)免疫測定法實驗，費時費力，效率低，且難以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性；少數(shù)機(jī)構(gòu)采用自動化的酶聯(lián)免疫分析儀，多為進(jìn)口儀器，價格昂貴，體積龐大，能耗高，全英文操作界面過于復(fù)雜，不易操作。而“十三五”規(guī)劃綱要指出，深化醫(yī)藥衛(wèi)生體制改革，實行分級診療，讓優(yōu)質(zhì)醫(yī)療設(shè)備進(jìn)入縣區(qū)級醫(yī)院，提高基層醫(yī)療服務(wù)水平，降低醫(yī)療費用，從而中小型醫(yī)院對酶聯(lián)免疫前處理儀這類檢測分析儀器的需求將大幅提高。這類醫(yī)院進(jìn)行體液檢測時，要求分析檢測儀器移液精度高，能耗低，中文操作界面易用性強(qiáng)。

針對這樣的市場需求，我們集酶聯(lián)免疫分析技術(shù)、機(jī)械設(shè)計、光電傳感、步進(jìn)電機(jī)控制、軟件技術(shù)于一體，設(shè)計了一款體積小，精度高，可靈活選擇板孔，中文操作界面簡單人性化的全自動酶聯(lián)免疫前處理儀，實現(xiàn)了酶聯(lián)免疫前處理的自動化，提高分析檢測實驗室的檢測效率和檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，同時，價格適中，具有良好的市場前景。

1　基本原理

酶聯(lián)免疫法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA），是一種在免疫酶技術(shù)基礎(chǔ)上，發(fā)展起來的一種新型的免疫測定的方法，用于檢測體液中的微量物質(zhì)。該方法將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除，最后通過酶作用于底物后顯色來判斷結(jié)果［2］。在體液檢測中，雙抗體夾心法是檢測血液中抗原含量的最為常用的方法，也是課題組研制儀器運行方案的主要依據(jù)之一，如圖1所示，儀器運行方案主要有以下七個步驟：

1）加溶劑操作：使待檢抗原對應(yīng)的抗體與固相載體結(jié)合，合成固相抗體。

2）洗滌操作：反復(fù)洗滌，除去1）未結(jié)合的其他物質(zhì)。

3）加溶劑操作：加入待檢樣本，充分接觸反應(yīng)之后，樣本中的抗原與固相載體相結(jié)合，形成固相抗原復(fù)合物［3］。

4）洗滌操作：通過洗滌，除去3）未結(jié)合的其他物質(zhì)。

5）加溶劑操作：加入酶標(biāo)抗體，使之與固相抗原復(fù)合物中的抗原相結(jié)合。

6）洗滌操作：通過洗滌，除去5）未結(jié)合的其他物質(zhì)。

7）加溶劑操作：加入底物，與酶發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生有色化合物。根據(jù)顏色的深淺來判斷待檢標(biāo)本中抗原的量。

圖1　酶聯(lián)免疫法基本原理

2　系統(tǒng)總體設(shè)計

全自動酶聯(lián)免疫前處理儀主要由機(jī)械和電控兩部分構(gòu)成。機(jī)械部分主要由整體機(jī)架、X軸載動系統(tǒng)、Z軸載動系統(tǒng)、移液系統(tǒng)、振蕩部件及工作臺等零部件組成。課題組依據(jù)酶聯(lián)免疫法實驗的工作流程（加試劑、恒溫振蕩孵育、洗板）來完成儀器的整體布局，將工作臺分為四個工位，分別是槍頭盒、溶劑盒、廢槍頭盒、振蕩盒，機(jī)械結(jié)構(gòu)的設(shè)計由SolidWorks三維軟件完成。

儀器的電控部分由TMCM-6110主控板、步進(jìn)電機(jī)、電機(jī)驅(qū)動器、光電傳感器、數(shù)字溫度傳感器、加熱器、繼電器、隔膜泵、蠕動泵等部件組成。儀器工作時，控制系統(tǒng)驅(qū)動電機(jī)帶動相關(guān)部件，實現(xiàn)精準(zhǔn)定位，完成自動裝卸槍頭，定量吸、排試劑，吸、排洗滌液，定時恒溫振蕩等工序，從而完成選定的操作流程。其結(jié)構(gòu)框圖如圖2所示。

3　控制系統(tǒng)設(shè)計

3.1傳動控制系統(tǒng)的設(shè)計

全自動酶聯(lián)免疫前處理儀主要目的是完成特定抗體、固相載體、酶標(biāo)抗體、底物與樣品在特定溫度下振蕩孵育后，反應(yīng)生成有色產(chǎn)物的過程。這個過程主要依靠傳動系統(tǒng)對固定在機(jī)械臂上的8通道洗針、移液槍頭進(jìn)行精準(zhǔn)定位，確保儀器可以準(zhǔn)確地運動到槍頭盒、溶劑盒、酶標(biāo)板的上方，完成相關(guān)動作。此需求的主要原因有三方面：1）8通道移液器自動裝卸一次性標(biāo)準(zhǔn)槍頭，在上槍頭時，需要移液器對準(zhǔn)工作臺的槍頭盒工位（X軸位移誤差在0.1mm之內(nèi)移液器才能精準(zhǔn)牢固地裝載槍頭）；2）儀器在抽試劑時，槍頭必須對準(zhǔn)試劑盒工位，保證槍頭在試劑盒的正中間，插入一定的深度，才能確保吸液動作地正常完成；3）洗板時，洗針移動到96孔板的每一排，洗針精準(zhǔn)地插入相應(yīng)板孔，X、Y軸坐標(biāo)尤為關(guān)鍵?；诖?，傳動硬件控制系統(tǒng)主要選用Trinamic Motion Control GmbH制造的TMCM-6110主控板、雷塞57系列的兩相步進(jìn)電機(jī)、EE-SX672光電傳感器。

TMCM-6110的主控芯片為STM32，其集成6軸步進(jìn)電機(jī)控制和驅(qū)動于一體，每軸電機(jī)自帶一組左右限位輸入，6路數(shù)字量的輸出（1A），供電電壓為24V。其主要特點是，使用最新的Coolstep技術(shù)和stallguard丟步檢測技術(shù)，電機(jī)電流可隨電機(jī)的負(fù)載動態(tài)調(diào)節(jié)，在節(jié)能的情況下實現(xiàn)電機(jī)的大力矩輸出和高速運轉(zhuǎn)，防止因力矩不夠而產(chǎn)生的丟步。實驗證明，TMCM-6110主控板控制電機(jī)帶動傳動系統(tǒng)的定位精準(zhǔn)度完全能夠滿足儀器對定位系統(tǒng)的要求。

圖2　系統(tǒng)結(jié)構(gòu)框圖

雷塞57系列兩相步進(jìn)電機(jī)為一個執(zhí)行單位，其步距角為1.8℃，額定電流3A，電源電壓為12V～24V。采用了細(xì)分方式來解決步進(jìn)電機(jī)低頻振動大、噪音大的問題［4］，根據(jù)不同的電機(jī)載動情況，設(shè)置不同的細(xì)分參數(shù)［5］。TMCM-6110直接控制電機(jī)的運轉(zhuǎn)，電機(jī)驅(qū)動芯片TMC260每輸入一個脈沖，電機(jī)運行一個步距角，電機(jī)帶動負(fù)載運動，從而實現(xiàn)傳動系統(tǒng)的位置控制功能。電機(jī)驅(qū)動圖如圖3所示。

圖3　電機(jī)驅(qū)動圖

為實現(xiàn)傳動系統(tǒng)的精準(zhǔn)定位和零點設(shè)置功能，選用歐姆龍微型EE-SX672光電傳感器，安置于X軸、Z軸、移液器的零點位置。設(shè)置零點之后，便于對傳動系統(tǒng)設(shè)置固定的位置坐標(biāo)，利于相關(guān)部件的移位操作。EE-SX672的應(yīng)答頻率為1kHz的高速響應(yīng)，電源電壓為DC5～24V，采用NPN集電極開路輸出模式，常閉，負(fù)載電流在40mA～100mA，傳感距離為5mm。因電源存在沖擊電壓，在光電傳感器的電源正負(fù)極之間并聯(lián)一個齊納二極管吸收緩沖電壓。本系統(tǒng)采用開關(guān)電源24V電壓供電，主控板TMCM-6110有六路Reference switch connectors，其輸入電壓為+5V。為保證光電開關(guān)輸出信號穩(wěn)定，OUT端外接一個1kΩ的電阻上拉至+5V電壓端。位置檢測電路如圖4所示。

圖4　位置檢測電路

3.2移液控制系統(tǒng)的設(shè)計

酶聯(lián)免疫前處理儀研發(fā)的重點是8通道移液器的移液精度。經(jīng)過市場調(diào)研之后，本儀器的移液范圍設(shè)計在10～200μl。移液器由上槍頭部件、脫槍頭電機(jī)、移液電機(jī)、移液針管等組成，主要是靠TMCM-6110給移液電機(jī)發(fā)送脈沖信號帶動移液器的活塞運動，通過吸筒抽取定量的試劑。為控制移液器的運行速度及平穩(wěn)性，對移液電機(jī)的細(xì)分參數(shù)、最大加速度、最大位移速度進(jìn)行相應(yīng)的設(shè)置。脈沖數(shù)和試劑之間的公式為：

式中，X為脈沖數(shù)，V為試劑容量，K為絲桿單位長度位移對應(yīng)的脈沖數(shù)，r為活塞桿的內(nèi)半徑。

3.3溫度控制系統(tǒng)

在酶聯(lián)免疫法實驗過程中，酶標(biāo)抗體與樣本反應(yīng)、顯色反應(yīng)等都要求在一定溫度恒溫孵育振蕩。例如酶聯(lián)免疫法測乙肝病毒，樣本與酶標(biāo)抗體的反應(yīng)要求在37℃恒溫務(wù)件下振蕩完成。

在本儀器中，為避免模擬電路設(shè)計中的引線誤差補(bǔ)償、信號調(diào)理誤差等一系列問題，溫控模塊主要采用SRND-CM-DS18控制板控制加熱片和DS18B20溫度傳感器［6］，來實現(xiàn)孵育振蕩時的溫度控制功能［7］。SRNDCM-DS18控制板選用RS485與上位機(jī)通信，波特率設(shè)置為9600，4路AI端，4路繼電器，24V電源供壓。通過接受上位機(jī)發(fā)出的指令，反饋傳感器獲取的溫度值，控制指定繼電器的開關(guān)。SRND-CM-DS18控制板在本儀器中，主要負(fù)責(zé)溫度的讀取和控制加熱片，測溫范圍是-55℃～125℃，溫度精度±0.5℃，溫度分辨率為0.1℃。

圖5　下位機(jī)軟件結(jié)構(gòu)

4　軟件系統(tǒng)設(shè)計

系統(tǒng)軟件與硬件電路密切結(jié)合是實現(xiàn)儀器正確穩(wěn)定運行的必要務(wù)件。本儀器集機(jī)械自動化與計算機(jī)實時狀態(tài)監(jiān)控和數(shù)據(jù)存儲分析于一體，要求其下位機(jī)能夠穩(wěn)定準(zhǔn)確地執(zhí)行上位機(jī)發(fā)出的指令，上位機(jī)實時處理收發(fā)數(shù)據(jù)，顯示下位機(jī)的運行狀態(tài)?；诖?，課題組提出系統(tǒng)軟件設(shè)計方案，軟件系統(tǒng)分為上位機(jī)軟件系統(tǒng)和下位機(jī)軟件系統(tǒng)。

4.1下位機(jī)軟件系統(tǒng)設(shè)計

在主控板TMCM-6110上運行的軟件即為下位機(jī)軟件，在其對應(yīng)的開發(fā)平臺上采用TMCL語言開發(fā)。下位機(jī)軟件的主體設(shè)計思想主要是總分思想，按功能分為五大模塊：

1）參數(shù)設(shè)定：依據(jù)每個電機(jī)負(fù)載情況及運行速度要求，設(shè)定每個電機(jī)的細(xì)分參數(shù)、最大位移速度、最大走位置速度等參數(shù)。

2）歸零：每次儀器上電，每個軸自動歸零點。保證儀器每次開機(jī)在初始狀態(tài)。

3）溶劑操作：首先，移液器運行到槍頭盒工位上方，裝載指定槍頭；移動到溶劑盒工位上方，抽取指定溶劑；移動到酶標(biāo)板上方，排放溶劑；移動到脫槍頭工位，卸掉槍頭。

4）振蕩孵育：實時獲取溫度，當(dāng)實際溫度在設(shè)定值時，開始振蕩，小于設(shè)定值時，啟動加熱片加熱。

5）洗板：通過控制隔膜泵和蠕動泵，清洗酶標(biāo)板的指定排。

其下位機(jī)軟件結(jié)構(gòu)如圖5所示。

4.2上位機(jī)軟件系統(tǒng)設(shè)計

在PC機(jī)上運行的軟件即為上位機(jī)軟件，基于LabVIEW圖形化編程開發(fā)平臺，采用485串口通信的方式設(shè)計出人性化的人機(jī)交互界面。

上位機(jī)軟件主要實現(xiàn)以下三大功能：1）串口通信功能：依據(jù)485通信協(xié)議經(jīng)由USB轉(zhuǎn)485串口線與下位機(jī)進(jìn)行通信，依據(jù)選定流程發(fā)出相應(yīng)指令，控制TMCM-6110和溫控模塊，使各部件完成相應(yīng)動作。2）人機(jī)界面友好交互功能：用戶可依據(jù)自身實驗要求，來自主設(shè)定試劑編號、試劑體積、振蕩時間、振蕩溫度、洗板次數(shù)和動作先后順序，實時顯示下位機(jī)的運行狀態(tài)。3）數(shù)據(jù)處理存儲功能：上位機(jī)軟件分析處理存儲用戶設(shè)定的參數(shù)，以及從下位機(jī)接收的數(shù)據(jù)。

上位機(jī)軟件設(shè)計主要由以下六大模塊組成：1）板孔設(shè)置：用戶選定96孔酶標(biāo)板來添加溶劑，逐行選定，避免整板添加浪費時間和材料。2）參數(shù)設(shè)置：分為試劑設(shè)置、振蕩孵育設(shè)置、洗板設(shè)置。試劑設(shè)置主要是選定試劑編號和試劑體積，試劑編號一共有六種，分別對應(yīng)下位機(jī)工作臺試劑盒工位上的六個試劑位置，體積單位為微升；振蕩孵育設(shè)置是選定振蕩時間和溫度；洗板設(shè)置是選定洗板次數(shù)。3）處理流程設(shè)置：將用戶設(shè)定的參數(shù)反映到表格中，便于直觀的反應(yīng)用戶選定的實驗流程。同時，具備上移、下移、刪除、清空、保存、執(zhí)行等功能鍵，便于用戶更改保存實驗流程。在下位機(jī)運行時，會以深色選中框來顯示正在執(zhí)行的流程。4）處理流程存儲：將處理流程設(shè)置模塊中的流程編號、命名、存儲。5）串口通信、流程執(zhí)行模塊：采用485串口通信的方式，選擇串口，與下位機(jī)連接通信，收發(fā)指令；流程執(zhí)行按鈕控制實驗的開始、結(jié)束。6）下位機(jī)狀態(tài)監(jiān)測：通過文字窗口，實時顯示下位機(jī)正在執(zhí)行的操作。其上位機(jī)軟件框圖如圖6所示。

圖6　上位機(jī)軟件框圖

5　儀器性能分析

全自動酶聯(lián)免疫前處理儀（1臺）經(jīng)檢測，其安全性能指標(biāo)都符合業(yè)界標(biāo)準(zhǔn)。采用稱重法對儀器的重復(fù)性精度、線性精度、工作相對穩(wěn)定性和通道均一性進(jìn)行了測試。

表1　測試數(shù)據(jù)

樣品為純水，室溫23℃，選30、60、90、120、150μl（儀器的取樣范圍在30～160μl）五組，每組加十個樣品，加樣后在精密天平上稱重，再換算成容積。測量數(shù)據(jù)如表1所示。

1）重復(fù)性精度

這里取純水的密度為1g/mL，由表1易得出每組的平均移液量、標(biāo)準(zhǔn)方差σ、重復(fù)性精度CV、絕對誤差、相對誤差。數(shù)據(jù)處理結(jié)果如表2所示。

由表2可知，儀器移液的重復(fù)性精度最大為3.02%，最小為0.49%；移液相對誤差為2μl，絕對誤差在6.7%～1.3%；目標(biāo)移液量越大，CV值越小，重復(fù)性精度越高，相對誤差越小，準(zhǔn)確度越高。重復(fù)性精度在5%以下，相對誤差在7%以下，符合酶聯(lián)免疫法實驗的要求。

表2　重復(fù)性精度測試結(jié)果

2）線性精度

由圖7可知，移液量的線性方程為y=30.2x-1.16。式中，y為實際移液容積，x為目標(biāo)移液容積。圖7說明，實際移液容積量具有線性相關(guān)性。

圖7　移液線性精度曲線圖

3）均一性

圖8為移液量為130μl和65μl的情況下，儀器自動上槍頭吸取純凈水所得的均一性曲線。由圖可知，在130μl時，儀器的移液相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.3829；在65μl時，儀器的移液相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.2476。8通道移液槍的均一性較好，符合酶聯(lián)免疫法實驗的要求。

儀器的各項性能指標(biāo)如下：

（1）加熱范圍：室溫～100℃；

（2）處理試劑容量：30～160μl；

（3）加熱模塊溫度均勻度：±1℃；

（4）移液重復(fù)性精度：±4%；

（5）移液相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）：0.2476。

（6）移液均一性：±3μl；

圖8　通道移液均一性曲線圖

6　結(jié)束語

我們設(shè)計的全自動酶聯(lián)免疫前處理儀，上位機(jī)中文操作界面友好，可操作性強(qiáng)，可實時顯示下位機(jī)的運行狀態(tài)；實現(xiàn)高通量、高效率、無污染的樣品前處理。實驗結(jié)果表明，該儀器能夠達(dá)到酶聯(lián)免疫法體液檢測實驗的各項性能要求，移液精度高，耗時短，運行穩(wěn)定，安全可靠。儀器整體體積小，價位適中，工位劃分細(xì)致，便于維修，適用于中小型實驗室和縣區(qū)級醫(yī)院，具有良好的市場前景。

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The design of fully automatic ELISA pretreatment instrument based on TMCM-6110 and LabVIEW

WAN Juan1， ZHANG Li2， ZHANG Bing-yang3， WU Li2， ZHOU Meng1

TP29

B

1009-0134（2016）10-0001-06

2016-05-26

國家自然科學(xué)基金資助項目（81101080）

萬娟（1992 -），女，湖北人，碩士研究生，研究方向為醫(yī)療儀器設(shè)備的研發(fā)與設(shè)計。