黎　曉，曾雪亮， 黃志華，劉瑞珍，葛程焜，肖　海

(1.贛南醫(yī)學(xué)院；2.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，江西　贛州　341000)

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DSS調(diào)節(jié)內(nèi)脂素防治去卵巢大鼠骨基質(zhì)丟失的研究*

黎曉1，曾雪亮2， 黃志華1，劉瑞珍1，葛程焜1，肖海1

(1.贛南醫(yī)學(xué)院；2.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，江西贛州341000)

目的:探討 3'-大豆苷元磺酸鈉(3 '-daidzein sulfonate sodium, DSS)調(diào)節(jié)內(nèi)脂素防治去卵巢大鼠骨基質(zhì)丟失的作用。方法：選擇清潔級SD雌性大鼠60只，體重160～220 g，隨機(jī)分成5組:①假手術(shù)組(正常對照組)，②卵巢切除組(模型組)，③卵巢切除+戊酸雌二醇組(陽性藥物對照組)，④卵巢切除+DSS高劑量組(100 μg·kg-1)，⑤卵巢切除+DSS低劑量組(30 μg·kg-1)。術(shù)后1周連續(xù)陰道涂片檢查10天后，①②組大鼠每天灌胃同體積生理鹽水；③組大鼠每天一次戊酸雌二醇片劑水溶懸液灌胃，劑量為80 mg·kg-1；④⑤組分別以高、低劑量的DSS溶液灌胃，1次·d-1。連續(xù)給藥8周。大鼠禁食12 h，麻醉后腹主動脈取血并分離血清，嚴(yán)格按照試劑盒說明，用ELISA方法檢測血清中內(nèi)脂素(Visfatin)的含量，化學(xué)比色法測定血清中STrACP含量。另取實(shí)驗(yàn)大鼠右股骨，以濃硝酸消化后火焰原子吸收光譜法檢測骨鈣、骨鎂濃度。結(jié)果：與模型組比較，DSS可升高骨鈣、骨鎂濃度，降低血清內(nèi)Visfatin及STrACP含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：DSS可能通過調(diào)節(jié)內(nèi)脂素預(yù)防大鼠去卵巢后因雌激素缺乏所致的骨基質(zhì)丟失，其作用機(jī)制可能通過調(diào)節(jié)內(nèi)脂素的聯(lián)動效應(yīng)達(dá)到維持大鼠骨代謝平衡。

3'-大豆苷元磺酸鈉；內(nèi)脂素；絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥

隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展、人們生活方式的改變以及人口老齡化的出現(xiàn)，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率逐年上升，圍絕經(jīng)期婦女因容易出現(xiàn)程度不同的低雌激素血癥而表現(xiàn)突出[1-2]。大豆苷元(daidzein,DD)是大豆異黃酮的一種，具有類雌激素樣作用。很多研究證實(shí)大豆苷元能夠促進(jìn)骨代謝，抑制骨轉(zhuǎn)化[3-5]，防止大鼠牙周骨骨質(zhì)丟失[6]，然而卻因難溶于水在臨床應(yīng)用中受到限制。因此，本課題組與沈陽藥科大學(xué)合作，對大豆苷元進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾和改性后得到了新的強(qiáng)水溶性物質(zhì)，即3'-大豆苷元磺酸鈉(3'-daidzein sulfonate sodium,DSS)，化學(xué)式為:C15H9O7SNa。DSS是強(qiáng)酸強(qiáng)堿水溶性鹽，具有生物利用度高、服用量較小、顯效快等優(yōu)點(diǎn)。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，DSS對去卵巢大鼠的骨代謝與脂代謝均有一定調(diào)節(jié)作用[7-8]，本研究擬進(jìn)一步探討DSS是否可以防治去卵巢大鼠骨基質(zhì)主要成分鈣與鎂的丟失，并初步研究其防治機(jī)制是否與調(diào)節(jié)內(nèi)脂素的聯(lián)動效應(yīng)有關(guān)，進(jìn)而維系骨健康。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)藥物3'-大豆苷元磺酸鈉由沈陽藥科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院植化教研室提供，實(shí)驗(yàn)前用超純水溶解成300 μg·kg-1的混懸液，按實(shí)驗(yàn)需要用雙蒸水稀釋至所需濃度。

1.2試劑抗酒石酸酸性磷酸酶(Startrate resistant acid phosphatase),STrACP試劑盒購自南京建成生物工程研究所，Visfatin ELISA試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，戊酸雌二醇由拜耳公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號030A。

1.3儀器日立7060全自動生化分析儀，賽多利斯BS224S型電子天平(北京賽多利斯儀器有限公司)，XB100KS型制冰機(jī)(寧波格蘭特制冷設(shè)備制造有限公司)，MDF-U4186S超低溫冰箱(日本三洋)，MK3型酶標(biāo)儀(美國Thermo)，TAS-990原子吸收分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)。

1.4動物SD大鼠購自江西中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，體重160～220 g，雌性(動物中心許可證號：2007-0001，動物合格證號：JZDW2007-076，級別：清潔級)，每日均給予普通全價飼料喂養(yǎng)，飲水為自來水，自由飲食。

1.5方法

1.5.1卵巢切除術(shù)(1)手術(shù)前，大鼠禁食24 h，飲水不限。用10%水合氯醛(0.35 mL·100 g-1)腹腔注射麻醉后，將大鼠固定，剪去腹部毛，外科常規(guī)消毒，在恥骨聯(lián)合上1 cm處正中切開皮膚、筋膜和腹膜，打開腹腔，切口大約1 cm，在視野中可見一乳白色發(fā)亮的脂肪團(tuán)，將脂肪團(tuán)拉出，在其末端可見一簇囊泡狀的粉紅色組織即為卵巢，剪取時，先將卵巢下輸卵管(包括脂肪)用絲線結(jié)扎，再摘除卵巢，術(shù)后順勢將子宮角送回腹腔中。同法摘除另一側(cè)卵巢，待卵巢摘除完全后，關(guān)閉腹腔，并消毒置于干凈的大鼠鼠籠里。(2)假性卵巢切除術(shù):方法同(1)。但不同的是:找到卵巢后并不切除，而將其拉到切口外暴露后，然后重新放回腹腔內(nèi)。

1.5.2實(shí)驗(yàn)分組健康SD雌性大鼠60只，體重160～220 g，隨機(jī)分成5組:①假手術(shù)組(正常對照組)、②卵巢切除組(模型組)、③卵巢切除+戊酸雌二醇(陽性藥物對照組)、④卵巢切除+DSS高劑量組、⑤卵巢切除+DSS低劑量組。術(shù)后1周連續(xù)陰道涂片檢查10天后，①②組大鼠每天同體積生理鹽水灌胃；③組大鼠戊酸雌二醇片劑水溶懸液灌胃，劑量為80 mg·kg-1·d-1，其余時間每天同體積生理鹽水灌胃；④⑤組分別以高、低劑量的DSS溶液灌胃，1 次·d-1。連續(xù)給藥8周，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

1.5.3各指標(biāo)的檢測

1.5.3.1DSS對去卵巢大鼠血清中STrACP含量的影響大鼠麻醉后腹主動脈取血，3 500 r·min-1，離心10 min，分離血清，化學(xué)比色法測定血清中STrACP的含量。

1.5.3.2DSS對去卵巢大鼠血清中Visfatin水平的影響以上方法分離血清后用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測血清中Visfatin水平。

1.5.3.3DSS對去卵巢大鼠股骨中鈣、鎂含量的影響大鼠采血完畢取右側(cè)股骨，剔除表面結(jié)締組織，電子天平稱重后用濃硝酸充分消化，經(jīng)火焰原子吸收光譜法檢測股骨鈣、鎂的濃度。

2　結(jié)　果

2.1DSS對去卵巢大鼠股骨中鈣、鎂含量的影響與模型組比較，DSS可明顯升高股骨中鈣、鎂含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示DSS可有效對抗大鼠去卵巢后因雌激素缺乏所致的骨基質(zhì)丟失(見圖1，2)。

2.2DSS對去卵巢大鼠血清中STrACP濃度的影響結(jié)果顯示，與模型組比較，DSS可明顯降低血清中STrACP含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示DSS可能通過調(diào)節(jié)STrACP活性發(fā)揮對骨吸收與骨形成的調(diào)節(jié)作用，從而維持骨代謝平衡(見圖3)。

2.3DSS對去卵巢大鼠血清內(nèi)脂素(Visfatin)水平的影響ELISA方法檢測血清中脂聯(lián)素(Visfatin)濃度，結(jié)果表明，與模型組比較，各給藥組Visfatin濃度均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明DSS能調(diào)節(jié)Visfatin濃度對抗大鼠因雌激素缺乏引起脂肪因子分泌異常所致的代謝異常(見圖4)。

圖1骨鈣含量

圖2　骨鎂含量

圖3血清中STrACP含量

圖4　血清中內(nèi)脂素的含量

3　討　論

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(Postmenopausal Osteoporosis，PMOP)是指絕經(jīng)后婦女由于卵巢功能低下，雌激素明顯減少，出現(xiàn)骨偶聯(lián)過程失衡，即骨吸收作用超過了骨形成作用，導(dǎo)致凈骨量減少，骨強(qiáng)度降低，骨脆性增加，易于發(fā)生骨折的代謝性骨疾病。

臨床發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松癥與骨量減少患者常合并有脂代謝障礙，且骨質(zhì)疏松癥經(jīng)治療改善后，脂代謝障礙也往往得以逆轉(zhuǎn)，提示脂代謝可能與PMOP的發(fā)病存在一定關(guān)系。近年研究發(fā)現(xiàn)[9]，脂肪組織是重要的內(nèi)分泌器官，可分泌包括脂聯(lián)素、內(nèi)脂素等多種細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子不僅參與了糖、脂代謝、胰島素敏感性、心血管功能等多種生理過程的調(diào)節(jié)，而且對骨代謝的調(diào)節(jié)也具有重要作用[10]。其中內(nèi)脂素是2005年發(fā)現(xiàn)的一種特異性表達(dá)于內(nèi)臟脂肪的脂肪因子，它可增加Ⅰ型膠原表達(dá)，提高成骨細(xì)胞分化與礦化，同時抑制破骨細(xì)胞產(chǎn)生，對骨代謝的調(diào)節(jié)具有積極影響。Li等[11]研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)脂素抑制劑FK866可降低骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的礦化，減少骨形成。Moschen等[12]研究還發(fā)現(xiàn)，內(nèi)脂素可抑制前體破骨細(xì)胞向抗酒石酸酸性磷酸酶陽性多核細(xì)胞分化，抑制破骨細(xì)胞生成。另有研究稱[13]，PMOP患者血清中內(nèi)脂素水平高于骨量減少患者，且骨密度值與血清內(nèi)脂素水平成負(fù)相關(guān)，而與骨吸收指標(biāo)STrACP成正相關(guān)，說明血清內(nèi)脂素水平異常表達(dá)可能具有加快骨吸收、影響骨代謝的作用，并由此影響PMOP的發(fā)病。

STrACP參與骨基質(zhì)中Ca、Mg、P礦化底物的降解及骨吸收窩陷的形成，由此被認(rèn)為其直接參與了破骨細(xì)胞骨吸收過程[14]。 由破骨細(xì)胞產(chǎn)生的STrACP可進(jìn)入血液循環(huán)，故檢測血清中STrACP的水平可以反映體內(nèi)破骨細(xì)胞活性和骨吸收狀態(tài)。而Ca和Mg是骨骼的主要構(gòu)成元素，骨代謝其實(shí)就是機(jī)體內(nèi)Ca、Mg和P的代謝，即骨組織不斷地將儲存的Ca、Mg和P釋放入血，使血Ca、Mg和P含量升高，同時又將血中Ca、Mg和P回存于骨骼中，以保證骨礦代謝的穩(wěn)態(tài)[15]。Ca、Mg和P的過度丟失和吸收不佳會致使骨代謝失調(diào)，引起骨質(zhì)疏松。

本實(shí)驗(yàn)采用去卵巢大鼠模型，模擬婦女絕經(jīng)后對藥物干預(yù)的反應(yīng)，結(jié)果表明，各DSS治療組大鼠血清內(nèi)Visfatin和STrACP水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明DSS能有效對抗去卵巢大鼠因雌激素降低引起的脂肪因子Visfatin的釋放，啟動一系列骨代謝與脂代謝的平衡調(diào)節(jié)效應(yīng)，并有效降低血清STrACP水平，抑制骨吸收的過度，促進(jìn)骨形成的正向趨勢；同時，DSS能有效穩(wěn)固去卵巢大鼠股骨中鈣和鎂的含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對于防止骨基質(zhì)丟失有積極作用。上述結(jié)果進(jìn)一步提示，DSS可能通過調(diào)節(jié)血清內(nèi)脂素水平，活化機(jī)體內(nèi)骨代謝與脂代謝的調(diào)節(jié)平衡體系，進(jìn)而降低血清內(nèi)STrACP水平，抑制骨吸收過程，促進(jìn)骨形成，達(dá)到骨代謝平衡狀態(tài)，減少因雌激素減少而致的骨質(zhì)疏松癥發(fā)生。并且，本實(shí)驗(yàn)干預(yù)藥物DSS為強(qiáng)水溶性的類雌激素物質(zhì)，生物利用度高，毒副作用小或無。與陽性藥物戊酸雌二醇對照組比較，DSS維持去卵巢大鼠股骨中鎂的含量以及降低血清中Visfatin水平的效果均更佳，其作為雌激素替代藥物的開發(fā)有一定實(shí)際意義。因此，本研究結(jié)果可能為探索防治骨質(zhì)疏松癥雌激素替代藥物的開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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DSS Sustains Bone Matrix of Ovariectomized Rats by Regulating Visfatin

LIXiao1,ZENGXue-liang2,HUANGZhi-hua1,LIURui-zhen1,GECheng-kun1,XIAOHai1

(1.GannanMedicalUniversity;2.TheFirstAffiliatedHospitalofGannanMedicalUniversity，GanzhouJiangxi341000)

Objective:To study the effect of 3 '-daidzein sulfonate sodium (DSS) on sustaining the bone matrix of ovariectomized rats. Methods: Sixty SD female rats with weight between 160～220 g were randomly divided into 5 groups: ①sham group (control group); ②ovariectomy group (model group); ③ovariectomy+estradiol valerate treatment group (positive control group); ④ovariectomy+high-dose DSS (100 μg·kg-1); ⑤ ovariectomy + low-dose DSS(30 μg·kg-1). Vaginal smear was examined consecutively for 10 days one week after surgery. ①②Group were gavaged with the same volume saline; ③group were gavaged with estradiol valerate solution (80 mg·kg-1) once per day;④⑤group were gavaged with high-and low-dose DSS solution once per day. All the rats were gavaged for 8 weeks and starved for 12 hours before anesthesia. Abdominal aortic blood was taken from anesthetized rats and serum was isolated to measure visfalin level using ELISA kit. The serum STrACP level was also assessed by chemical colorimetric method. The right femur was excised, and digested with concentrated nitric acid for bone calcium and magnesium measurement using the flame atom absorption method. Results:DSS treatment increased the level of bone calcium and magnesium, and reduced the concentration of visfatin and STrACP. The comparison between the model group and DSS treatment groups was statistically significant. Conclusion:DSS can regulate visfatin to prevent the loss of bone matrix caused by estrogen insufficiency post ovariectomy. A possible mechanism for this effect might rely on the coupling effect of visfatin regulation to maintain the osseous homeostasis．

3 '-daidzein sulfonate sodium; Visfatin; Postmenopausal osteoporosis

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No. 81560583)；江西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.20142BAB205021)；

黃志華，女，教授，博士，主要從事心腦血管方向研究。E-mail:18970786003@163.com

肖海，男，副教授，碩士，主要從事心腦血管方向研究。E-mail:xh669168@sina.com

R285.5

A

1001-5779(2016)03-0339-04

10.3969/j.issn.1001-5779.2016.03.002

2016-02-03)(責(zé)任編輯：敖慧斌)

江西省衛(wèi)計(jì)委科技項(xiàng)目(No.20092087)