鄧日強，程江濤，張宏華，楊印樓

(粵北人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣東　韶關(guān)　512026)

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大黃素對肺纖維化大鼠Th1/Th2型細胞因子平衡的影響

鄧日強，程江濤，張宏華，楊印樓

(粵北人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣東韶關(guān)512026)

目的:觀察大黃素對博萊霉素所致大鼠肺纖維化的影響，并探討其是否經(jīng)調(diào)整Th1/Th2型細胞因子平衡起作用。方法：將50只雄性SD大鼠隨機分為正常對照組、模型組、大黃素低劑量組、大黃素高劑量組和潑尼松組，每組10只，后4組經(jīng)氣管內(nèi)注入博萊霉素A5建立大鼠肺纖維化模型，從第2 天開始，大黃素低、高劑量干預(yù)組大鼠分別予20、80 mg·kg-1大黃素灌胃，潑尼松組以5 mg·kg-1醋酸潑尼松灌胃，其余2組予生理鹽水灌胃。建模后第28 天處死所有大鼠，取出肺組織行HE染色和Masson染色，用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測肺組織干擾素-γ(IFN-γ)、白介素-4(IL-4)含量，分離血清，ELISA測定血清IFN-γ、IL-4濃度。結(jié)果：大黃素低、高劑量組及潑尼松組肺泡炎癥及肺纖維化程度明顯輕于模型組(P<0.05 orP<0.01)。與正常對照組比較，模型組肺組織IFN-γ含量、血清IFN-γ濃度、IFN-γ/IL-4比值降低(P<0.01)，肺組織IL-4含量、血清IL-4濃度升高(P<0.01)；大黃素低、高劑量組及潑尼松組肺組織IFN-γ含量、血清IFN-γ濃度、IFN-γ/IL-4比值高于模型組(P<0.01)，而肺組織IL-4含量、血清IL-4濃度低于模型組(P<0.01)；大黃素高劑量組、潑尼松組上述指標(biāo)改善程度優(yōu)于大黃素低劑量組(P<0.01)，但大黃素高劑量組與潑尼松組比較，差異無顯著性(P>0.05)。結(jié)論：大黃素對博萊霉素所致的肺纖維化大鼠有保護作用，糾正Th1/Th2型細胞因子平衡失調(diào)可能是其抗肺纖維化的重要機制。

大黃素；肺纖維化；干擾素-γ；白介素-4

肺纖維化是由藥物、化學(xué)制劑、有機或無機粉塵、放射線等因素引起的肺間質(zhì)疾病的共同結(jié)局，以巨噬細胞、淋巴細胞等炎癥細胞在肺間質(zhì)浸潤、纖維母細胞增生及纖維結(jié)締組織沉積于肺間質(zhì)為特征，對人類健康危害極大，近年發(fā)病率呈上升趨勢，迄今尚無有效的治療方法[1]。Th 細胞主要分為Th1、Th2細胞兩大類型，其中Th1細胞產(chǎn)生干擾素-γ(interferon-γ, IFN-γ)、腫瘤壞死因子-β、白介素(interleukin, IL)-2、IL-12、IL-18等細胞因子，Th2細胞產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、單核細胞趨化蛋白-1等細胞因子。在生理狀況下，Th1、Th2型細胞因子處于一種平衡狀態(tài)，兩者相互影響、相互作用，共同調(diào)控機體的免疫應(yīng)答。近年來研究表明，當(dāng)Th2型細胞因子占優(yōu)勢時，即發(fā)生Th1/Th2型細胞因子失衡，可促進肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展[2-3]。大黃素是一種蒽醌類衍生物，主要來源于蓼科植物掌葉大黃根莖，化學(xué)名稱為1,3,8-三羥基-6-甲基蒽醌，系中藥大黃的主要有效單體，具有利尿、抗菌消炎、抗腫瘤、免疫抑制、保肝 、抗纖維化等多種藥理活性[4]。已有研究證實，大黃素通過抗炎和抗氧化應(yīng)激機制減輕博萊霉素所致的大鼠肺纖維化程度[5-6]。然而，大黃素的抗纖維化作用是否和調(diào)整Th1/Th2型細胞因子平衡有關(guān)仍不清楚。因此，本研究通過博萊霉素氣管內(nèi)注射建立SD大鼠肺纖維化模型，觀察大黃素對肺組織病理改變、IFN-γ與IL-4含量及血清IFN-γ、IL-4濃度的影響，旨在進一步闡明大黃素抗肺纖維化的機制。

1　材料與方法

1.1動物、藥品與試劑雄性SD大鼠50只，8～10周齡，體重為250～300 g，清潔級，由南華大學(xué)實驗動物學(xué)部提供，實驗動物使用許可證號：SYKK(湘)2010-0006，予常規(guī)顆粒飼料喂養(yǎng)，并自由飲水。博萊酶素A5(15 mg·支-1)購買于太和制藥有限公司，產(chǎn)品批號：070501，經(jīng)生理鹽水稀釋后配成濃度為7.5 g·L-1混懸液。大黃素由國家藥物和生物制品檢定研究所(NICPBP)提供，濃度>98%，溶解于二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)后制成3、12 g·L-1混懸液。醋酸潑尼松片購于天津太平洋制藥有限公司，產(chǎn)品批號：080201，用生理鹽水稀釋成0.75 g·L-1混懸液。DMSO系美國 Sigma公司產(chǎn)品。酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測試劑盒 (貨號：BYE10184、BYE10293)購自上海邦奕生物科技有限公司。

1.2肺纖維化模型制備與處理50只SD大鼠隨機分為正常對照組、模型組、大黃素低劑量組、大黃素高劑量組和潑尼松組，每組10只。按劉理靜等[5]的方法建立肺纖維化模型，即后4組大鼠通過腹腔注射10%水合氯醛(3 mL·kg-1)麻醉后，沿頸正中位置切開，暴露氣管，并向氣管內(nèi)一次性注入溶解了博萊霉素A5(5 mg·kg-1)的生理鹽水0.2 mL，然后將大鼠直立并旋轉(zhuǎn)，以使藥液在肺內(nèi)分布均勻。從次日開始，正常對照組、模型組予2 mL生理鹽水灌胃，大黃素低、高劑量組分別予20、80 mg·kg-1大黃素灌胃，潑尼松組以5 mg·kg-1醋酸潑尼松灌胃，均為1次·d-1，共27 d。建模后第28 d，待大鼠麻醉后無菌開胸，以心臟采血法采集大鼠血液3 mL，血液標(biāo)本靜置2 h，3 000 r·min-1離心10 min(離心半徑15 cm)，提取上層血清，置入-20 ℃冰箱保存，用于IFN-γ、IL-4濃度檢測，再頸動脈放血處死，截取右肺組織，迅速放入-70 ℃液氮中凍存，用于IFN-γ、IL-4含量檢測，然后經(jīng)主支氣管向左肺內(nèi)注入 0.1 mol·L-1中性緩和福爾馬林，使胸膜展開后置于0.1 mol·L-1中性福爾馬林中固定 24 h以上，石蠟包埋，切片，供 HE 染色及Masson 染色。

1.3肺組織病理學(xué)檢查左肺石蠟切片進行常規(guī)HE染色和Masson染色，光鏡下觀察肺組織病理學(xué)改變。參照 Szapiel等[7]的方法用HE染色評定肺組織肺泡炎癥程度：0分：無肺組織炎；1分：輕度肺組織炎，炎性細胞浸潤僅限于局部或近胸膜部，面積小于全肺的 20%；2分：中度肺組織炎，受累面積占全肺的 20%～50%；3分：重度肺組織炎，受累面積大于 50%。Masson染色評定肺組織纖維化程度：0分：無肺纖維化；1分：輕度肺纖維化，受累面積少于全肺 20%；2分：中度肺纖維化，受累面積占 20%～50%；3分：重度肺纖維化，受累面積大于 50%，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂。

1.4ELISA檢測肺組織IFN-γ、IL-4含量取部分右肺組織，用已經(jīng)滅菌且已預(yù)冷的剪刀將肺組織塊剪碎，以三去污裂解液將肺組織勻漿，4 ℃，10 000×g離心10 min，小心吸出上清液，用BCA法進行蛋白定量，然后通過雙抗體夾心ELISA測定心肌組織勻漿液中IFN-γ、IL-4濃度含量，所有操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書由專人進行統(tǒng)一檢測。

1.5ELISA檢測血清IFN-γ、IL-4濃度采用雙抗體夾心ELISA檢測各組大鼠血清IFN-γ和IL-4濃度，所有操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進行。

2　結(jié)　果

2.1大黃素對肺纖維化大鼠肺組織病理改變的影響實驗中各組大鼠均無死亡。HE染色(圖1)顯示，正常對照組肺組織結(jié)構(gòu)清晰，無炎性細胞浸潤，模型組肺組織中可見較多的炎性細胞浸潤，大黃素低、高劑量組及潑尼松組肺組織炎性細胞浸潤明顯減少；Masson染色發(fā)現(xiàn)(圖2)，正常對照組無纖維化發(fā)生，模型組肺泡間隔明顯增厚，部分肺泡腔被纖維組織占據(jù)，肺泡壁被破壞，肺間質(zhì)內(nèi)有大量藍色膠原沉積，出現(xiàn)明顯的纖維化，大黃素低、高劑量組及潑尼松組肺間質(zhì)內(nèi)僅見少量的藍色膠原沉積。表1顯示，與模型組比較，大黃素低、高劑量組及潑尼松組肺泡炎與肺纖維化評分明顯降低，差異均有顯著性(P<0.05 orP<0.01)，此外，大黃素高劑量組、潑尼松組上述指標(biāo)低于大黃素低劑量組(P<0.05)，然而，大黃素高劑量組與潑尼松組比較，差異無顯著性(P>0.05)。

A：正常對照組；B：模型組；C：大黃素低劑量組；D：大黃素高劑量組；E潑尼松組。

A：正常對照組；B：模型組；C：大黃素低劑量組；D：大黃素高劑量組；E潑尼松組

組別n肺泡炎肺纖維化正常對照組100±00±0模型組101．87±0．432．34±0．48大黃素低劑量組101．15±0．26?1．76±0．32?大黃素高劑量組100．76±0．15??△1．15±0．27??△潑尼松組100．71±0．13??△1．12±0．23??△

與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01;

與大黃素低劑量干預(yù)組比較，△P<0.05。

2.2大黃素對肺纖維化大鼠肺組織IFN-γ、IL-4含量的影響IFN-γ、IL-4分別是Th1、Th2型細胞因子的代表，為了探討大黃素對肺纖維化大鼠的保護作用是否和糾正Th1、Th2型細胞因子失衡有關(guān)，通過ELISA檢測肺組織勻漿液中IFN-γ、IL-4含量，結(jié)果顯示(表2)，模型組較正常對照組IFN-γ含量降低(P<0.01)，IL-4含量升高(P<0.01)，IFN-γ/IL-4比值明顯下降(P<0.01)；經(jīng)低、高劑量大黃素或潑尼松干預(yù)處理后，IFN-γ含量增加，IL-4含量減少(P<0.01)，IFN-γ/IL-4比值升高，與模型組比較，差異均有顯著性(P<0.01)；大黃素高劑量組、潑尼松組IFN-γ含量、IFN-γ/IL-4比值高于大黃素低劑量組(P<0.01)，IL-4含量則低于大黃素低劑量組(P<0.01)；但大黃素高劑量組與潑尼松組上述指標(biāo)無區(qū)別(P>0.05)。

2.3大黃素對肺纖維化大鼠血清IFN-γ、IL-4濃度的影響為了進一步證實大黃素是否能增加IFN-γ/IL-4比值，本研究運用ELISA檢測各組大鼠血清IFN-γ、IL-4濃度。由表3可知，模型組血清IFN-γ濃度、IFN-γ/IL-4比值低于正常對照組(P<0.01)，而血清IL-4濃度高于正常對照組(P<0.01)；與模型組比較，大黃素低、高劑量組及潑尼松組血清IFN-γ濃度、IFN-γ/IL-4比值增加(P<0.01)，血清IL-4濃度減少(P<0.01)；大黃素高劑量組、潑尼松組血清IFN-γ濃度、IFN-γ/IL-4比值較大黃素低劑量組升高(P<0.01)，血清IL-4濃度較大黃素低劑量組降低(P<0.01)；然而，大黃素高劑量組與潑尼松組比較，差異無顯著性(P>0.05)。

表2　各組大鼠肺組織IFN-γ、IL-4含量比較/pg·mg-1

*P<0.01 vs正常對照組；#P<0.01 vs模型組；△P<0.01 vs大黃素低劑量組。

表3　各組大鼠血清IFN-γ、IL-4濃度比較/pg·mL-1

*P<0.01 vs正常對照組；#P<0.01 vs模型組；△P<0.01 vs大黃素低劑量組。

3　討　論

肺纖維化的治療一直是臨床難點，目前以糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑(如環(huán)磷酰胺)、細胞毒類藥物(如硫唑嘌呤)以及抗纖維化制劑(如N-乙酰半胱氨酸、秋水仙堿)等為主，但療效都不佳，且長期使用激素和免疫抑制劑可出現(xiàn)感染、耐藥等不良反應(yīng)，因而限制了其臨床應(yīng)用。近年來，從中藥及天然植物中提取的毒副作用低的有效單體成分已成為纖維化疾病治療的新途徑。大黃素作為從中藥大黃的干燥根中提取的主要活性單體成分，已被證實有抗多種器官纖維化的作用[8]。本研究結(jié)果表明，正常對照組建模后第 28 天未發(fā)現(xiàn)肺泡炎癥與纖維化，可以排除氣管內(nèi)灌注生理鹽水的影響，此外，大黃素低、高劑量組肺泡炎與肺纖維化評分較模型組降低，并且劑量越大，效果越明顯，但大黃素高劑量組肺泡炎與肺纖維化評分與潑尼松組無明顯變化，與文獻報道相符[5]，進一步提示大黃素對博萊霉素所致的肺纖維化大鼠有良好的治療效果，并且80 mg·kg-1大黃素與5 mg·kg-1醋酸潑尼松作用相當(dāng)。

細胞因子的異常表達及其引起的細胞因子網(wǎng)絡(luò)平衡失調(diào)與肺纖維化的進展密切相關(guān)。IFN-γ是最經(jīng)典的Th1 型細胞因子, 它是一種強有力的抗肺纖維化因子，通過促進 Th1型細胞因子應(yīng)答，抑制Th2型細胞因子反應(yīng)，從而抑制肺成纖維細胞的增生和膠原的沉積[9]。ECM異常蓄積在肺纖維化進程中起關(guān)鍵作用。IL-4是標(biāo)志性的Th 2型細胞因子，其高表達可以直接促進肺成纖維細胞增生及膠原分泌[10]。IFN-γ與IL-4之間存在相互拮抗作用，當(dāng)IFN-γ/IL-4比值降低時，即可促進肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展，而IFN-γ/IL-4比值升高則緩解肺纖維化[11-12]。本研究中，肺纖維化大鼠予低、高劑量大黃素灌胃治療后，發(fā)現(xiàn)大黃素明顯增加肺組織IFN-γ含量，降低肺組織IL-4含量，導(dǎo)致IFN-γ/IL-4比值升高，并且高劑量的效果優(yōu)于低劑量，提示大黃素可能通過調(diào)整Th1/Th2型細胞因子平衡，重新恢復(fù)Th1型細胞因子的優(yōu)勢地位，從而產(chǎn)生抗肺纖維化作用。為了進一步證實大黃素的這種作用，本研究也檢測了血清IFN-γ、IL-4濃度，發(fā)現(xiàn)各組大鼠血清IFN-γ、IL-4濃度的變化趨勢與其肺組織勻漿液中的含量相似，進一步說明大黃素對肺纖維化大鼠的保護作用與其調(diào)整Th1/Th2型細胞因子平衡有關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，大黃素對博萊霉素所致的肺纖維化大鼠有良好的保護作用，其機制可能與糾正Th1/Th2型細胞因子平衡失調(diào)(即恢復(fù)Th1型細胞因子的優(yōu)勢效應(yīng))有關(guān)，這些作用機制的揭示為指導(dǎo)臨床用藥提供了可靠的藥理學(xué)依據(jù)，深入開展大黃素抗肺纖維化機制的研究將為這種難治性疾病的治療帶來新的思路和希望。

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Effects of Emodin on the Balance of Th1/Th2 Cytokines in Pulmonary Fibrosis Rats

DENGRi-qiang,CHENGJiang-tao,ZHANGHong-hua,YANGYin-lou

(Dept.ofRespiratoryMedicine,YuebeiPeople'sHospital,ShaoguanGuangdong512026)

Objective: To observe the effects of emodin on bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats, and explore whether the effects are mediated by the balance of Th1/Th2 cytokines. Methods: Fifty male SD rats were randomly divided into normal control group, model group, emodin low-dose group, emodin high-dose group, and prednisone group. Each group included 10 animals. Rats in the latter 4 groups were intratracheally administered with bleomycin A5 to establish pulmonary fibrosis model. From the second day on, rats in emodin low- and high-dose groups were intragastrically treated with 20 and 80 mg·kg-1emodin, respectively. Rats in prednisone group were intragastrically administrated with 5 mg·kg-1prednisone acetate, while rats in normal control and model groups were treated with normal saline. All rats were sacrificed on day 28. The pulmonary tissues were removed and used for HE and Masson staining. The contents of interferon-γ (IFN-γ) and interleukin-4 (IL-4) in pulmonary tissues were detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). In addition, sera were collected to test IFN-γ and IL-4 concentrations using ELISA. Results: The pulmonary inflammation and fibrosis in emodin low- and high-dose as well as prednisone groups were significantly improved compared to model group (P<0.05 orP<0.01). In comparison with normal control group, pulmonary IFN-γ content, serum IFN-γ concentration and the ratio of IFN-γ to IL-4 were significantly decreased while pulmonary IL-4 content and serum IL-4 concentration were significantly increased in model group (P<0.01). Pulmonary IFN-γ content, serum IFN-γ concentration and the ratio of IFN-γ to IL-4 were higher in emodin low- and high-dose intervention as well as prednisone groups than model group (P<0.01),whereas pulmonary IL-4 content and serum IL-4 concentration were lower in emodin low- and high-dose as well as prednisone groups than model group(P<0.01). The above indicators were significantly improved in emodin high-dose and prednisone groups as compared to emodin low-dose group (P<0.01). However, there was no significant difference between emodin high-dose group and prednisone group (P>0.05). Conclusion: Emodin protects rats from pulmonary fibrosis induced by bleomycin. Rectification of Th1/Th2 cytokine balance may be a significant mechanism via which emodin is protective against pulmonary fibrosis.

Emodin; Pulmonary fibrosis; Interferon-γ;Interleukin-4

R285.5

A

1001-5779(2016)03-0350-05

10.3969/j.issn.1001-5779.2016.03.005

2016-01-11)(責(zé)任編輯：劉仰斌)