許新雅 許慶芳 鄭躍 黃云芬 賴(lài)維 龔子鑒 陸春

510630廣州，中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院皮膚病與性病科

晚期糖基化終末產(chǎn)物對(duì)UVA照射皮膚成纖維細(xì)胞組織蛋白酶D表達(dá)及其活性的影響

許新雅 許慶芳 鄭躍 黃云芬 賴(lài)維 龔子鑒 陸春

510630廣州，中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院皮膚病與性病科

目的研究晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGE）對(duì)長(zhǎng)波紫外線(xiàn)（UVA）照射皮膚成纖維細(xì)胞組織蛋白酶D（CatD）表達(dá)和活性的影響。方法原代培養(yǎng)來(lái)自?xún)和こ衫w維細(xì)胞。CCK?8法篩選對(duì)成纖維細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒性的AGE?牛血清白蛋白（BSA）濃度。分別以50、100、200 mg/L AGE?BSA孵育細(xì)胞24 h，以未處理細(xì)胞作為對(duì)照組，采用RT?PCR、Western印跡及熒光法檢測(cè)AGE?BSA對(duì)細(xì)胞CatD表達(dá)和活性影響。將部分成纖維細(xì)胞分為6組，即對(duì)照組（正常皮膚成纖維細(xì)胞，不接受任何處理）、AGE?BSA組、BSA組、UVA組、UVA?AGE?BSA組、UVA?BSA組。AGE?BSA組加入最大無(wú)細(xì)胞毒性濃度AGE?BSA孵育24 h，BSA組加入相同濃度BSA孵育24 h，后3組除分別接受上述處理外再接受10 J/cm2UVA照射。處理結(jié)束后，收集細(xì)胞mRNA和蛋白，采用RT?PCR、Western印跡及熒光法檢測(cè)細(xì)胞CatD表達(dá)和活性。結(jié)果50、100、200 mg/L AGE?BSA對(duì)皮膚成纖維細(xì)胞增殖活性無(wú)顯著影響。50 mg/L組、100 mg/L組、200 mg/L組細(xì)胞CatD mRNA水平分別為0.267±0.007、0.348±0.007、0.418±0.006，CatD蛋白水平分別為1.403±0.181、2.233±0.090、2.477±0.111，CatD活性分別為1.760±0.080、2.330±0.060、2.890±0.080，較相應(yīng)對(duì)照組CatD mRNA（0.161±0.006）、CatD蛋白（0.903±0.200）以及CatD活性水平（1.100±0.090）均顯著升高，均P＜0.05。AGE?BSA呈劑量依賴(lài)性地刺激細(xì)胞CatD表達(dá)和活性。對(duì)照組、UVA組和UVA?AGE?BSA組細(xì)胞中CatD mRNA表達(dá)水平分別為0.155±0.005、0.480±0.005、0.394±0.008，蛋白表達(dá)水平分別為0.920±0.235、2.583±0.199、2.070±0.125，CatD活性分別為1.110±0.040、2.970±0.110、2.560±0.060；UVA組CatD mRNA水平、蛋白表達(dá)水平、酶活性均明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），但UVA?AGE?BSA組3種指標(biāo)水平均顯著低于UVA組（P＜0.05）。結(jié)論AGE可升高未接受UVA照射的皮膚成纖維細(xì)胞CatD表達(dá)和活性，但AGE卻抑制UVA照射上調(diào)的CatD表達(dá)和酶活性。

成纖維細(xì)胞；糖基化終產(chǎn)物，高級(jí)；紫外線(xiàn)；組織蛋白酶D

晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGE）是指蛋白質(zhì)、脂類(lèi)、核酸等大分子物質(zhì)的游離氨基與還原糖發(fā)生緩慢非酶糖化反應(yīng)，最終形成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、不易降解的大分子棕色產(chǎn)物。AGE與衰老、氧化應(yīng)激密切相關(guān)［1］。新近研究發(fā)現(xiàn)，AGE在光老化皮膚中堆積，并在光老化中起重要作用［2］。組織蛋白酶D（cathepsin D，CatD）是降解AGE的重要蛋白酶之一［3］，在光老化皮膚及皮膚成纖維細(xì)胞中表達(dá)降低［4］，機(jī)制未明。AGE是否影響光損傷皮膚成纖維細(xì)胞CatD表達(dá)和活性，目前還不清楚。我們對(duì)比檢測(cè)AGE?牛血清白蛋白（BSA）對(duì)UVA照射和未照射的皮膚成纖維細(xì)胞CatD表達(dá)和活性的影響，探討CatD在光老化皮膚AGE堆積中的作用機(jī)制。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

1.皮膚成纖維細(xì)胞：分離自中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院泌尿外科健康兒童包皮環(huán)切術(shù)后的包皮組織。

2.試劑和儀器：DMEM（Dulbecco′s modified eagle′s media）高糖培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液（PBS）、青霉素和鏈霉素均產(chǎn)自美國(guó)Gibco公司；BSA、AGE?BSA及CatD活性檢測(cè)試劑盒產(chǎn)自美國(guó)Biovision公司；一抗兔抗人CatD?IgG抗體、內(nèi)參兔抗人內(nèi)參基因（GAPDH）多克隆IgG抗體、二抗辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記羊抗兔IgG抗體均產(chǎn)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。BCA蛋白定量試劑盒產(chǎn)自美國(guó)Pierce公司。ECL顯色試劑盒產(chǎn)自美國(guó)Millipore公司，預(yù)染蛋白標(biāo)記物（Marker）產(chǎn)自加拿大MBI Fermentas公司?？俁NA提取試劑Trizol產(chǎn)自美國(guó)Invitrogen公司。Primescript RT預(yù)混液、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和Sybrpremix ex taqTM試劑盒產(chǎn)自日本Takara公司。UVA紫外線(xiàn)輻射儀（Sigma ss?03A）、UVA輻照計(jì)（Sigma ss?03A）兩者均產(chǎn)自上海希格瑪高科技有限公司。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀產(chǎn)自美國(guó)Biotek公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱產(chǎn)自美國(guó)Thermo Scientific公司；普通光學(xué)顯微鏡產(chǎn)自日本Nikon公司；熒光倒置顯微鏡產(chǎn)自德國(guó)Leica公司；ABI Prism 7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀產(chǎn)自美國(guó)ABI公司；多功能酶標(biāo)儀SpectraMax M5產(chǎn)自美國(guó)Molecular Devices公司。

二、方法

1.原代皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)：取兒童包皮（本研究經(jīng)過(guò)中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)且患者及家屬已簽署知情同意書(shū)），參照文獻(xiàn)［5］分離培養(yǎng)皮膚成纖維細(xì)胞，第3代細(xì)胞凍存。細(xì)胞復(fù)蘇后培養(yǎng)10代以?xún)?nèi)的細(xì)胞行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.CCK?8法檢測(cè)AGE?BSA對(duì)皮膚成纖維細(xì)胞增殖活性的影響：將成纖維細(xì)胞按5×103細(xì)胞/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔含100 μl細(xì)胞培養(yǎng)液，每組各設(shè)3個(gè)復(fù)孔。37℃孵育24 h后分別加入50、100、200、400 mg/L AGE?BSA，對(duì)照組加入等量不含AGE的培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μl CCK?8試劑，37℃孵育4 h，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定450 nm處吸光度（A值，以空白試劑孔調(diào)零）。

3.不同濃度AGE?BSA對(duì)皮膚成纖維細(xì)胞CatD表達(dá)和活性的影響：實(shí)驗(yàn)分為無(wú)處理對(duì)照組、50 mg/L AGE?BSA組、100 mg/L AGE?BSA組、200 mg/L AGE?BSA組。接種1×106成纖維細(xì)胞于直徑6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，24 h后加入不同濃度AGE?BSA，孵育24 h后提取各組細(xì)胞RNA和蛋白。RT?PCR、Western印跡及熒光法檢測(cè)各組細(xì)胞CatD表達(dá)和活性，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

4.AGE?BSA對(duì)UVA照射皮膚成纖維細(xì)胞CatD表達(dá)和活性的影響：實(shí)驗(yàn)分為6組，即對(duì)照組（正常皮膚成纖維細(xì)胞）、AGE?BSA組、BSA組、UVA組、UVA?AGE?BSA組、UVA?BSA組，AGE?BSA組加入最大無(wú)細(xì)胞毒性濃度AGE?BSA孵育24 h，BSA組加入相同濃度BSA孵育24 h，后3組除分別接受上述處理外再接受10 J/cm2UVA照射。根據(jù)CCK?8法選擇一無(wú)細(xì)胞毒性最大AGE?BSA濃度作為本實(shí)驗(yàn)濃度。將3～10代成纖維細(xì)胞按每皿1×106接種于直徑為6 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿，24 h后向BSA組、UVA?BSA組、AGE?BSA組和UVA?AGE?BSA組培養(yǎng)皿中分別加入相同濃度BSA和AGE?BSA，孵育24 h。將細(xì)胞從培養(yǎng)箱取出，吸棄培養(yǎng)液，PBS洗2次后，每皿加入等量薄層PBS，并分別加入相同濃度BSA和AGE?BSA。培養(yǎng)皿置于UVA紫外線(xiàn)輻射儀下，UVA照射劑量為10 J/cm2。無(wú)照射細(xì)胞置于超凈臺(tái)避光。照射后細(xì)胞放置半小時(shí)，吸棄PBS溶液，加入新鮮培養(yǎng)液（含或不含BSA及AGE?BSA），置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，提取各組細(xì)胞RNA和蛋白。RT?PCR、Western印跡及底物熒光法檢測(cè)各組細(xì)胞CatD表達(dá)和活性，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

5.RT?PCR檢測(cè)皮膚成纖維細(xì)胞CatD mRNA表達(dá)：取各組細(xì)胞，按照Trizol試劑盒說(shuō)明提取總RNA。按試劑盒說(shuō)明書(shū)配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，總體積 20 μl，37 ℃下反轉(zhuǎn)錄 15 min，85 ℃ 5 s，獲得cDNA，置-20℃冰箱中保存。采用染料法（SYBR GreenⅠ）進(jìn)行相對(duì)定量分析。PCR反應(yīng)體系共20 μl，包括 SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ 10 μl，ROXDyeⅡ0.4 μl，雙蒸水 6 μl，上游和下 游引物各 0.8 μl，cDNA 2 μl。兩步法實(shí)時(shí)定量PCR：95 ℃ 5 s，1個(gè)循環(huán)；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。CatD上游引物序列5′?AGAAGCTGGTGGACCAGAACATC?3′，下游引物序列5′?TCCAGGTGGACCTGCCAGTA?3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度163 bp。GAPDH上游引物序列5′?GCACCGTCAAGGCTGAGAAC?3′，下游引物序列5′?TGGTGAAGACGCCAGTGGA?3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度138 bp。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上讀取擴(kuò)增曲線(xiàn)、熔解曲線(xiàn)和Ct值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值，用2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因和內(nèi)參基因相對(duì)表達(dá)值。

6.Western印跡檢測(cè)皮膚成纖維細(xì)胞CatD蛋白表達(dá)變化：提取各組細(xì)胞總蛋白，-80℃保存。二喹啉甲酸（BCA）法蛋白定量?？偟鞍捉?jīng)10%十二烷基硫酸鈉?聚丙烯凝膠電泳（SDS?PAGE）分離后，電轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。分別加入一抗兔抗人CatD?IgG（濃度1∶1 000），內(nèi)參兔抗人GAPDH IgG（濃度1∶4 000），4℃孵育過(guò)夜，三羥甲基氨基甲烷緩沖氯化鈉溶液+吐溫（TBST）溶液洗膜，加入HRP標(biāo)記羊抗兔IgG（濃度1∶1 000）37 ℃ 孵育1 h，TBST液洗膜3次。ECL顯色、壓片、定影及顯影。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

7.皮膚成纖維細(xì)胞CatD活性檢測(cè)：使用CatD活性檢測(cè)試劑盒完成。提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法蛋白定量。取50 μl細(xì)胞裂解上清液加入50 μl反應(yīng)緩沖液，混合后加入7?甲氧基?4?乙?；愣顾兀∕CA）標(biāo)記的CatD酶底物，使其終濃度為200 μmol/L，37℃孵育1.5 h。設(shè)置多功能酶標(biāo)儀在激發(fā)光328 nm，吸收光460 nm模式下檢測(cè)游離MCA水平。酶標(biāo)儀檢測(cè)的每組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度值與其蛋白濃度的比值即為該組細(xì)胞CatD相對(duì)活性。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

8.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：數(shù)據(jù)均以x±s表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），兩兩多重比較采用LSD?t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、AGE?BSA對(duì)皮膚成纖維細(xì)胞增殖活性的影響

50、100、200、400 mg/L AGE?BSA孵育細(xì)胞24 h后，細(xì)胞增殖活性分別為對(duì)照組的98.4%、95.4%、92.9%、84.8%，400 mg/L AGE?BSA使細(xì)胞活性明顯下降（F=186.13，P＜ 0.05）。因此，本實(shí)驗(yàn)選用50、100、200 mg/L作為AGE?BSA后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度。

二、AGE?BSA對(duì)皮膚成纖維細(xì)胞CatD表達(dá)及其活性的影響

見(jiàn)圖1、表1。50、100、200 mg/L AGE?BSA分別孵育成纖維細(xì)胞24 h后，細(xì)胞CatD mRNA和蛋白表達(dá)以及CatD活性均較相應(yīng)對(duì)照組顯著升高（均P＜0.05），且隨AGE?BSA濃度增加而升高。對(duì)照組、50 mg/L組、100 mg/L組、200 mg/L組間兩兩比較，上述3個(gè)指標(biāo)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。AGE?BSA呈劑量依賴(lài)性地刺激皮膚成纖維細(xì)胞CatD表達(dá)和活性。

三、AGE?BSA對(duì)UVA照射皮膚成纖維細(xì)胞CatD表達(dá)和活性的影響

見(jiàn)圖2、表2。對(duì)照組、BSA組、AGE?BSA組、UVA組、UVA?BSA組和UVA?AGE?BSA組間CatD 蛋白、CatD mRNA和CatD活性差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。LSD?t檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，UVA組和UVA?BSA組CatD mRNA表達(dá)明顯高于其他組（P＜0.05）；UVA?AGE?BSA組明顯低于UVA組（P＜0.05），但仍顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；對(duì)照組與BSA組間、UVA組與UVA?BSA組間、AGE?BSA組與UVA組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。CatD蛋白表達(dá)、活性統(tǒng)計(jì)比較結(jié)果與CatD mRNA表達(dá)一致。

討 論

AGE主要累及更新率緩慢、富含賴(lài)氨酸的蛋白質(zhì)。人皮膚膠原蛋白、彈性蛋白代謝緩慢，并含較多賴(lài)氨酸及羥賴(lài)氨酸，它們是皮膚發(fā)生非酶糖化反應(yīng)的主要蛋白。非酶糖化反應(yīng)是一緩慢、漫長(zhǎng)過(guò)程，然而紫外線(xiàn)可加速其反應(yīng)［6］。Jeanmaire等［6］通過(guò)免疫組化發(fā)現(xiàn)，AGE在曝光部位皮膚及光老化皮膚明顯多于非曝光部位。AGE不僅通過(guò)與蛋白質(zhì)、脂類(lèi)、核酸等大分子物質(zhì)交聯(lián)、結(jié)合直接破壞該大分子物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，還通過(guò)與細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合，引發(fā)生物學(xué)效應(yīng)［7］?，F(xiàn)有研究揭示，AGE主要通過(guò)以下機(jī)制在光老化中起重要作用：①促進(jìn)活性氧族ROS生成，抑制超氧化歧化活性［8］；②促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞凋亡：增加紫外線(xiàn)光毒性，通過(guò)上調(diào)ROS損傷角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡［9］；③導(dǎo)致基質(zhì)金屬蛋白酶系統(tǒng)失衡［10］；④使膠原纖維變性［2］；⑤使彈性纖維變性，抑制彈性蛋白酶降解［11］。

圖1 不同濃度AGE?BSA對(duì)皮膚成纖維細(xì)胞CatD蛋白表達(dá)的影響 1：對(duì)照組；2：50 mg/L AGE?BSA組；3：100 mg/L AGE?BSA組；4：200 mg/L AGE?BSA組。CatD：組織蛋白酶D；GAPDH：3?磷酸甘油醛脫氫酶；AGE?BSA：晚期糖基化終末產(chǎn)物?牛血清白蛋白

表1 不同濃度AGE?BSA對(duì)皮膚成纖維細(xì)胞CatD表達(dá)和活性的影響（x±s）

AGE在光老化皮膚中的堆積機(jī)制目前還不清楚。AGE結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易被降解。既往研究認(rèn)為，AGE主要通過(guò)單核巨噬細(xì)胞吞噬作用經(jīng)腎臟清除。新近發(fā)現(xiàn)，溶酶體內(nèi)CatD具很強(qiáng)的降解AGE的功能，在機(jī)體清除AGE中起重要作用［3］。CatD屬于天冬氨酸組織蛋白酶，參與調(diào)控皮膚角化、屏障功能及皮膚顏色等［12］。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是光老化成纖維細(xì)胞還是人體光老化皮膚，CatD基因和蛋白表達(dá)均降低［4］。CatD表達(dá)下調(diào)很可能使其活性降低，從而影響AGE降解，進(jìn)而促進(jìn)AGE在光老化皮膚中堆積。CatD表達(dá)如何在光老化皮膚及皮膚成纖維細(xì)胞中降低，光老化皮膚中堆積的AGE是否影響CatD表達(dá)，目前仍不清楚。研究已揭示，AGE會(huì)影響皮膚成纖維細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)，我們推測(cè)AGE也很可能影響CatD表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)，AGE?BSA呈劑量依賴(lài)性刺激皮膚成纖維細(xì)胞CatD表達(dá)和提高其活性，表明成纖維細(xì)胞可能通過(guò)上調(diào)CatD表達(dá)和活性增強(qiáng)機(jī)體對(duì)AGE降解。Grimm等［13］也報(bào)道，AGE?BSA上調(diào)RAW 264.7細(xì)胞 CatD表達(dá)和活性。皮膚成纖維細(xì)胞膜表面有AGE受體表達(dá)［14］，AGE?BSA是否通過(guò)與AGE受體結(jié)合上調(diào)成纖維細(xì)胞CatD表達(dá)和活性，有待進(jìn)一步研究。

圖2 AGE?BSA對(duì)10 J/cm2UVA照射的皮膚成纖維細(xì)胞CatD蛋白表達(dá)的影響 1：對(duì)照組；2：BSA組；3：AGE?BSA組；4：UVA組；5：UVA?BSA 組；6：UVA?AGE?BSA 組。CatD：組織蛋白酶 D；GAPDH：3?磷酸甘油醛脫氫酶；AGE?BSA：晚期糖基化終末產(chǎn)物?牛血清白蛋白

表2AGE?BSA對(duì)UVA照射的皮膚成纖維細(xì)胞CatD表達(dá)和活性的影響

Wondrak等［9］發(fā)現(xiàn)，AGE通過(guò)促進(jìn)UVA照射成纖維細(xì)胞ROS生成增加UVA光毒性。所以，我們以AGE?BSA孵育細(xì)胞，再以UVA照射，研究AGE?BSA對(duì)UVA照射成纖維細(xì)胞CatD表達(dá)和活性影響。在UVA照射細(xì)胞過(guò)程中，按照Wondrak等［9］的方法，于PBS中加入AGE?BSA，并且照射后放置半小時(shí)才更換新鮮培養(yǎng)液，以保證AGE?BSA光毒性作用于細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，UVA?AGE?BSA組細(xì)胞CatD表達(dá)和活性明顯低于UVA組，而UVA組CatD表達(dá)和活性顯著高于對(duì)照組，提示急性UVA照射上調(diào)成纖維細(xì)胞CatD表達(dá)和活性，但是AGE?BSA卻抑制UVA上調(diào)的CatD表達(dá)和活性。本研究設(shè)立了BSA組，以排除BSA對(duì)細(xì)胞CatD表達(dá)和活性影響。結(jié)果顯示，CatD表達(dá)和活性在對(duì)照組和BSA組之間、UVA組和UVA?BSA組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，從而排除了BSA對(duì)細(xì)胞的作用。我們通過(guò)建立體外急性UVA光損傷細(xì)胞模型發(fā)現(xiàn)，AGE?BSA可抑制UVA上調(diào)CatD表達(dá)和活性。另一方面，UVA?AGE?BSA組與AGE?BSA組間CatD表達(dá)和活性差異有顯著性，且均高于對(duì)照組，提示AGE?BSA可以促進(jìn)皮膚成纖維細(xì)胞CatD表達(dá)上調(diào)和活性增強(qiáng)，表明成纖維細(xì)胞可能通過(guò)上調(diào)CatD表達(dá)和活性增強(qiáng)機(jī)體對(duì)AGE降解。然而，在光老化過(guò)程中，皮膚長(zhǎng)期暴露于UVA，逐漸堆積的AGE進(jìn)一步抑制成纖維細(xì)胞CatD表達(dá)和活性，最終導(dǎo)致CatD在光老化皮膚成纖維細(xì)胞中表達(dá)和活性低于年輕正常成纖維細(xì)胞。CatD表達(dá)和活性的降低，減少了機(jī)體對(duì)AGE的降解清除，加速了AGE在光老化皮膚的堆積。AGE堆積又進(jìn)一步降低CatD表達(dá)和活性，從而形成惡性循環(huán)并在光老化中起作用。

AGE可促進(jìn)UVA照射成纖維細(xì)胞ROS生成，ROS升高又可激活細(xì)胞促絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路及核因子（NF）?κB信號(hào)通路［15］。AGE?BSA抑制UVA照射成纖維細(xì)胞CatD表達(dá)及活性機(jī)制是否與ROS下調(diào)細(xì)胞膜RAGE表達(dá)，干擾AGE?BSA與RAGE結(jié)合，抑或AGE?BSA與UVA共同激活一些細(xì)胞信號(hào)通路有關(guān)，尚未深入研究，故AGE?BSA如何導(dǎo)致UVA照射成纖維細(xì)胞CatD表達(dá)及活性降低及其具體機(jī)制，尚需進(jìn)一步研究。

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Effects of advanced glycation end products on the expressions and activity of cathepsin D in ultraviolet A?irradiated human dermal fibroblasts

Xu Xinya,Xu Qingfang,Zheng Yue,Huang Yunfen,Lai Wei,Gong Zijian,Lu Chun
Department of Dermatology and Venereology,Third Affiliated Hospital,Sun Yat?sen University,Guangzhou 510630,China

ObjectiveTo investigate the effects of advanced glycation end products（AGE）on the expressions and activity of cathepsin D（CatD）in ultraviolet A（UVA）?irradiated human dermal fibroblasts.MethodsHuman dermal fibroblasts were isolated and harvested from the circumcised foreskin of children,and subjected to a primary culture.CCK?8 assay was performed to screen non?cytotoxic concentrations of AGE?bovine serum albumin（BSA）.Some fibroblasts were incubated with 50,100 and 300 mg/L AGE?BSA separately for 24 hours,with untreated cells as the control group.Then,reverse transcription（RT）?PCR,Western?blot analysis and a fluorimetric assay were performed to measure the mRNA and protein expressions as well as activity of CatD,respectively.Some fibroblasts were classified into six groups:control group receiving no treatment,AGE?BSA group and BSA group treated with the highest non?cytotoxic concentration of AGE?BSA and the same concentration of BSA respectively for 24 hours,UVA group irradiated by 10 J/cm2UVA,UVA?AGE?BSA group and UVA?BSA group treated with AGE?BSA and BSA at the above non?cytotoxic concentration respectively for 24 hours both before and after UVA radiation at 10 J/cm2.After the treatments,RT?PCR,Western?blot analysis and a fluorimetric assay were conducted to detect mRNA and protein expressions and activity of CatD respectively.ResultsAGE?BSA of 50-200 mg/L exhibited no obvious influence on cellular proliferation of fibroblasts.The fibroblasts incubated with AGE?BSA of 50,100 and 200 mg/L showed a significant increase in the mRNA expression（0.267±0.007,0.348±0.007,and 0.418±0.006 respectively）,protein expression（1.403±0.181,2.233±0.090 and 2.477±0.111 respectively）,and activity（1.760±0.080,2.330±0.060 and 2.890±0.080 respectively）of CatD compared with the control group（mRNA:0.161± 0.006;protein:0.903± 0.200;activity:1.100 ± 0.090,allP＜ 0.05）.AGE?BSA increased CatD expressions and activity in a dose?dependent manner.The mRNA and protein expressions as well as activity of CatD were significantly higher in the UVA group than in the control group（mRNA expression:0.480±0.005vs.0.155±0.005;protein expression:2.583±0.199vs.0.920±0.235;activity:2.970 ± 0.110vs.1.110 ± 0.040,allP＜ 0.05）,but significantly lower in the UVA?AGE?BSA group than in the UVA group（mRNA expression:0.394±0.008vs.0.480±0.005;protein expression:2.070±0.125vs.2.583±0.199;activity:2.560±0.060vs.2.970±0.110,allP＜0.05）.ConclusionAGEs could increase CatD expressions and activity in human dermal fibroblasts not receiving UVA irradiation,but inhibit their increase in UVA?induced human dermal fibroblasts.

Fibroblasts;Glycosylation end products,advanced;Ultraviolet rays;Cathepsin D

Xu Qingfang,Email:xqf69@163.com

許慶芳，Email：xqf69@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2016.08.013

國(guó)家自然科學(xué)基金（81201241）；廣東省第一批產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究與開(kāi)發(fā)資金計(jì)劃項(xiàng)目（2012B031800057）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（81201241）;The First Batch of Planning Program for Industrial Technology Research and Development of Guangdong Province（2012B031800057）

2015?11?02）

（本文編輯：尚淑賢）