王曉明 薛峰 鄭捷

200025上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院皮膚科

副銀屑病皮損及外周血TCRγ基因重排的檢測及其臨床意義探討

王曉明 薛峰 鄭捷

200025上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院皮膚科

目的檢測副銀屑病患者皮損及外周血TCRγ基因重排并探討其臨床意義。方法20例副銀屑病患者，采用BIOMED?2多重PCR擴(kuò)增體系檢測其皮膚及外周血TCRγ鏈基因重排，分析TCRγ基因重排與患者一般資料、臨床類型、組織病理表現(xiàn)（非特異表現(xiàn)和非典型表現(xiàn)）的相關(guān)性。結(jié)果20例副銀屑病患者皮損中，7例TCRγ基因重排陽性。11例外周血TCRγ基因重排檢測中3例陽性，其中2例皮損檢測亦陽性。皮損及外周血TCRγ基因重排與患者性別、年齡、病程、臨床類型均無關(guān)（P＞0.05），而皮損TCRγ基因重排陽性與蕈樣肉芽腫相關(guān)不典型表現(xiàn)有關(guān)（P＜0.05）。20例患者平均隨訪（44.85±18.48）個(gè)月，1例進(jìn)展為蕈樣肉芽腫，2例痊愈。結(jié)論副銀屑病患者皮損TCRγ基因重排陽性可能與蕈樣肉芽腫相關(guān)不典型表現(xiàn)有關(guān)，結(jié)合組織病理不典型表現(xiàn)，提示有進(jìn)展為蕈樣肉芽腫的可能。

類銀屑病；基因重排，γ鏈T細(xì)胞抗原受體；蕈樣真菌病

副銀屑病是一組病因未明的慢性鱗屑性炎癥性皮膚病，由于皮損形態(tài)不一，病理又無特異性改變，故有時(shí)診斷較為困難，尤其是與早期蕈樣肉芽腫（mycosis fungoides，MF）的鑒別。目前學(xué)者們對副銀屑病與早期MF間的關(guān)系持不同觀點(diǎn)，WHO分類認(rèn)為小斑塊型為良性疾病，而大斑塊型是腫瘤前的淋巴增生性疾?。?］。但近年來，副銀屑病進(jìn)展為MF的案例屢有報(bào)道［2?6］。TCR基因重排檢測可作為MF與良性炎癥性疾病的輔助鑒別手段，但有文獻(xiàn)報(bào)道［2?3，5，7?10］，副銀屑病患者皮損或外周血中也可出現(xiàn)TCR基因重排陽性。我們檢測副銀屑病患者皮損和（或）外周血TCR基因重排，探討其臨床意義。

材料和方法

一、材料

1.標(biāo)本來源：2009年4月至2014年8月就診于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院皮膚科的20例經(jīng)臨床和組織病理確診的副銀屑病患者，臨床表現(xiàn)為淡紅色或紅褐色斑疹、斑丘疹、丘疹，上覆少量鱗屑，刮之無點(diǎn)狀出血現(xiàn)象，無自覺癥狀或稍有瘙癢，慢性病程。

2.主要試劑和儀器：DNeasy Blood&Tissue Kit（德國Qiagen公司），甲酰胺、Taq酶、Genescan?500LIZ、PCR擴(kuò)增儀、DNA3130XL序列測定儀（美國ABI公司），Peak Scanner Software v1.0（德國Applied Biosystems公司），紫外分光光度計(jì)（上海昂拉儀器有限公司）。

二、方法

1.皮膚及外周血TCRγ基因重排檢測（TCR?γ?PCR?GSA方法）：①外周血及皮膚DNA的抽提：用DNeasy Blood&Tissue Kit抽提外周血及粉碎后的皮損處皮膚組織DNA，具體步驟按說明書操作；②模板DNA濃度及純度測定：用紫外分光光度計(jì)于260～280 nm波長下測量抽提的DNA樣本吸光度（A值），A260/A280值在1.8～2.0間即為純DNA樣本；③PCR擴(kuò)增：TCRγ基因引物 VγJγ設(shè)計(jì)參照BIOMED?2法［11］，引物序列如表1所示；④PCR產(chǎn)物基因掃描：將熒光引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行基因掃描，采用ABIDNA3130XL序列測定儀測定，并使用Peak Scanner Software v1.0分析。上述TCRγ基因重排的檢測，每個(gè)樣本至少重復(fù)1次，若2次結(jié)果不一致，則進(jìn)行第3次檢測，以至少有2次可重復(fù)性結(jié)果作為最終結(jié)果。

2.組織病理分析：20例副銀屑病病理表現(xiàn)歸為2種類型，一種為非特異性表現(xiàn)：表皮正常，或出現(xiàn)海綿水腫，可有淋巴細(xì)胞外滲，真皮淺層小血管周圍淋巴組織細(xì)胞浸潤，且無異形細(xì)胞；另一種為不典型表現(xiàn)，即與MF相關(guān)的表現(xiàn)：真表皮之間線性排列的淋巴細(xì)胞，緊密結(jié)合在基底層細(xì)胞，細(xì)胞可有異形性，淋巴細(xì)胞有時(shí)會(huì)聚集。

3.臨床隨訪觀察：自檢測皮損及外周血TCRγ基因重排之日起至2015年10月31日，對患者的臨床過程及預(yù)后進(jìn)行隨訪觀察。

表1 TCRγ基因引物序列

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件，正態(tài)分布數(shù)據(jù)以x±s表示，不符合者以中位數(shù)M（P25～P75）表示。正態(tài)分布的計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布則采用秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料R×C列聯(lián)表采用Fisher確切概率法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、臨床資料

20例副銀屑病患者中，男8例，女12例，年齡7～74（47.9±17.07）歲，病程0～20年，中位病程2.5年。如表2所示，20例患者中，點(diǎn)滴型9例，大斑塊型3例，小斑塊型8例，所有患者均進(jìn)行了皮損TCRγ基因重排檢測，共7例陽性，分別為點(diǎn)滴型2例，大斑塊型2例，小斑塊型3例；11例（點(diǎn)滴型6例、大斑塊型2例、小斑塊型3例）進(jìn)行了外周血TCRγ基因重排檢測，共3例陽性，分別為點(diǎn)滴型1例，小斑塊型2例，后2例皮損檢測亦為陽性。組織病理出現(xiàn)不典型表現(xiàn)者6例，分別為大斑塊型3例、小斑塊型2例、點(diǎn)滴型1例。

二、皮損TCRγ基因重排與患者性別、年齡、病程、臨床類型、組織病理表現(xiàn)的關(guān)系

皮損TCRγ基因重排陽性的7例患者年齡（50.71±15.03）歲，13例陰性患者（46.38±18.47）歲，兩組比較，t=0.531，P=0.602；陽性組病程［M（P25～P75）為2（2 ～ 5）年，陰性組3（1 ～ 4）年，兩組經(jīng)秩和檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.643）。皮損TCRγ基因重排與性別、臨床類型均無關(guān)（均P＞0.05）。7例陽性者中5例有不典型病理表現(xiàn)，13例陰性者中僅1例有不典型病理表現(xiàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），即皮損TCRγ基因重排陽性與MF相關(guān)不典型表現(xiàn)有關(guān)。見表2。

三、外周血TCRγ基因重排與性別、年齡、病程、臨床類型及病理表現(xiàn)的關(guān)系

3例外周血TCRγ基因重排陽性患者中2例皮損基因重排陽性，而8例外周血陰性患者中5例皮損陰性。3例外周血TCRγ基因重排陽性患者年齡（55.67±3.22）歲，8例陰性患者（39.5±16.05）歲，兩組比較，t=1.667，P=0.128；陽性組中位病程2年，陰性組3年，兩組經(jīng)秩和檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.776）。外周血TCRγ基因重排與性別、臨床類型及病理表現(xiàn)無關(guān)，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

四、隨訪觀察

20例副銀屑病患者自檢測TCRγ基因重排之日起隨訪16～80（44.85±18.48）個(gè)月。自皮損初發(fā)的時(shí)間為16～282（89.5±55.88）個(gè)月。2例痊愈（點(diǎn)滴型1例，小斑塊型1例）；1例大斑塊型患者在隨訪第18個(gè)月時(shí)通過病理檢查確診為MF，其前后2次病理表現(xiàn)見圖1，此例患者2次皮膚及外周血TCRγ基因重排結(jié)果一致（皮損檢測陽性，外周血檢測陰性）。17例患者病情反復(fù)（8例點(diǎn)滴型，2例大斑塊型，7例小斑塊型），但尚無皮膚T細(xì)胞淋巴瘤（CTCL）或其他腫瘤發(fā)生，繼續(xù)隨訪中。

表2 副銀屑病患者皮損與外周血TCRγ基因重排與患者性別、臨床類型及病理表現(xiàn)的關(guān)系（例）

討 論

PCR方法檢測TCR基因重排可以發(fā)現(xiàn)皮損及外周血中的T細(xì)胞克隆，為診斷CTCL提供重要線索。針對TCR中α、β、δ和γ 4種鏈的結(jié)構(gòu)，目前可分別設(shè)計(jì)V區(qū)和J區(qū)通用引物進(jìn)行PCR。但在CTCL患者中，TCRγ基因重排幾乎出現(xiàn)在所有T細(xì)胞淋巴瘤，其頻率高于其他3條鏈，而且γ基因的結(jié)構(gòu)相對簡單，沒有可變D區(qū)域，利于設(shè)計(jì)PCR引物，擴(kuò)增出更多可能的基因重排方式。因此，本研究選擇TCRγ基因作為TCR的克隆性分析的對象［12］。

本研究7例副銀屑病患者皮損TCRγ基因重排陽性，包括3例點(diǎn)滴型、2例大斑塊型及3例小斑塊型。11例外周血TCRγ基因重排檢測中3例陽性，包括 1 例點(diǎn)滴型及 2例小斑塊型。研究［2?3，7?8］顯示，大斑塊型皮損TCR基因重排陽性率為0～50%，Simon等［2］檢測12例大斑塊型皮損TCRγ基因重排，6例陽性。小斑塊型皮損TCR基因重排陽性率為0 ～ 66.7%［2?3，7?8］。Klemke等［3］分析了 5 例小斑塊型皮損TCRγ基因重排，2例陽性。而Bernier等［7］分析20例小斑塊型皮損TCRγ基因重排，未發(fā)現(xiàn)陽性者。文獻(xiàn)［13?15］顯示，良性炎癥性疾?。ò裾睢y屑病、扁平苔蘚、癢疹、藥疹等）皮損TCRγ基因重排陽性率為0～21.7%。既往研究中，66.7%（14/21）CTCL患者皮損TCRγ基因重排陽性，且皮損處陽性率較外周血高［16］。本研究結(jié)果與既往文獻(xiàn)比較，副銀屑?。ㄓ绕涫谴蟀邏K型）皮損TCRγ基因重排陽性率較高，與CTCL相近，故認(rèn)為副銀屑病的TCRγ基因重排陽性的意義值得探討。

本研究中分別有3例大斑塊型、1例小斑塊型及1例點(diǎn)滴型出現(xiàn)不典型病理表現(xiàn)，且不典型病理表現(xiàn)與皮損TCRγ基因重排有關(guān)，即皮損TCRγ基因重排陽性患者易出現(xiàn)不典型病理表現(xiàn)。V?kev?等［17］回顧分析105例副銀屑病患者的病理表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)85%小斑塊型和54%大斑塊型可出現(xiàn)不典型表現(xiàn)，但該研究未檢測TCR基因重排情況。Bernier等［7］分析了88例副銀屑病患者的組織病理，顯示15%小斑塊型和23.5%大斑塊型有不典型表現(xiàn)。因此，皮損TCRγ基因重排陽性可能提示淋巴細(xì)胞的一種克隆增生模式，或可提示疾病的進(jìn)展變化。本研究還顯示，外周血TCRγ基因重排與不典型病理表現(xiàn)無關(guān)。也有研究顯示，外周血TCRγ基因重排陽性患者均無不典型病理表現(xiàn)［7］，或未發(fā)生 CTCL［8］。因此，我們認(rèn)為皮損中TCRγ基因重排陽性比外周血更具特異性，更有意義。

研究認(rèn)為，從出現(xiàn)皮損至病理確診MF需要48～72個(gè)月［18］，本研究從患者出現(xiàn)皮損開始隨訪16～282個(gè)月。1例皮損TCRγ基因重排陽性的大斑塊型患者在隨訪第18個(gè)月時(shí)通過組織病理確診進(jìn)展為MF，且其前后兩次組織病理顯示其初始的不典型表現(xiàn)逐步發(fā)展為典型早期MF的病理特點(diǎn)。既往研究顯示，10%～46%大斑塊型可進(jìn)展為MF［4，17］。Simon等［2］對12例大斑塊型患者平均隨訪9年，1例發(fā)展為MF，且為皮損TCRγ基因重排陽性者。V?kev?等［17］對36例大斑塊型患者平均隨訪6年，35%進(jìn)展為MF，其中16%早期組織病理有不典型表現(xiàn)，但研究未進(jìn)行基因重排檢測。Bernier等［7］長期隨訪發(fā)現(xiàn)，皮損TCR基因重排陽性的大斑塊型進(jìn)展為MF的概率是單純根據(jù)臨床病理診斷者的4倍［9］。因此，我們認(rèn)為同時(shí)有皮損TCRγ基因重排陽性及不典型病理表現(xiàn)的大斑塊型應(yīng)與其他大斑塊型區(qū)分開來，認(rèn)為其有更高的概率發(fā)展為MF，二者結(jié)合對預(yù)測患者進(jìn)展為MF有較大幫助，應(yīng)加強(qiáng)對這類患者的隨訪觀察。

盡管WHO分類認(rèn)為小斑塊型為良性疾病，但也有較多進(jìn)展為MF的報(bào)道。本研究雖然病例數(shù)少，但顯示小斑塊型患者外周血TCRγ基因重排陽性率較高。Muche等［8］和Klemke等［3］研究顯示，小斑塊型患者外周血TCR基因重排陽性率較高，分別為64.3%、40%，但其實(shí)際臨床意義尚未明確，被稱為“未確定意義的T細(xì)胞克隆”。75歲以上正常老年人可出現(xiàn)外周血TCR基因重排陽性［19］，但本研究3例患者均為75歲以下，故其臨床意義仍需進(jìn)一步研究。V?kev?等［17］平均隨訪10年，發(fā)現(xiàn)10%小斑塊型進(jìn)展為MF，但未進(jìn)行TCR基因重排檢測。本研究隨訪時(shí)間內(nèi)未發(fā)現(xiàn)進(jìn)展為MF的小斑塊型患者。Belousva等［5］報(bào)道1例小斑塊型進(jìn)展為MF，該患者的外周血及新發(fā)生的斑塊皮損TCRγ基因重排陽性，而陳舊斑片皮損為陰性，鑒于小斑塊型外周血TCRγ基因重排陽性率較其他臨床類型及皮損處高，我們認(rèn)為對伴有不典型病理表現(xiàn)的小斑塊型病例，應(yīng)當(dāng)重視對其隨訪。

本研究9例點(diǎn)滴型患者皮損TCRγ基因重排檢測中有3例陽性。Shieh等［10］研究顯示，點(diǎn)滴型皮損TCR基因重排陽性率為50%，這種差異可能是樣本量較小所致。此外，本研究1例點(diǎn)滴型患者的外周血TCRγ基因重排陽性，相對其他臨床類型也無明顯差異。本研究顯示，點(diǎn)滴型患者TCRγ基因重排陽性率相對低，且臨床過程多呈現(xiàn)良性慢性反復(fù)，有痊愈病例，無進(jìn)展為MF的病例。既往文獻(xiàn)缺乏對點(diǎn)滴型患者TCR基因重排的分析，也鮮有點(diǎn)滴型進(jìn)展為MF的案例［6］。因此，我們認(rèn)為點(diǎn)滴型并非早期MF，但其TCRγ基因重排陽性的意義仍需進(jìn)一步研究。

本研究顯示，副銀屑病患者的TCRγ基因重排陽性與性別、年齡、病程、臨床類型無明顯相關(guān)性，但皮損TCRγ基因重排與不典型病理表現(xiàn)顯著相關(guān)。隨訪中1例發(fā)展為MF，提示副銀屑病尤其是斑塊型可能與MF有關(guān)。皮損TCRγ基因重排陽性結(jié)合組織病理的不典型表現(xiàn)，可更好地提示進(jìn)展為MF的可能性。這一結(jié)論還需大樣本研究證實(shí)。

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Detection of TCRγ gene rearrangements in skin lesions and peripheral blood of patients with parapsoriasis and their clinical significance

Wang Xiaoming,Xue Feng,Zheng Jie
Department of Dermatology,Ruijin Hospital,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,Shanghai 200025,China

ObjectiveTo detect TCRγ gene rearrangements in skin lesions and peripheral blood of patients with parapsoriasis,and to study their clinical significance.MethodsTotally,20 patients with parapsoriasis were included in this study.BIOMED?2 multiplex PCR was performed to detect TCRγ gene rearrangements in lesional skin（n=20）and peripheral blood（n=11）samples from the patients with parapsoriasis.Statistical analysis was performed to assess the relationship of TCRγ gene rearrangements with clinical types of parapsoriasis as well as general information and histopathological manifestations（including non?specific manifestations and atypical manifestations）of patients.ResultsTCRγ gene rearrangements were positive in lesional skin from 7 of the 20 patients,in peripheral blood from 3 of 11 patients,and in both lesional skin and peripheral blood from 2 patients.Positive TCRγ gene rearrangements in skin lesions were significantly correlated with mycosis fungoides（MF）?related atypical histopatho?logical manifestations（P＜ 0.05）,but those in neither skin lesions nor peripheral blood were correlated with gender and age of patients or clinical course and types of parapsoriasis（allP＞ 0.05）.During an average follow?up time of 44.85 ±18.48 months,1 case progressed into MF,and 2 were cured.Conclusions Positive TCRγ gene rearrangements in skin lesions of patients with parapsoriasis may be correlated with MF?related atypical manifestations.The presence of TCRγ gene rearrangements and atypical histopathological manifestations may suggest the possibility of progression from parapsoriasis into MF.

Parapsoriasis;Gene rearrangement,gamma?chain T?cell antigen receptor;Mycosis fungoides

Zheng Jie,Email:jie?zheng2001@126.com

鄭捷，Email：jie?zheng2001@126.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2016.08.010

2015?11?19）

（本文編輯：周良佳 顏艷）