吳高芬，李慧敏

（湖南省岳陽市食品藥品檢驗(yàn)所，湖南岳陽414000）

柱后碘衍生法熒光檢測黃曲霉毒素的方法探討

吳高芬，李慧敏

（湖南省岳陽市食品藥品檢驗(yàn)所，湖南岳陽414000）

目的優(yōu)化柱后碘衍生法檢測中藥材中黃曲霉毒素G2，G1，B2，B1的含量。方法樣品經(jīng)甲醇-水（70∶30）提取后，通過免疫親和柱凈化、柱后碘衍生高效液相色譜-熒光檢測器測定。結(jié)果在優(yōu)化條件下，黃曲霉毒素G2、G1、B2、Bl的檢出限分別為0.20，0.05，0.15，0.02 g/kg，回收率分別為78.63%，81.75%，79.47%，80.70%。結(jié)論該方法簡便快速，靈敏度高，重復(fù)性好，可滿足中藥材中黃曲霉毒素含量檢測的需要。

黃曲霉毒素G2，G1，B2，B1；免疫親和柱；柱后碘衍生法；高效液相色譜法；熒光檢測器

黃曲霉毒素是真菌毒素重要代表之一，為至今發(fā)現(xiàn)的毒性最大的真菌毒素，被世界衛(wèi)生組織（WHO）的癌癥研究機(jī)構(gòu)認(rèn)定為ⅠA級危險(xiǎn)物，是世界公認(rèn)的3大強(qiáng)致癌物質(zhì)之一［1］，對肝臟有劇毒，并有致畸、致突變、致癌的作用。中藥材在儲存加工中易滋生黃曲霉毒素及受黃曲霉毒素污染，隨著老百姓對食品、藥品安全性要求的不斷提高，國家食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）對食品、藥品中安全性指標(biāo)的限量檢測越來越重視，提高中藥材質(zhì)量，保證中藥產(chǎn)品質(zhì)量安全變得尤為重要。目前，黃曲霉毒素的檢測方法主要有GB/T 18979-2003食品中黃曲霉毒素的測定方法，另外，2010年版《中國藥典（一部）》收載了黃曲霉毒素的測定方法。筆者曾嘗試使用多種品牌的色譜柱，發(fā)現(xiàn)其檢測線性范圍均較窄，峰變形嚴(yán)重，導(dǎo)致檢驗(yàn)結(jié)果不可靠，經(jīng)改變流動(dòng)相的組成，并用流動(dòng)相稀釋對照品溶液及樣品，可擴(kuò)大線性范圍，改善峰形，適用于陳皮、酸棗仁等中藥材中黃曲霉毒素測定?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1　儀器與試藥

1.1儀器

Agilent 1260 Infinity型高效液相色譜儀（熒光檢測器G1314F，1260VWD）；Mettler Toledo XS-105型電子天平（d=0.01 mg/0.1 mg）；上海FLUKO JJ-2型組織搗碎勻漿機(jī)。

1.2試藥

黃曲霉毒菌B1，B2，G1，G2混標(biāo)（上海安譜科學(xué)儀器有限公司，批號為212127，含量為98%，黃曲霉毒素B1和G1分別為0.996 3 mg/L和0.998 0 mg/L，黃曲霉毒素B2和G2分別為0.301 3 mg/L和0.300 2 mg/L；規(guī)格為每支1 mL）；黃曲霉菌G2，G1，B2，B1單標(biāo)（上海安譜科學(xué)儀器有限公司，批號分別為207386，188627，213099，216773，3 mg/L，含量98%，規(guī)格為每支1 mL）；免疫親和柱（AflaStarTMR，Romer Labs公司）；甲醇為色譜純（Tedia公司）；水為超純水；碘為分析純；樣品來源于本檢驗(yàn)所抽驗(yàn)品。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱：Agilent XDB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（45∶55）［2-3］；激發(fā)波長：360 nm；發(fā)射波長：450 nm；流量：0.8 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：對照品5～30 μL，樣品20 μL；衍生溶液流速：每分鐘0.3 mL；衍生反應(yīng)管溫度：70℃。

2.2溶液制備

對照品溶液：精密量取上述混標(biāo)溶液0.5 mL置10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，作為貯備液；精密量取貯備液1 mL置25 mL容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，即得對照品溶液。

衍生溶液［4］：取碘0.50 g，加入甲醇100 mL使溶解，用水稀釋至1 000 mL，制成0.05%的碘溶液。

供試品溶液：取樣品粉末（過2號篩）15 g，加入氯化鈉3 g，置均質(zhì)瓶中，精密加入70%甲醇溶液75 mL，高速攪拌2 min，離心5 min，精密量取上清液15 mL，置50 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，量取續(xù)濾液20.0 mL，通過免疫親和柱，流速為3 mL/min，用水20 mL洗脫，將洗脫液棄去，使空氣進(jìn)入柱內(nèi)，將水?dāng)D出柱子，再用甲醇1.5 mL洗脫，收集洗脫液，置2 mL容量瓶中，并用水稀釋至刻度［5］，搖勻，即得供試品溶液。

2.3方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：采用陳皮代替試驗(yàn)樣品，按供試品溶液制備方法制備不含黃曲霉毒素的空白溶液。按擬訂色譜條件，取空白溶液、2.2項(xiàng)下對照品溶液及供試品溶液依法進(jìn)樣測定。結(jié)果見圖1。黃曲霉毒素峰形受溶劑效應(yīng)影響，建議用流動(dòng)相溶解，或純甲醇溶解后縮小進(jìn)樣體積（5～15 μL），分別采用純甲醇及流動(dòng)相溶解后不同進(jìn)樣體積峰型的比較見圖2。用純甲醇溶解，當(dāng)進(jìn)樣量為15 μL時(shí)，黃曲霉毒素G2，G1，B2，B1開始向右傾斜，其中G2和G1變形較嚴(yán)重，當(dāng)進(jìn)樣量為20 μL時(shí)，G2，G1，B2，B1嚴(yán)重變形；改用流動(dòng)相溶解，當(dāng)進(jìn)樣量為30 μL時(shí)，峰形依然符合《中國藥典（一部）》的要求。

線性關(guān)系考察：吸取2.2項(xiàng)下對照品溶液5，10，15，20，25，30 μL注入液相色譜儀，依法測定峰面積。以對照品進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程見表1。

重復(fù)性試驗(yàn)：吸取2.2項(xiàng)下對照品溶液，精密稱取，連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量為20 μL，測定峰面積。結(jié)果黃曲霉毒素G2，G1，B2，B1峰面積的RSD分別為0.6%，0.9%，0.8%，1.0%（n=6），表明方法重復(fù)性較好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：吸取2.2項(xiàng)下對照品溶液，精密稱取，分別于0，2，4，6，8 h時(shí)進(jìn)樣20 μL，測定峰面積。結(jié)果黃曲霉毒素G2，G1，B2，B1峰面積的RSD分別為0.8%，1.2%，0.6%，1.1%（n=5），表明黃曲霉毒素在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

圖1　黃曲霉毒素高效液相色譜圖

圖2　溶劑影響高效液相色譜圖

表1　黃曲霉毒素的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍（n=6）

加樣回收試驗(yàn)（陳皮）：取供試品5 g（含黃曲霉毒素B10.5 μg/kg，黃曲霉毒素G2，G1，B2均未檢出），共6份，分別精密加入貯備液（3 ng/mL）。配制方法：分別精密量取黃曲霉菌單標(biāo)100 μL置100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，適量，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液。依法測定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表2。

2.4檢測限考察

吸取2.2項(xiàng)下對照品溶液2 μL，依法進(jìn)樣測定。黃曲霉毒素G2，G1，B2，B1方法檢出限（S/N=3）分別為0.2，0.05，0.15，0.02 μg/kg。結(jié)果見圖3。

表2　陳皮加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

3　討論

曾按照2010年版《中國藥典（一部）》附錄ⅨⅤ黃曲霉毒素測定法，即高效液相色譜柱后碘衍生化法測定樣品，采用Phenomenex Luna C18柱（200 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters SymmetryC18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent Zorbax SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）等不同品牌的色譜柱測定桃仁、酸棗仁、陳皮、胖大海等黃曲霉毒素的含量，進(jìn)樣量在5～15 μL較正常，20 μL開始嚴(yán)重變形，分離度及對稱性已達(dá)不到檢測要求。但改用流動(dòng)相稀釋至刻度，25 μL峰形均符合檢測要求，30 μL峰形依然符合檢測要求，甚至50 μL也能達(dá)檢測要求。

圖3　檢測限高效液相色譜圖

采用2010年版《中國藥典（一部）》收載流動(dòng)相與本文流動(dòng)相稀釋最終進(jìn)樣的供試品溶液與對照品溶液，均可達(dá)文中圖譜效果，但本研究所載流動(dòng)相配制簡單，重復(fù)性較好。

［1］曲秋穎，鮑蕾，石媛螈，等.黃曲霉毒素的檢測技術(shù)及預(yù)防措施［J］.農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊，2011（8）：87.

［2］GB/T 18979-2003，食品中黃曲霉毒素的測定免疫親和層析凈化高效液相色譜法和熒光光度法［S］.

［3］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（四部）［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：401.

［4］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄ⅥB.

［5］許勇，王少敏，毛丹，等.HPLC-MS/MS測定綠豆中黃曲霉毒素G2、G1、B2、B1［J］.齊魯藥事，2011，30（7）：381.

Detection of Aflatoxins in Chinese Medicinal Herbs by Post-Column Derivatization and HPLC-FLD

Wu Gaofen，Li Huimin
（Yueyang Institute for Food and Drug Control，Yueyang，Hunan，China414000）

ObjectiveTo optimize a method for the content determination of aflatoxin G2，G1，B2，B1.MethodsThe samples were extracted with 70%methanol，and cleaned up by immunoafinity columns.The separation of aflatoxin G2，G1，B2，B1were conducted by HPLC-FLD.ResultsUnder optimum conditions，the limits of detection of aflatoxin G2，G1，B2，B1were 0.20，0.05，0.15，0.02 μg/kg respectively and the recoveries of aflatoxin G2，G1，B2，B1were 78.63%，81.75%，79.47%，80.70%.ConclusionThe method is simple，high sensitive and good repeatability，which is suitable for the determination of aflatoxins in Chinese medicinal herbs.

aflatoxin G2，G1，B2，B1；imnmnoafinity column；post-column derivatization；HPLC；fluorescence detector

R284.1；R286.0；R282.71

A

1006-4931（2016）18-0064-04

（2016-04-20）