賈佳，林智，曾密，2，李慧，2，張謙，王劍英，郭宏濤

（1.深圳市綠微康生物工程有限公司，廣東深圳518055；2.深圳技師學院，廣東深圳518116）

產(chǎn)脂肪酶黑曲霉原生質(zhì)體NTG誘變研究

賈佳1，林智1，曾密1，2，李慧1，2，張謙2*，王劍英1，郭宏濤1

（1.深圳市綠微康生物工程有限公司，廣東深圳518055；2.深圳技師學院，廣東深圳518116）

以黑曲霉Aspergillus niger G27為初始菌株，制備原生質(zhì)體。用亞硝基胍（NTG）對所制備的原生質(zhì)體進行誘變，考察誘變效果。收集斜面菌絲體，經(jīng)復合酶處理制備原生質(zhì)體，分別于1×10-3mmol/mL NTG溶液中誘變處理0～60 min，考察菌株的死亡率、菌落變異率和產(chǎn)脂肪酶活性等。結(jié)果表明，原生質(zhì)體再生率為7.5%。隨著誘變時間增加，原生質(zhì)體誘變死亡率、菌落變異率增加，并逐漸趨于穩(wěn)定。初篩結(jié)果為隨著誘變時間增加，脂肪酶活性標平均值降低，標準偏差值增加，變異系數(shù)值增加。NTG誘變時間為20～40 min時，出現(xiàn)比較多的正變菌株。經(jīng)過復篩和驗證試驗，得到P316菌株脂肪酶活性為（394.3±12.9）U/mL，比出發(fā)菌株發(fā)酵酶活高22.9%；P388菌株為（385.1±11.4）U/mL，比出發(fā)菌株發(fā)酵酶活高20.1%?？梢姴捎肗TG誘變菌株的原生質(zhì)體獲得良好的誘變效果，結(jié)合篩選獲得了2株遺傳穩(wěn)定的高產(chǎn)突變菌株。

脂肪酶；黑曲霉；原生質(zhì)體；誘變

脂肪酶是動物體內(nèi)脂肪代謝的關(guān)鍵酶，廣泛應用于飼料中（張志敏等，2013）。黑曲霉（Aspergillus niger）是具有重要工業(yè)價值的菌種，主要應用于生物酶制劑生產(chǎn)、有機酸發(fā)酵等，可產(chǎn)生脂肪酶、淀粉酶、酸性蛋白酶、纖維素酶、果膠酶、葡萄糖氧化酶等30多種酶制劑（郭艷梅等，2010）。對于黑曲霉菌種的改造技術(shù)主要集中在基因工程改造、理化因子誘變育種和原生質(zhì)體制備、融合、誘變等（張謙等，2014；張慶慶等，2008；Khattab等，2005）。原生質(zhì)體制備技術(shù)是通過溶菌酶去除細胞外壁障礙，從而對各種外界誘變劑更加敏感，利用原生質(zhì)體直接誘變獲得變異株，可以有效提高菌種產(chǎn)酶量，改進酶質(zhì)量（李秀珍等，2007；Ferenczy等，1974）。王春麗等（2009）以產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的黑曲霉3-3 M為供試菌株，通過原生質(zhì)體紫外線誘變，選育得到一株活力較高的突變株60B-3D。該菌株具有良好的遺傳穩(wěn)定性，酶活力平均達到23 IU/mL，與出發(fā)菌株相比產(chǎn)量提高39%。陳林等（2011）以果膠酶產(chǎn)生菌黑曲霉EIM6為出發(fā)菌株，獲得高質(zhì)量的原生質(zhì)體。采用紫外誘變和亞硝基胍（NTG）誘變，篩選獲得兩株果膠酶突變株，酶活力分別提高了47.21%和47.82%。

本試驗以黑曲霉A niger G27為出發(fā)菌株，制備原生質(zhì)體，采用NTG對菌株原生質(zhì)體進行誘變，考察誘變效果和產(chǎn)脂肪酶活性，通過篩選獲得高產(chǎn)脂肪酶菌株。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1菌株來源黑曲霉Aspergillus niger，為深圳綠微康生物工程有限公司提供的生產(chǎn)菌株，現(xiàn)保藏于公司酶制劑研究中心，保藏號：A.niger G27。

1.1.2試劑和儀器主要試劑：蔗糖、葡萄糖、瓊脂、NTG等培養(yǎng)基所用試劑均為國產(chǎn)化學級試劑。原生質(zhì)體制備所用纖維素酶為Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；蝸牛酶和溶菌酶為Amresco公司的生化試劑。SDS-PAGE分析和脂肪酶活性測定所用試劑為分析純試劑，蛋白Marker為美國thermo公司產(chǎn)品。儀器：凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備廠；PHS-25型酸度計，杭州科曉化工儀器設(shè)備有限公司；Avanti J-30I高效離心機，美國貝克曼庫爾特有限公司；TS-3112雙層大容量搖床，上海儀純實業(yè)有限公司；JY600凝膠電泳儀，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。

1.1.3培養(yǎng)基再生培養(yǎng)基（YPD）：酵母膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，以0.6 mol/mL NaCl配制，定容至1000 mL，pH 7.0。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，NaNO35g，NaH2PO40.5 g，K2SO40.1 g，蒸餾水定容至1000 mL，pH 7.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，玉米淀粉6 g，豆粕20 g，橄欖油5 g，NaNO35 g，NaH2PO41 g，K2SO40.2 g，CaCO35 g，蒸餾水定容至1000 mL，pH 7.2。

1.2試驗方法

1.2.1原生質(zhì)體制備將斜面種子用接種針取1環(huán)接種于裝有30 mL液體察氏培養(yǎng)基（含0.1%甘氨酸）的250 mL搖瓶，于30℃恒溫，220 r/min振蕩培養(yǎng)14～20 h（菌絲生長對數(shù)生長期），收集培養(yǎng)液。10000 r/min、4℃低溫下離心5 min，收集菌絲體。用高滲磷酸緩沖液（含1 mol/L山梨醇，pH 6.5）洗滌離心3次，定容至10 mL備用。將制備好菌絲體，加入等體積的混合酶液（1%纖維素酶，0.5%蝸牛酶，0.1%溶菌酶用高滲磷酸緩沖液配制），于30℃恒溫振蕩培養(yǎng)，孵育2～2.5 h終止酶反應，用脫脂棉過濾掉菌絲體，以血球計數(shù)板進行原生質(zhì)體鏡檢計數(shù)。取原生質(zhì)體液分為兩組，分別用高滲磷酸緩沖液和蒸餾水洗滌離心，離心條件為500 r/min、4℃低溫下離心5 min，收集原生質(zhì)體。稀釋涂布于再生培養(yǎng)基平皿培養(yǎng)，測定原生質(zhì)體純度和再生率（姚婷婷和王正祥，2006）。

1.2.2NTG誘變原生質(zhì)體方法取制備好原生質(zhì)體懸液4 mL（原生質(zhì)體個數(shù)為2.5×106個/mL）于50 mL三角瓶中，加入6 mL的NTG溶液（最終濃度為1×10-3mmol/mL，以高滲磷酸緩沖液配制）充分混合。于30℃恒溫水浴處理0～60 min，0 min為對照，20、40、60 min取樣，分別于500 r/min、4℃低溫下離心5 min，然后用高滲磷酸緩沖液洗滌后離心，終止NTG誘變反應。分別稀釋涂布于再生培養(yǎng)基平皿培養(yǎng)。

1.2.3篩選方法原生質(zhì)體以再生培養(yǎng)基平皿培養(yǎng)后所形成的菌落為再生菌落。原生質(zhì)體經(jīng)過NTG誘變后形成的誘變菌落數(shù)與原生質(zhì)體未經(jīng)過誘變的對照菌落數(shù)的比值來計算誘變的死亡率。

將經(jīng)過NTG誘變后形成的異常型菌落，包括：異常大小菌落、邊緣不整齊菌落、顏色變異菌落、不產(chǎn)孢子菌落等與所形成的總菌落數(shù)進行比值，計算菌落變異率。

挑選正常型菌落用消毒牙簽取少許菌體接種于固體鑒別培養(yǎng)基平皿（Kouker和Joeger，1987），根據(jù)菌落所形成的熒光圈大小，判斷該菌落產(chǎn)脂肪酶的活性，實施菌落的初篩；同時對G27菌株的斜面分生孢子進行自然分離，挑選正常型菌落作為初篩對照（CK）。對于初篩得到的高產(chǎn)菌株的菌落轉(zhuǎn)接斜面，進行3批搖瓶復篩，每一批平行進行3瓶，測定菌株的產(chǎn)脂肪酶活性（張謙等，2014）。

1.2.4驗證試驗經(jīng)過復篩得到的高產(chǎn)脂肪酶菌株進行斜面?zhèn)鹘?代，實施搖瓶發(fā)酵，測定菌株經(jīng)過傳代后的產(chǎn)酶活性，考察菌株的遺傳穩(wěn)定性。

1.3脂肪酶活性測定方法固體鑒別培養(yǎng)基檢測脂肪酶活性方法：主要針對于菌落的快速檢測，在再生培養(yǎng)基中添加1.2 g/L三丁酸甘油脂和1.0 mg/mL羅丹明B（Rhodamine B，Sigma）構(gòu)成固體鑒別培養(yǎng)基，產(chǎn)脂肪酶的菌落在該培養(yǎng)基上可以形成淺黃色熒光圈，并判斷菌落產(chǎn)脂肪酶的活性（Kouker等，1987）。

堿滴定法測定脂肪酶活性方法：取1 mL發(fā)酵液上清液，加入5 mL橄欖油和4 mL甘氨酸-NaCl緩沖液（pH 9.4，50 mmol/L）振蕩混勻，在36℃孵育15 min，加入20 mL的95%乙醇和10 mL的30%NaCl溶液終止反應。脂肪酶活性單位定義：在一定溫度和pH條件下，1 min水解底物產(chǎn)生1 μmol可滴定的脂肪酸，為1個酶活單位，以U/mL表示（Tian等，2013）。

2　結(jié)果

2.1原生質(zhì)體制備結(jié)果以Aspergillus niger G27為出發(fā)菌株，經(jīng)復合酶制備的原生質(zhì)體分別用蒸餾水和高滲磷酸緩沖液洗滌，結(jié)果表明：使用蒸餾水處理的培養(yǎng)平皿未見到菌落出現(xiàn)，說明所制備原生質(zhì)體受到水沖擊全部破裂，所制備的原生質(zhì)體純度為100%；用高滲磷酸緩沖液洗滌的培養(yǎng)平皿生長出再生菌落，通過與顯微鏡鏡檢原生質(zhì)體計數(shù)比值，得到原生質(zhì)體再生率為7.5%。

2.2NTG誘變死亡率結(jié)果采用NTG分別對于G27菌株原生質(zhì)體進行誘變，考察在不同誘變時間下再生菌株的誘變死亡率，結(jié)果見圖1。由圖1可見，原生質(zhì)體在不同NTG誘變時間下，隨著誘變時間增加，死亡率隨之增加；誘變時間≥40 min時，原生質(zhì)體的死亡率＞90%。

圖1　NTG誘變對G27菌株原生質(zhì)體的致死效果

2.3NTG誘變菌落變異率結(jié)果菌株經(jīng)過再生培養(yǎng)和NTG誘變得到的正常型菌落直徑為1.5～ 2 mm，顏色白色，邊緣整齊。異常型菌落主要是小菌落和邊緣不整齊的菌落。菌落變異率結(jié)果見圖2。由圖2可見，原生質(zhì)體在不同NTG誘變時間下，隨著誘變時間增加，菌落變異率隨之增加；誘變時間≥80 min時，菌落變異率趨于穩(wěn)定。對G27菌株斜面分生孢子進行自然分離，菌落自然變異率為4.2%。

圖2　NTG誘變對G27菌株原生質(zhì)體菌落變異的影響

2.4NTG誘變篩選結(jié)果

2.4.1原生質(zhì)體誘變后產(chǎn)脂肪酶初篩結(jié)果經(jīng)過NTG誘變原生質(zhì)體進行培養(yǎng)，挑選正常型菌落進行產(chǎn)脂肪酶初篩。對G27菌株斜面分生孢子進行自然分離，挑選出單菌落實施初篩作為篩選的對照組（CK）。初篩以高出CK平均值的為正變菌株，挑選出該菌落接種斜面進行復篩（表1）。

表1　G27菌株初篩結(jié)果分析

由表1所示，G27菌株經(jīng)過制備原生質(zhì)體后初篩，未經(jīng)過誘變的原生質(zhì)體（NTG 0 min）產(chǎn)酶活性相比CK顯著降低，標準差增加，CV增加。隨著NTG誘變時間的增加，逐漸降低，標準差增加，CV增加。NTG 20～40 min誘變時，出現(xiàn)比較多的正變菌株。

2.4.2原生質(zhì)體誘變后產(chǎn)脂肪酶復篩結(jié)果G27菌株經(jīng)過初篩和3批復篩有2株菌的產(chǎn)酶活性顯著高于G27（表2）。

表2　G27菌株復篩結(jié)果

2.5驗證試驗將篩選得到的P316和P388菌株斜面連續(xù)傳接5代，進行發(fā)酵，考察新菌株的遺傳穩(wěn)定性。結(jié)果表明，傳代斜面生長正常，表面產(chǎn)孢子比較豐富，由表3可見，兩個菌株產(chǎn)脂肪酶活性分別為：P316菌株為（397.8±10.7）U/mL，CV值為4.62%；P388菌株為（386.3±7.8）U/mL，CV 2.71%，說明該菌株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

表3　菌株的斜面?zhèn)鞔a(chǎn)脂肪酶活性比較U/mL

3　討論

原生質(zhì)體一般是由對數(shù)生長期細胞制得，活力較強，對于環(huán)境和誘變劑較為敏感，破壁和再生過程中又淘汰了大量弱勢菌株，能夠再生的菌株初級代謝與次生代謝過程均較活躍，正變菌株比例增大（杜海英等，2006）。本研究中原生質(zhì)體（NTG 0 min）與自然分離菌株（CK）比較發(fā)現(xiàn)，菌株經(jīng)過制備原生質(zhì)體產(chǎn)酶值顯著降低，但是標準差和CV增加，說明，菌株通過制備原生質(zhì)體，可以使得產(chǎn)酶分布增寬，增加出現(xiàn)高產(chǎn)突變株的概率。

NTG對于細胞的誘變機制是烷基化作用，通過改變基因的分子結(jié)構(gòu)，主要是GC-AT轉(zhuǎn)換，小片段基因切除、移碼突變及GC對的缺失等，形成基因突變，因此NTG又有超誘變劑之稱（彭燕等，2007；施巧琴和吳松剛，2003）。本研究采用NTG誘變原生質(zhì)體，在低劑量時細胞的誘變死亡率較低，菌落變異率較低，隨著誘變劑量增加，菌株的誘變死亡率和菌落變異率逐漸提高。結(jié)合產(chǎn)脂肪酶篩選，可見在NTG誘變20～40 min，誘變死亡率為20%～80%時，菌落變異率為9%左右時，出現(xiàn)了較多的產(chǎn)脂肪酶正變菌株。說明，NTG誘變原生質(zhì)體在亞致死劑量下，有利于出現(xiàn)高產(chǎn)變異株。而高誘變劑量會提高誘變致死率和菌落形態(tài)的變異，但是，出現(xiàn)產(chǎn)脂肪酶正變菌株數(shù)量減少。

4　結(jié)論

本研究以黑曲霉Aspergillus niger G27為出發(fā)菌株，制備原生質(zhì)體，并進行NTG誘變，結(jié)果菌株經(jīng)過制備原生質(zhì)體可使菌株的產(chǎn)酶分布增寬，增加出現(xiàn)高產(chǎn)突變株的概率，有利于篩選。NTG誘變原生質(zhì)體，當NTG在亞致死劑量下，菌株的產(chǎn)脂肪酶分布發(fā)生改變，出現(xiàn)較多的正變菌株。采用NTG溶液誘變處理40 min的原生質(zhì)體組得到兩株高產(chǎn)菌株，P316菌株脂肪酶活性為（394.3±12.9）U/mL，比出發(fā)菌株發(fā)酵酶活高22.9%；P388菌株為（385.1±11.4）U/mL，比出發(fā)菌株發(fā)酵酶活高20.1%。結(jié)果表明，采用NTG誘變菌株的原生質(zhì)體，獲得良好的誘變效果，結(jié)合篩選和驗證獲得了2株遺傳穩(wěn)定的脂肪酶高產(chǎn)突變菌株。

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The mutagenic effects of NTG on the protopasts from Aspergillus niger G27 was investigated in this study. The protoplasts were firstly produced by complex enzyme treatment of the mycelium，which were collected from slant cultures.After treatmented by 1×10-3mmol/mL NTG for 0～60 min，the mortality mutation rate and the lipase activity of the stain was studied.The regeneration rate of protoplast was 7.5%.The mortality，mutation rate of protoplast increase along with the increase of NTG dose，and then became stable.Accroding to the increase of the NTG dose，the average lipase activity，standard deviation value and the coefficient of variation increased.After screening，two high yield and stable heredity strains was obtained，the P316 strain and the P388 stain，of which yield were（394.3±12.9）U/mL with 22.9%higher than G27 and（385.1±11.4）U/mL with 20.1%higher than G27 respectively.Protoplasts with NTG mutagenesis was demonstrated to improve the efficiency of positive mutant，and have more stable heredity strain.

lipase；Aspergillus niger；protoplast；mutagenesis

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20161502

S816.7

A

1004-3314（2016）15-0009-04

國家海洋經(jīng)濟創(chuàng)新發(fā)展區(qū)域示范專項項目（SZHY2013-B01-01）；深圳市科技創(chuàng)新委員會技術(shù)創(chuàng)新計劃項目（CXZZ20130425111508558）