郝魯江，盧曉平，許艷蕊，范秋蘋

（齊魯工業(yè)大學(xué)山東省微生物工程重點實驗室，山東濟(jì)南250353）

科學(xué)實驗研究

角蛋白酶制備羽毛蛋白粉的工藝研究

郝魯江*，盧曉平，許艷蕊，范秋蘋

（齊魯工業(yè)大學(xué)山東省微生物工程重點實驗室，山東濟(jì)南250353）

為研究角蛋白酶對羽毛蛋白粉的降解效果，采用不同的酶解溫度、初始酶解液pH、酶添加量和酶解時間對羽毛蛋白粉進(jìn)行酶解，并利用正交試驗對酶解條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：每克羽毛粉加入角蛋白酶0.03 g，酶解液初始pH為7，在35℃下酶解36 h。羽毛分解率達(dá)到50.5%，酶解液可溶性蛋白含量為225.7 mg/L，而酶解羽毛蛋白粉的胃蛋白酶體外消化率為23%，顯示了角蛋白酶具有很好的酶解效果。

角蛋白酶；羽毛蛋白粉；可溶性蛋白；飼料

羽毛是家禽加工企業(yè)生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的廢棄物，直接丟棄不僅浪費了寶貴的蛋白質(zhì)資源，同時也對環(huán)境造成了污染（陳循軍，2008）。家禽羽毛含粗蛋白質(zhì)85%～90%，其中90%是角蛋白，各種氨基酸總量在70%以上，且其中包含多種必需氨基酸，是一種良好的飼料蛋白來源（葉亞建，1997）。角蛋白的肽鏈?zhǔn)且驭?螺旋和β-片層結(jié)構(gòu)組成的，通過二硫鍵、氫鍵和其他交聯(lián)鍵作用形成非常穩(wěn)定的高度交聯(lián)的三維結(jié)構(gòu)（曾毅，2004）。因此尋找一種有效降解角蛋白的方法成為了開發(fā)利用家禽羽毛的基礎(chǔ)。

本試驗采用角蛋白酶對家禽羽毛進(jìn)行酶解，并利用正交試驗對酶解參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得最優(yōu)工業(yè)條件，為家禽羽毛的工業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料及方法

1.1材料與設(shè)備雞羽毛，從家禽屠宰廠獲得。角蛋白酶：100000 U/g（濟(jì)南諾能生物工程有限公司）；1 mol/L NaOH溶液；1 mol/L HCL溶液；蒸餾水；考馬斯亮藍(lán)試劑（稱取100 mg考馬斯亮藍(lán)G-250溶于50 mL 95%乙醇中，加入100 mL 85%磷酸，加蒸餾水稀釋至1000 mL）；蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液（結(jié)晶牛血清蛋白，預(yù)先經(jīng)微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，根據(jù)其純度配制成100 μg/mL的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液）；胃蛋白酶（蛋白酶實際效價為1∶3000）。

立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器（LDZX-40BI型，上海申安醫(yī)療器械廠）、恒溫培養(yǎng)搖床（ZWY-240型，上海智誠分析儀器制造有限公司）、可見分光光度計（752型紫外可見分光光度計，上海精密科學(xué)儀器有限公司）、恒溫干燥箱（DHG-9140A型，上海精宏實驗設(shè)備有限公司）、微量電子天平（AL104型，北京賽多利斯天平有限公司）等。

1.2試驗方法

1.2.1羽毛的預(yù)處理及羽毛樣品的制備從家禽場中獲得的羽毛清洗后除雜，置于高壓蒸汽滅菌鍋中（121℃、40 min），80℃烘干12 h后粉碎，貯存?zhèn)溆茫ㄖx藍(lán)華，2012）。

1.2.2可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)含量，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，測定波長為595 nm，計算可溶性蛋白含量（μg/g）及羽毛分解率（%），繪制曲線。蛋白質(zhì)含量的計算方法如下：

式中：W為由標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線上查得的蛋白質(zhì)質(zhì)量，μg；1.0為吸取提取液體積，mL；V為提取液總體積，mL；m為稱取試樣質(zhì)量，g。

1.2.3酶解液中氨基酸成分的測定使用Biochrom（百康）30+全自動氨基酸分析儀對酶解液中含有的各種氨基酸進(jìn)行分析。

1.2.4單因子試驗確定最佳酶解條件取18個250 mL三角瓶，6個處理組，每組3個重復(fù)組，每瓶加100 mL蒸餾水和1g羽毛粉樣品（符人源，2010）。

酶解溫度試驗：角蛋白酶添加量0.06 g，調(diào)節(jié)pH為7，酶解時間24 h，酶解溫度分別為25、30、35、40、45℃，恒溫?fù)u床下反應(yīng)。

酶解液初始pH試驗：酶解溫度以上次試驗為參考，角蛋白酶添加量0.06 g，酶解時間24 h，酶解液pH分別為5、6、7、8、9、10，恒溫?fù)u床下反應(yīng)。

酶添加量試驗：酶解溫度和pH以上次試驗為參考，角蛋白酶添加量分別為0.01、0.015、0.02、0.03、0.045、0.06 g，恒溫?fù)u床下反應(yīng)。

酶解時間試驗：酶解溫度、pH、酶添加量以上次試驗為參考，酶解時間分別為4、8、14、23、38、46 h，恒溫?fù)u床下反應(yīng)。

每組試驗結(jié)束后，將酶解反應(yīng)液過濾，取過濾液測定可溶性蛋白質(zhì)含量，濾過殘渣經(jīng)烘干后稱重待用。

1.2.5正交試驗選取酶解溫度、酶解液初始pH、酶添加量和酶解時間為觀察因素，每個因素取五個水平，進(jìn)行L25（54）正交試驗（表1）。每次試驗取3個250 mL三角瓶，都加入1 g羽毛粉樣品和100 mL蒸餾水，相同條件重復(fù)3次。按照正交試驗確定的最佳酶解參數(shù)進(jìn)行酶降解試驗。

1.2.6體外消化率的測定參照國標(biāo)GB/T 17811-2008，采用酸性水中胃蛋白酶體外消化率的測定方法進(jìn)行試驗。

表1　優(yōu)化復(fù)酶水解羽毛蛋白粉正交試驗因素水平

試驗方法步驟：稱取1 g酶解羽毛粉殘渣→添加胃蛋白酶（按樣品1∶3000單位加入胃蛋白酶）→加入預(yù)熱至45℃的酸性水100 mL→將三角瓶置于45℃恒溫?fù)u床中消化16 h→反應(yīng)液過濾→烘干→稱重。

1.2.7數(shù)據(jù)分析試驗數(shù)據(jù)使用Excel軟件進(jìn)行分析計算，并對正交試驗結(jié)果進(jìn)行處理分析，計算得到R值、K值。根據(jù)R值的大小排序判斷各因素對酶解效果的影響，根據(jù)得到的K值比較確定各因素的最適水平。

2　結(jié)果與分析

2.1蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線由標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）獲得蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.0049x+0.0897，R2= 0.9818，表明線性較好，該標(biāo)準(zhǔn)曲線可用。根據(jù)方程和測得的數(shù)據(jù)可以得到可溶性蛋白含量。

圖1　蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2單因子試驗結(jié)果及分析

2.2.1酶解溫度試驗在不同溫度條件下進(jìn)行酶解羽毛粉試驗。由圖2可知，酶解溫度為35℃時，酶解液中可溶性蛋白含量最高，隨溫度的升高或降低蛋白含量都降低，因此角蛋白酶酶解羽毛粉的最適溫度為35℃。

圖2　酶解溫度對可溶性蛋白含量的影響

2.2.2酶解初始pH試驗以酶解溫度單因素試驗確定的溫度為參考，在不同pH條件下進(jìn)行酶解羽毛粉試驗，由圖3可知，酶解液初始pH為7時酶解液中可溶性蛋白含量最高，隨pH的升高或降低蛋白含量都降低，因此角蛋白酶酶解羽毛粉的最適初始pH為7。

圖3　酶解初始pH對可溶性蛋白含量的影響

2.2.3酶添加量對可溶性蛋白含量的影響以試驗確定的溫度和pH為參考，在不同的酶添加量下進(jìn)行酶解羽毛粉試驗，由圖4可知，隨酶添加量的增加可溶性蛋白含量也隨之增加，當(dāng)角蛋白酶添加量為0.03 g時，可溶性蛋白含量最高，達(dá)到165.4 mg/L。隨著酶添加量的增加可溶性蛋白含量降低，因此角蛋白酶酶解羽毛粉的最適酶添加量為0.03 g。

圖4　酶添加量對可溶性蛋白含量的影響

2.2.4酶解時間試驗以試驗確定的溫度、pH和酶添加量為參考，在不同的酶解時間下進(jìn)行試驗，由圖5可以看出，隨酶解時間的增加可溶性蛋白含量也隨之增加，當(dāng)酶解時間達(dá)到23 h時，可溶性蛋白含量為141.9 mg/L，隨著酶解時間的增加可溶性蛋白含量減少，因此角蛋白酶酶解羽毛粉的最適酶解時間為23 h。

圖5　酶解時間對可溶性蛋白含量的影響

2.3正交試驗結(jié)果從表2中的極差可以看出，在一定的范圍內(nèi)，對羽毛粉降解影響最大的是酶解時間，其次是酶解液的初始pH、酶添加量，影響最小的是酶解溫度。最優(yōu)組合為A2B2C2D5，即酶解溫度最適為35℃，最適的酶解液初始pH為7，角蛋白酶最適添加量為0.03 g，最適酶解時間為36 h，酶解液可溶性蛋白含量為225.7 mg/L。

2.4羽毛分解率在最適反應(yīng)條件下酶解羽毛粉，酶解液過濾，殘渣烘干后稱重。在最佳酶解參數(shù)下，羽毛分解質(zhì)量為505 mg，即羽毛的分解率達(dá)到50.5%。

2.5酶解羽毛粉體外消化率采用胃蛋白酶鹽酸溶液進(jìn)行體外消化率試驗（GB/T 17811-2008），試驗結(jié)果顯示酶解羽毛蛋白粉體外消化率達(dá)到了23%。

2.6酶解液氨基酸成分分析由表3可知，酶解液中含有較多的甘氨酸和苯丙氨酸，另外還含有9種常見氨基酸，表明該酶解液中氨基酸含量豐富，擁有良好的應(yīng)用價值。

3　討論

目前，制備生產(chǎn)羽毛蛋白粉的方法主要是高壓水解法、化學(xué)水解法、膨化水解法以及酶法。國內(nèi)大多采用的是高壓加溫水解法，此種方法雖然能夠打開羽毛角蛋白中的二硫鍵，提高蛋白質(zhì)在動物腸道中的降解率，但是會造成很多熱敏性氨基酸的損失（汪國和，2005），而酶法具有良好的發(fā)展前景，高建新等（2007）研究酶解羽毛蛋白粉對蛋雞生產(chǎn)性能的影響中發(fā)現(xiàn)蛋雞日糧中用酶解羽毛粉代替部分植物蛋白飼料原料是經(jīng)濟(jì)可行的。

羽毛粉加工產(chǎn)品的營養(yǎng)價值取決于加工工藝，羽毛蛋白粉的處理方式不同會導(dǎo)致羽毛蛋白粉的利用率不同（Wang，1997），選用合理的加工工藝，能夠充分釋放出羽毛粉的營養(yǎng)成分并減少加工損失。劉家永等（2003）采用膨化-水解復(fù)合工藝制備可溶性羽毛蛋白粉，并用添加2%的可溶性羽毛蛋白來喂養(yǎng)家禽，結(jié)果表明可溶性蛋白在動物體內(nèi)消化吸收率高達(dá)90%。Kim等（2002）采用化學(xué)與酶的方法評價了水解羽毛蛋白粉的效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)先用氫氧化鈉做預(yù)處理，再用酶處理羽毛會提高胃蛋白酶消化率和體外氨基酸消化率。

相對于高壓水解法和復(fù)酶酶解法處理加工蛋白粉，本方法能夠降低成本，對設(shè)備要求較低，作用條件溫和，酶解效果較好，為進(jìn)一步開發(fā)利用家禽羽毛提供了科學(xué)依據(jù)。

表2　優(yōu)化角蛋白酶水解羽毛蛋白粉正交試驗結(jié)果與分析

4　結(jié)論

本研究得到的高溫高壓預(yù)處理與角蛋白酶降解羽毛粉的最適宜工藝條件為：雞羽毛經(jīng)121℃高溫高壓處理40 min，80℃烘干，粉碎、過篩，每克羽毛粉加入角蛋白酶0.03 g，酶解液初始pH為7，在35℃下酶解36 h，羽毛分解率達(dá)到50.5%，酶解液可溶性蛋白含量為225.7 mg/L，酶解羽毛蛋白粉體外消化率達(dá)到23%，顯示了具有很好的酶解效果，并且酶解上清液中可溶性蛋白含量較高。

表3　酶解液中氨基酸種類與含量mg/100 mL

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［13］Wang X，Parsons C M.Effect of processing systems on protein quality of feather meals and hog hair meals［J］.Poultry science，1997，76（3）：491～496.■

To research the degradation effects of keratinase on feather protein powder，different reaction temperature，initial hydrolyzate pH，enzyme dosage and hydrolysis time were studied by orthogonal test.The results suggested that the optimal condition was keratinase adding level of 0.03 g，hydrolyzate initial pH of 7 and at 35℃under enzymatic 36 h. Feather decomposition rate was 50.5%and the soluble protein hydrolyzate content was 225.7 mg/L，and enzymatic digestibility of the feather protein powder in vitro was 23%.It was concluded that the enzymatic hydrolysis effects of the keratinase on feather protein powder was good.

keratinase；feather protein；soluble protein；feed

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20161501

S816.7

A

1004-3314（2016）15-0005-04

山東省自然科學(xué)基金（ZR2012CM019）