李世云，巫相宏，黃文，王淳，馬國添，閉奇

(廣西醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，南寧 530021)

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法舒地爾聯(lián)合羅格列酮對脂多糖誘導人冠狀動脈內(nèi)皮細胞MCP-1和VCAM-1表達的影響

李世云，巫相宏，黃文，王淳，馬國添，閉奇

(廣西醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，南寧 530021)

目的觀察法舒地爾聯(lián)合羅格列酮對脂多糖(LPS)誘導的人冠狀動脈(冠脈)內(nèi)皮細胞(HCAEC)血管細胞黏附因子1(VCAM-1)、單核細胞趨化因子1(MCP-1)表達的影響。方法選用體外培養(yǎng)的第3～5代HECAC進行實驗，將細胞分為空白對照組、LPS組(100 ng/mL LPS作用細胞)、法舒地爾組(10 nmol/L法舒地爾作用細胞)、羅格列酮組(10 μg/mL羅格列酮作用細胞)、LPS+法舒地爾組(先予10 nmol/L的法舒地爾干預細胞2 h后再給予100 ng/mL LPS共同干預22 h)、LPS+法舒地爾+羅格列酮組(先予10 nmol/L的法舒地爾和10 μg/mL羅格列酮干預細胞2 h后再給予濃度為100 ng/mL LPS共同干預22 h)，實時熒光定量PCR檢測各組細胞VCAM-1、MCP-1 mRNA，ELISA法檢測細胞上清液中可溶性VCAM-1、MCP-1蛋白。結(jié)果與空白對照組相比，LPS組細胞VCAM-1、MCP-1 mRNA及上清液VCAM-1、MCP-1蛋白表達高(P均<0.05)。與LPS組相比，LPS+法舒地爾組細胞VCAM-1、MCP-1 mRNA及上清液VCAM-1、MCP-1蛋白表達低(P均<0.05)。與LPS+法舒地爾組相比，LPS+法舒地爾+羅格列酮組細胞VCAM-1、MCP-1 mRNA及上清液VCAM-1、MCP-1蛋白表達低(P均<0.05)。結(jié)論法舒地爾聯(lián)合羅格列酮可協(xié)同抑制LPS誘導的HCAEC中VCAM-1、MCP-1的表達，可能與兩者共同抑制p38MAPK、NF-κB信號通路有關。

動脈粥樣硬化；人冠狀動脈內(nèi)皮細胞;血管細胞黏附因子1;單核細胞趨化因子1

動脈內(nèi)皮細胞炎癥反應及可能存在的信號通路、炎癥因子為目前動脈粥樣硬化發(fā)病機制的研究熱點。羅格列酮可通過p38MAPK信號通路抑制炎癥反應，法舒地爾可通過下調(diào)p38MAPK和NF-κB的活性從而下調(diào)MCP-1的表達[1]。本研究通過觀察法舒地爾和羅格羅酮對脂多糖(LPS)誘導的人冠狀動脈(冠脈)內(nèi)皮細胞(HCAEC)血管細胞黏附因子1(VCAM-1)、單核細胞趨化因子1(MCP-1)表達的影響，旨在觀察法舒地爾與羅格列酮是否有協(xié)同抑制血管炎癥反應的作用。

1　材料與方法

1.1材料HECAC、ECM1001培養(yǎng)基、青霉素/鏈霉素(P/S)、胎牛血清(FBS)、內(nèi)皮細胞因子(ECGs)均購自美國sciencecell公司，0.25%胰酶購自Gibco公司，LPS購自Sigma公司，法舒地爾購自天津紅日藥業(yè)股份有限公司，羅格列酮購自Alexis biochemicals公司，ELISA試劑盒購自eBioscience公司。

1.2法舒地爾、羅格列酮、LPS處理細胞方法將HCAEC從液氮罐中取出后置于37 ℃水浴箱中，溶化后立即轉(zhuǎn)移到含4 mL完全培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基的配制是500 mL ECM+25 mL FBS+5 mL ECGs+5 mL P/S)的培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第2天換液，之后每隔3 d換1次液，換液時倒凈培養(yǎng)瓶中液體，PBS沖洗2遍，加入新完全培養(yǎng)液4 mL，待細胞長滿80%左右時傳代。實驗時取第3～5代細胞，用完全培養(yǎng)基稀釋成2×105/孔種植于6孔板中，當細胞長到約80%時，將細胞分成6組：空白對照組(ECM培養(yǎng)基)、LPS組(培養(yǎng)基中加入終濃度為100 ng/mL LPS[2])、法舒地爾組(培養(yǎng)基中加入終濃度為10 nmol/L法舒地爾[3])、羅格列酮組(培養(yǎng)基中加入終濃度為10 μg/mL羅格列酮[4])、LPS+法舒地爾組(先予終濃度為10 nmol/L的法舒地爾干預2 h后再給予終濃度為100 ng/mL LPS共同干預22 h)、LPS+法舒地爾+羅格列酮組(先予終濃度為10 nmol/L的法舒地爾和濃度為10 μg/mL羅格列酮干預2 h后再給予終濃度為100 ng/mL LPS共同干預22 h)。上述細胞均于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，所有細胞的RNA、上清液均被收集保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.3細胞VCAM-1、MCP-1 mRNA檢測方法RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄分別使用TaKaRa公司的TRIzol試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照說明書進行操作，提取的總RNA用BECKMAN COULTER核酸蛋白分析儀測其在260 nm和280 nm的吸光度(A)值，所有樣品的A260與A280的比值為1.8～2.1。并根據(jù)A260值對樣品的總RNA進行初步定量，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后保存于-80 ℃冰箱備用。實時熒光定量PCR測定在ABI StePone Plus上完成，mRNA表達水平用SYBR Premix EX Taq(Perfect Real time染料法實時熒光定量試劑盒)檢測。所有樣品95 ℃熱變性60 s，40個循環(huán)，每個循環(huán)包括95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s。引物序列：VCAM-1上游為5′-CAGCCTCTTTCTGAGAATGCAAC-3′，下游為5′-TGACAGTGTCTCCTTCTTTGA-CACT-3′；MCP-1上游為5′-CAGCCTCTTTCTGAGAA-TGCAAC-3′，下游為5′-TGACAGTGTCTCCTTCTTTGACACT-3′；GAPDH上游為5′-ACGGATTTGGTCGTATTGGG-3′，下游為5′-TGATTTTGGAGGGATCTCGC-3′。HECAC中VCAM-1、MCP-1 mRNA表達水平以GAPDH為內(nèi)參測算，VCAM-1的cDNA需稀息10倍再行PCR反應。以2-ΔΔCt計算分析mRNA的表達量，將空白對照組標準化為1。

1.4細胞上清液中可溶性VCAM-1、MCP-1蛋白檢測實驗前，將上清液予分析緩沖液(ASsay buffer)分別稀釋成1倍、5倍、10倍、20倍、100倍，按照說明書步驟進行操作以確定最佳的上清液作用濃度，MCP-1的上清液稀釋100倍后進行蛋白檢測，VCAM-1的上清液無需稀釋即可進行蛋白檢測。使用試劑盒提供的MCP-1、VCAM-1標準品按操作說明建立標準曲線，標準曲線方程式分別為Y=0.001 5X+0.056 9(R2=0.998 5)，Y=0.018 9X+0.092 6(R2=0.999 3)，根據(jù)方程式求出各組細胞上清液中MCP-1、VCAM-1蛋白的表達量。

2　結(jié)果

各組細胞VCAM-1、MCP-1 mRNA比較見表1。各組細胞上清液VCAM-1、MCP-1蛋白比較見表2。

3　討論

VCAM-1、MCP-1在動脈粥樣硬化早期病變中扮演著非常重要的角色[5,6]，抑制血管內(nèi)皮細胞VCAM-1、MCP-1的表達對動脈硬化的發(fā)展能起到抑制的作用。LPS在革蘭陰性細菌感染及疾病演化中有重要作用，被認為是造成全身性炎癥反應綜合征的主要原因，與細胞膜上相應受體作用后，啟動胞內(nèi)信號傳遞鏈，引起NF-κB等活化，啟動基因轉(zhuǎn)錄，表達和釋放多種細胞因子，發(fā)揮其毒性作用。本研究以LPS作為促進冠脈內(nèi)皮細胞炎癥反應的誘導劑，結(jié)果顯示，與空白對照組相比，LPS可明顯增加冠脈內(nèi)皮細胞VCAM-1、MCP-1的表達。

表1　各組細胞VCAM-1、MCP-1 mRNA比較

注：與空白對照組相比，*P<0.05；與LPS組相比，△P<0.05；與LPS+法舒地爾組相比，#P<0.05。

表2　　　　各組細胞上清液VCAM-1、MCP-1蛋白比較

注：與空白對照組相比，*P<0.05；與LPS組相比，△P<0.05；與LPS+法舒地爾組相比，#P<0.05。

Rho/ROCK信號通路在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用，其通過不同途徑活化后促進動脈粥樣硬化的形成。Rho激酶的活化可能通過調(diào)節(jié)NF-κB的活性和T淋巴細胞的增殖，參與早期動脈粥樣硬化的形成。Rho激酶及其下游p38MAPK/NF-κB信號通路的激活可誘導血管內(nèi)皮細胞MCP-1的表達。法舒地爾是Rho激酶抑制劑，其可通過下調(diào)p38MAPK和NF-κB的活性從而下調(diào)MCP-1、VCAM-1的表達[1,7]，本研究也證明了法舒地爾可以下調(diào)LPS誘導的HCAEC中VCAM-1、MCP-1的表達。

過氧化物酶增殖物激活受體-γ激動劑吡格列酮可通過抑制p38MAPK蛋白活性從而抑制炎癥反應過程，羅格列酮可以通過抑制NF-κB蛋白活性下調(diào)高糖誘導的VCAM-1的表達。本研究結(jié)果表明，羅格列酮和法舒地爾聯(lián)用可協(xié)同抑制LPS誘導的HCAEC中VCAM-1、MCP-1的表達，其作用機理可能與法舒地爾、羅格列酮抑制某些共同的信號通路有關。MAPK及NF-κB是動脈內(nèi)皮細胞內(nèi)兩條非常重要信號通路，在炎癥信號轉(zhuǎn)導調(diào)控中具有重要意義。p38MAPK是MAPK家族中的重要成員，是介導細胞反應的重要信號系統(tǒng)，與血管內(nèi)皮細胞損傷有關[8]。NF-κB是調(diào)控轉(zhuǎn)錄多種炎癥因子的中心環(huán)節(jié)和共同通路，是血管內(nèi)皮細胞損傷進展過程中炎癥反應的關鍵環(huán)節(jié)。研究[9]發(fā)現(xiàn)，p38MAPK被激活后可通過磷酸化或促炎細胞因子(如TNF-α、ICAM-1)而活化NF-κB。NF-κB被激活后，也可通過其促炎細胞因子產(chǎn)物反過來激活p38MAPK。p38MAPK與NF-κB形成的相互激活網(wǎng)絡可調(diào)控多種炎癥介質(zhì)的基因表達，促進動脈粥樣硬化的發(fā)展。

綜上可見，法舒地爾聯(lián)合羅格列酮可協(xié)同抑制LPS誘導的HCAEC中VCAM-1、MCP-1的表達，可能與兩者共同抑制p38MAPK、NF-κB信號通路有關。

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Effects of fasudil combined with rosiglitazone on expression of MCP-1 and VCAM-1 in lipopolysaccharide-induced human coronary arterial endothelial cells

LIShiyun,WUXianghong,HUANGWen,WANGChun,MAGuotian,BIQi

(TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To observe the effects of fasudil combined with rosiglitazone on the expression of vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1)and monocyte chemotactic protein 1 (MCP-1) in lipopolysaccharide (LPS)-induced human coronary arterial endothelial cells (HCAECs). MethodsWe conducted the experiment using the 3rd to the 5th generation of HCAECs in vitro. Then, the cells were divided into the control group (non-intervention), LPS group (HCAECs were intervened with 100 ng/mL LPS), fasudil group (HCAECs were intervened with 10 nmol/L fasudil), rosiglitazone group (HCAECs were intervened with 10 μg/mL rosiglitazone), LPS + fasudil group (HCAECs were intervened with 10 nmol/L fasudil for 2 h followed by 100 ng/mL LPS for 22 h), LPS + fasudil + rosiglitazone group (HCAECs were intervened with 10 nmol /L fasudil and 10 μg/mL rosiglitazone for 2 h followed with 100 ng/mL LPS together for 22 h). The protein expression of VCAM-1 and MCP-1 in supernatant was detected by ELISA and the mRNA was detected by real-time fluorescent quantification PCR. ResultsCompared with the control group, the mRNA expression of VCAM-1 and MCP-1, and the protein expression of VCAM-1 and MCP-1 was increased in the LPS group (allP<0.05). Compared with the LPS group, the mRNA expression of VCAM-1 and MCP-1, and the protein expression of VCAM-1 and MCP-1 was decreased in the LPS + fasudil group (allP<0.05). Compared with LPS+fasudil group, the mRNA expression of VCAM-1 and MCP-1, and the protein expression of VCAM-1 and MCP-1 was decreased in the LPS+fasudil+ rosiglitazone group (allP<0.05).Conclusion Fasudil combined with rosiglitazone collaboratively inhibits the expression of VCAM-1 and MCP-1 in HCAECs induced by LPS, which may be related to their co-suppression of p38MAPK and NF-κB signaling pathway.

atherosclerosis; human coronary artery endothelial cells; vascular cell adhesion molecule 1; monocyte chemotactic protein 1

國家自然科學基金資助項目(81360057)。

李世云(1979-)，男，碩士研究生，主要從事冠心病的發(fā)病機制及介入治療。E-mail: 411955433@qq.com

簡介：巫相宏(1967-)，男，教授，碩士生導師，主要從事冠心病防治的基礎和臨床研究、冠心病的介入性診斷治療。E-mail: whw780@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.23.004

R543

A

1002-266X(2016)23-0013-03

2016-01-11)