葉萍萍，王豪勛，馬軍，張中冕，武海英，董海俠

(1鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院，鄭州 450014；2河南省人民醫(yī)院；3山西煤炭中心醫(yī)院)

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IL-15對(duì)CIK細(xì)胞增殖、活化及抗瘤作用的影響

葉萍萍1，王豪勛1，馬軍1，張中冕1，武海英2，董海俠3

(1鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院，鄭州 450014；2河南省人民醫(yī)院；3山西煤炭中心醫(yī)院)

目的觀察IL-15對(duì)人細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)細(xì)胞增殖、活化及抗瘤作用的影響。方法對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng)CIK細(xì)胞，IL-15組在CIK常規(guī)制備的基礎(chǔ)上添加IL-15，誘導(dǎo)培養(yǎng)10 d，比較兩組CIK細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞表型、細(xì)胞上清液中的細(xì)胞因子，觀察兩組CIK細(xì)胞對(duì)食管鱗癌細(xì)胞系EC9706細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果IL-15組、對(duì)照組細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為(26.00±9.86)×105/mL、(7.83±1.18)×105/mL，兩組比較，P<0.05。IL-15組、對(duì)照組CD3+細(xì)胞分別占99.40%±0.46%、95.02%±1.18%，CD3+CD4+細(xì)胞分別占41.59%±0.71%、33.36%±1.91%，兩組比較，P均<0.05。IL-15組、對(duì)照組細(xì)胞上清液中IFN-γ分別為(15.00±5.77)×103、(7.00±2.74)×103pg/mL，TNF-α分別為(25.0±1.5)×103、(12.5±2.3)×103pg/mL，兩組比較，P均<0.05。IL-15組、對(duì)照組食管癌細(xì)胞株EC9706凋亡率分別為15.71%±1.31%、13.25%±1.17%，兩組比較，P<0.05。結(jié)論IL-15能增加CIK細(xì)胞增殖能力及細(xì)胞表型CD3+、CD3+CD4+陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α及誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞株EC9706細(xì)胞凋亡。

白細(xì)胞介素15；細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞；細(xì)胞表型；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

目前，在過(guò)繼免疫治療中用于治療腫瘤的細(xì)胞主要有淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(LAK)、腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞、細(xì)胞毒性功能的T淋巴細(xì)胞、γδT細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(DC)、細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)、自然殺傷細(xì)胞(NK)等。CIK細(xì)胞是1991年首次報(bào)道的一類由多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷免疫活性細(xì)胞，其主要效應(yīng)細(xì)胞為CD3+CD56+細(xì)胞。CIK細(xì)胞具有體外增殖快、殺瘤活性強(qiáng)、殺瘤譜廣和非MHC限制的溶細(xì)胞活性等特點(diǎn)，還可以分泌IFN-γ、IL-12、TNF-α直接或間接殺傷腫瘤細(xì)胞，能通過(guò)顆粒酶、穿孔素途徑殺傷腫瘤細(xì)胞，并且與其他殺瘤方式具有協(xié)同作用，是至今發(fā)現(xiàn)最有效的抗腫瘤免疫細(xì)胞。但CIK細(xì)胞在血液中含量都較低，正常人體外周血中CIK細(xì)胞占外周血淋巴細(xì)胞的1%～5%[1]。研究[2～4]發(fā)現(xiàn)，多種細(xì)胞因子聯(lián)合進(jìn)行體外培養(yǎng)，可促進(jìn)CIK細(xì)胞增殖、活化及殺瘤毒性。IL-15是由多種細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，具有一定的抗腫瘤作用。本研究在原有傳統(tǒng)培養(yǎng)基中添加IL-15，觀察IL-15對(duì)CIK細(xì)胞增殖、活化及抗瘤作用的影響。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞、試劑、儀器食管癌細(xì)胞株EC9706(本實(shí)驗(yàn)室自存)在含有胎牛血清、抗生素的RPMI1640培養(yǎng)基中，于5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中在本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)培養(yǎng)、傳代。CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Scientific公司)，多功能酶標(biāo)儀(TECAN公司)，流式細(xì)胞儀(BD公司)，光學(xué)顯微鏡(Olympus公司)，離心機(jī)(BD公司)。PerCP-CD3/FITC-CD4/PE-CD8三色直標(biāo)熒光抗體、APC-CD56直標(biāo)熒光抗體(美國(guó)BD公司)，IL-15(美國(guó)PEPROTCH公司)，ELISA試劑盒(DAKEWE公司)，Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒(北京四正柏生物科技有限公司)，淋巴細(xì)胞分離液(上海華精生物高科技有限公司)。

1.2IL-15處理CIK細(xì)胞方法及分組本實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和IL-15組，對(duì)照組按常規(guī)方法制備CIK，IL-15組在CIK常規(guī)制備的基礎(chǔ)上添加IL-15，具體步驟如下。①分離單個(gè)細(xì)胞：用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法從健康志愿者外周血分離出PBMC，加4 mL PBS稀釋4 mL全血(比例為1∶1)，取出稀釋血緩慢加入裝有4 mL Ficoll-Hypaque離心管中，注意不要打亂液面界面，2 000 r/min離心20 min，輕輕吸取單個(gè)核細(xì)胞至另一支離心管中。加入生理鹽水5 mL，輕輕吹勻細(xì)胞，離心洗滌2次。②CIK制備：在生理鹽水懸浮的PBMC中加CIK初始培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/mL，種植于24孔板中，每孔200 μL，首先加入含1 000 U/mL IFN-γ的培養(yǎng)液，置于5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；24 h后加100 ng/mL抗CD3，500 U/mL IL-2；培養(yǎng)4 d后調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL,每隔2 d對(duì)照組補(bǔ)加500 U/mL IL-2，IL-15組同時(shí)加100 ng/mL IL-15。照此法擴(kuò)增至第10天收獲CIK細(xì)胞。

1.3CIK細(xì)胞增殖能力觀察采用臺(tái)盼藍(lán)血球計(jì)數(shù)板細(xì)胞計(jì)數(shù)法。用75%乙醇清洗計(jì)數(shù)板和蓋玻片，用吸水紙擦干；在每次細(xì)胞補(bǔ)液前將10 μL細(xì)胞懸液和10 μL 0.4%臺(tái)盼藍(lán)充分混合，再加入80 μL的PBS緩沖液稀釋細(xì)胞懸液；吸取10 μL細(xì)胞懸液，加入在計(jì)數(shù)板上的蓋玻片內(nèi)，一定注意不要溢出至計(jì)數(shù)板上的小槽內(nèi)，也不要過(guò)少或帶氣泡，倒置顯微鏡下在血球計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)4個(gè)大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)及活力。細(xì)胞懸液密度(細(xì)胞個(gè)數(shù)/mL)=4個(gè)大格細(xì)胞總數(shù)/4×104×10(稀釋倍數(shù))。

1.4CIK細(xì)胞表型檢測(cè)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。CIK細(xì)胞培養(yǎng)第10天時(shí)，將24孔板每孔細(xì)胞用槍頭吹打均勻，分別收集至15 mL離心管中，混勻，分為對(duì)照組和IL-15組。分別取50 μL至流式管中，在管底部分別加入10 μL PerCP-CD3/FITC-CD4/PE-CD8三色直標(biāo)熒光抗體、2.5 μL APC-CD56直標(biāo)熒光抗體及PBS緩沖液使反應(yīng)體系為100 μL。常溫避光孵育20 min。1 mL過(guò)濾后的PBS緩沖液或鞘液洗2次，1500 g離心5 min，每次離心后小心吸取上清。加500 μL PBS，混勻后立即上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞表型。

1.5細(xì)胞上清液中IFN-γ、TNF-α檢測(cè)用15 mL無(wú)菌離心管分別收集對(duì)照組和IL-15組培養(yǎng)液，2 000 r/min離心20 min，仔細(xì)收集細(xì)胞上清液。用ELISA試劑盒分別檢測(cè)對(duì)照組和IL-15組細(xì)胞上清液中的IFN-γ和TNF-α，實(shí)驗(yàn)步驟參照ELISA使用說(shuō)明書。

1.6IL-15對(duì)CIK細(xì)胞對(duì)食管鱗癌細(xì)胞系EC9706細(xì)胞凋亡的影響觀察采用Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡。收集接種于24孔培養(yǎng)板上的CIK培養(yǎng)細(xì)胞，1 500 r/min離心5 min，對(duì)照組和IL-15組效靶比均為50∶1，其中處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期靶細(xì)胞食管癌細(xì)胞株EC9706濃度為5×104個(gè)/mL，效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞等體積種植于96孔板內(nèi)，最終體積為200 μL(食管癌細(xì)胞株EC9706培養(yǎng)基)，每組3個(gè)復(fù)孔，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。共培養(yǎng)24 h，吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔用無(wú)菌PBS緩沖液或無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞2次，0.25%胰酶100 μL消化24孔板中細(xì)胞，收集至1.5 mL Ep管中，收集各組細(xì)胞。用4 ℃預(yù)冷的PBS緩沖液洗對(duì)照組和IL-15組細(xì)胞2次，用結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL。取100 μL結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞于5 mL流式管中，加入5 μL AnnexinV-FITC混勻，室溫避光反應(yīng)15 min，后加入10 μL的PI，混勻后室溫避光反應(yīng)5 min，在反應(yīng)管中加400 μL過(guò)濾后的PBS緩沖液或流式鞘液，上機(jī)流式檢測(cè)。

2　結(jié)果

在CIK細(xì)胞培養(yǎng)的第1～2天，細(xì)胞增殖活化尚不明顯，且細(xì)胞濃度有所下降。加入IL-2及IL-15后細(xì)胞開始明顯活化增殖，鏡下可見細(xì)胞成簇、成團(tuán)增長(zhǎng)。在細(xì)胞培養(yǎng)的第10天時(shí)，IL-15組、對(duì)照組細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為(26.00±9.86)×105/mL、(7.83±1.18)×105/mL，兩組比較，P<0.05。兩組CIK細(xì)胞表型表達(dá)比較見表1。IL-15組、對(duì)照組細(xì)胞上清液中IFN-γ分別為(15±5.77)×103、(7±2.74)×103pg/mL，TNF-α分別為(25±1.5)×103、(12.5±2.3)×103pg/mL，兩組比較，P均<0.05。IL-15組、對(duì)照組食管癌細(xì)胞株EC9706凋亡率分別為15.71%±1.31%、13.25%±1.17%，兩組比較，P<0.05。

表1　兩組CIK細(xì)胞表型情況

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05。

3　討論

目前，盡管腫瘤的治療策略有了很大改進(jìn)，但患者總體療效和生存率仍不能令人滿意。腫瘤的免疫治療是近幾年的研究熱點(diǎn)，單抗的靶向治療和細(xì)胞免疫治療取得了重大突破。CIK細(xì)胞是過(guò)繼免疫治療的一種，其抗腫瘤機(jī)制是通過(guò)多種途徑完成的[5,6]。CIK的傳統(tǒng)培養(yǎng)方法是提取外周血單個(gè)核細(xì)胞，體外用不同的細(xì)胞因子刺激，大量擴(kuò)增具有腫瘤殺傷作用的免疫效應(yīng)細(xì)胞，然后回輸?shù)襟w內(nèi)進(jìn)而發(fā)揮其抗腫瘤免疫效應(yīng)。這一治療已經(jīng)在腎癌、黑色素瘤等腫瘤治療中取得了一定的療效[7]。CIK的數(shù)量、存活率與其抗瘤作用呈正相關(guān)，但其體外培養(yǎng)方案及技術(shù)還有待改善。因此，我們擬通過(guò)改進(jìn)體外誘導(dǎo)方案，增強(qiáng)細(xì)胞殺傷腫瘤的途徑以提高其抗腫瘤活性。

IL-15生物學(xué)作用與IL-2相似[8]，能誘導(dǎo)T、B和NK細(xì)胞的分化和增殖，增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞溶解活性，誘導(dǎo)產(chǎn)生持久的抗原刺激CD8+CD44hi記憶性T細(xì)胞，刺激B細(xì)胞的分化和免疫球蛋白的合成，誘導(dǎo)DC的成熟但無(wú)刺激免疫調(diào)節(jié)性T細(xì)胞活性[9]。因此，提高IL-15的活性能增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤的非特異性和特異性免疫。有實(shí)驗(yàn)研究表明，在CIK細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)過(guò)程中加入IL-15可促進(jìn)CIK細(xì)胞增殖和NKG2D表型的表達(dá)，并提高CIK細(xì)胞體外殺瘤活性能力。另有研究[10]發(fā)現(xiàn)，IL-15還可以上調(diào)NK細(xì)胞表面受體的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)CD56+細(xì)胞的擴(kuò)增。本實(shí)驗(yàn)研究表明，IL-15體外誘導(dǎo)CIK細(xì)胞能增加細(xì)胞增殖數(shù)量。CIK細(xì)胞中的主要效應(yīng)細(xì)胞是CD3+CD56+細(xì)胞，在體外多種細(xì)胞因子的作用下，擴(kuò)增出的效應(yīng)細(xì)胞多是來(lái)源于CD3+CD56-T細(xì)胞，而不是CD3-CD56+NK細(xì)胞，CD4+CD8+、CD4+CD8-、CD4-CD8+均可在細(xì)胞因子誘導(dǎo)培養(yǎng)下表達(dá)CD56+分子。CD4+CD8-細(xì)胞和CD4+CD8+細(xì)胞在正常人外周血中的含量極低，這就間接提示了外周血中CD3+CD56+細(xì)胞大多數(shù)來(lái)源于CD4-CD8+T細(xì)胞。外周血中CD4-CD8+T細(xì)胞及CD4+CD8-T細(xì)胞含量增多時(shí)，機(jī)體的抗腫瘤作用也會(huì)增強(qiáng)。本研究結(jié)果表明，IL-15可增強(qiáng)CIK細(xì)胞表面CD3+、CD3+CD4+陽(yáng)性分子的表達(dá)，在IL-15誘導(dǎo)作用下可明顯增加CIK中免疫活性細(xì)胞比例。CIK細(xì)胞通過(guò)分泌IL-12、IL-6、TNF-α及IFN-γ等細(xì)胞因子途徑殺傷腫瘤，此途徑也是CIK細(xì)胞抗腫瘤的主要部分。本研究結(jié)果表明，IL-15可促進(jìn)CIK細(xì)胞分泌TNF-α及IFN-γ，進(jìn)而增強(qiáng)CIK細(xì)胞抗腫瘤的作用。CIK細(xì)胞可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而發(fā)揮其抗腫瘤作用，本研究中添加IL-15誘導(dǎo)的CIK增加了食管癌細(xì)胞株EC9706的凋亡率。

可見，IL-15能增加CIK細(xì)胞增殖能力及細(xì)胞表型CD3+、CD3+CD4+陽(yáng)性表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α及誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞株EC9706細(xì)胞凋亡。

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河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)計(jì)劃資助項(xiàng)目(201404008)；河南省科技廳科技攻關(guān)項(xiàng)目(142300410270)。

馬軍(E-mail： 843093451@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.23.013

R392

A

1002-266X(2016)23-0041-03

2016-01-11)