何志敏， 馮盼盼， 榮朵艷， 趙小英， 劉選明，2

(1. 湖南大學(xué) 生物學(xué)院 化學(xué)生物傳感與計(jì)量學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長沙410082；2. 湖南大學(xué) 生物學(xué)院 植物功能基因組學(xué)與發(fā)育調(diào)控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,長沙410082)

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與CRY1相互作用的轉(zhuǎn)錄因子蛋白的篩選

何志敏1， 馮盼盼1， 榮朵艷1， 趙小英1， 劉選明1，2

(1. 湖南大學(xué) 生物學(xué)院 化學(xué)生物傳感與計(jì)量學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長沙410082；2. 湖南大學(xué) 生物學(xué)院 植物功能基因組學(xué)與發(fā)育調(diào)控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,長沙410082)

擬南芥CRY1(cryptochrome1)通過蛋白相互作用啟動(dòng)藍(lán)光信號的傳導(dǎo)，從而促進(jìn)植物光形態(tài)建成。為深入研究CRY1介導(dǎo)藍(lán)光信號傳導(dǎo)的機(jī)制，以CRY1為誘餌蛋白，通過酵母雙雜交系統(tǒng)的營養(yǎng)缺陷型試驗(yàn)、液體顯色試驗(yàn)、分段相互作用試驗(yàn)方法，從擬南芥轉(zhuǎn)錄因子酵母庫中篩選與其相互作用的轉(zhuǎn)錄因子蛋白。結(jié)果表明，通過營養(yǎng)缺陷型篩選試驗(yàn)以及以O(shè)NPG為底物的液體顯色試驗(yàn)初步獲得與CRY1相互作用的41個(gè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白；選取與CRY1相互作用藍(lán)光依賴程度較高或酶活性高的轉(zhuǎn)錄因子以CPRG為底物的液體顯色試驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)選取的轉(zhuǎn)錄因子蛋白與CRY1的相互作用具有藍(lán)光依賴性且隨藍(lán)光處理時(shí)間的延長相互作用強(qiáng)度增強(qiáng)；CRY1各分段與轉(zhuǎn)錄因子蛋白相互作用試驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)錄因子SPL3和IDD4主要與CRY1的N端相互作用，與C端的相互作用比較微弱，但是SPL3與CRY1 C端的相互作用具有藍(lán)光特異性而IDD4與CRY1 C端的藍(lán)光特異性相互作用不明顯。

CRY1；酵母雙雜交；轉(zhuǎn)錄因子；擬南芥

光通過多種光受體調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育，這些光受體包含光敏色素與隱花色素。隱花色素CRY1自1993年被發(fā)現(xiàn)以來，其在接收和傳遞藍(lán)光信號影響植物生長發(fā)育方面的功能得到了很大程度的研究，尤其是在植物光形態(tài)建成方面的功能已經(jīng)很清楚，這部分的功能與光敏色素在光信號傳導(dǎo)上的作用是冗余的[1-2]。光形態(tài)建成包括抑制下胚軸的伸長，促進(jìn)子葉的張開，促進(jìn)幼苗的去黃化，誘導(dǎo)基因表達(dá)的變化和葉綠體的發(fā)育等[3-8]。

CRY1通過與下游的信號蛋白相互作用傳遞藍(lán)光信號，從而引起一系列的光形態(tài)建成反應(yīng)以實(shí)現(xiàn)其對植物生長發(fā)育的調(diào)節(jié)。目前，從遺傳學(xué)和生理學(xué)上報(bào)道了許多與CRY1相互作用的蛋白(圖1)。CRY1與這些蛋白的相互作用大致可分為以下幾類：1)CRY1/COP1/SPA1之間的相互作用；2)CRY1與光敏色素(PHYA和PHYB)的相互作用；3)CRY1與ZTL/ADO1/LKP1相互作用；4)CRY1與PHOT1和PHOT2的相互作用。COP1能分別與CRY1、SPA1直接相互作用，這三者之間的關(guān)系：黑暗下，SPA1與COP1相互作用并激活COP1的E3泛素化連接酶活性，促進(jìn)COP1對下游底物如HY5和CO等蛋白的降解。藍(lán)光下，激活的CRY1構(gòu)象打開，并通過C端的CCE結(jié)構(gòu)域與SPA1的WD結(jié)構(gòu)域相互作用，CRY1-SPA1光下的相互作用競爭性抑制了SPA1-COP1的相互作用，進(jìn)而COP1的活性受到抑制，最終COP1的底物得到了積累并引起光誘導(dǎo)基因表達(dá)的變化[9]。PHYA作為光激活蛋白激酶通過與CRY1的C端結(jié)構(gòu)域CCR相互作用并磷酸化CRY1，實(shí)現(xiàn)光激活CRY1的過程，但是這一磷酸化過程是沒有光特異性的，PHYA在紅光和藍(lán)光下均能磷酸化CRY1，但是磷酸化的CRY1只能在藍(lán)光下發(fā)揮功能，所以PHYA磷酸化CRY1的反應(yīng)并不是CRY1功能的信號傳導(dǎo)機(jī)制[10-11]。CRY1與PHYB的相互作用目前僅在體外試驗(yàn)得到驗(yàn)證[12]。ZTL/ADO1/FKF1是一類含LOV/F-BOX/Kelch的藍(lán)光受體，在體外酵母系統(tǒng)里和pulldown assay試驗(yàn)中證實(shí)了ADO1與CRY1、PHYB的相互作用。ADO1與CRY1的C端結(jié)構(gòu)域和PHYB的羧基末端有很強(qiáng)的相互作用[13]。向光素PHOT1和PHOT2是一類與隱花色素不相關(guān)的黃素單核苷酸FMN綁定蛋白，但是在生理生化證據(jù)上，目前沒有明確的實(shí)驗(yàn)證據(jù)證明向光素PHOT1和PHOT2與隱花色素有直接的相互作用。雖然以上蛋白被證明在植物或者體外系統(tǒng)中與CRY1存在直接或間接的相互作用，但是沒有一個(gè)是屬于轉(zhuǎn)錄因子蛋白的。所以篩選與CRY1相互作用的轉(zhuǎn)錄因子蛋白，探明轉(zhuǎn)錄因子參與CRY1信號通路途徑的作用機(jī)制具有重要的科學(xué)理論意義。

本研究利用酵母雙雜交系統(tǒng)，以CRY1為誘餌蛋白從擬南芥轉(zhuǎn)錄因子酵母庫中篩選與CRY1相互作用的轉(zhuǎn)錄因子蛋白，驗(yàn)證了藍(lán)光對其相互作用的影響，分析了與轉(zhuǎn)錄因子相互作用的CRY1結(jié)構(gòu)域，以及篩選出來的轉(zhuǎn)錄因子的mRNA組織特異性表達(dá)以初步判斷CRY1可能參與的植物生長發(fā)育調(diào)節(jié)。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1菌種、質(zhì)粒、轉(zhuǎn)錄因子酵母庫

含有全長cry1的質(zhì)粒pBridge-cry1由本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建；大腸桿菌DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存；釀酒酵母AH109菌株、釀酒酵母Y187菌株來自北京農(nóng)科院；pDEST22、 pDEST32由本實(shí)驗(yàn)室提供；轉(zhuǎn)錄因子酵母文庫由加州大學(xué)林辰濤教授實(shí)驗(yàn)室提供[14]。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑

YPDA酵母培養(yǎng)基、-Leu、-Trp、-Leu/-Trp、-Leu/-Trp/-His 選擇性培養(yǎng)基以及細(xì)菌培養(yǎng)基為自行配制。高保真酶primerstar購自大連寶生物；ONPG購自上海生工；3-AT購自sigma；CPRG購自羅氏；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

圖1 與CRY1相互作用的已知蛋白(http://www.string.com)Fig 1 Known proteins which interact with CRY1 (http://www.string.com)

1.2 方法

1.2.1 誘餌載體pDEST32-cry1的構(gòu)建

根據(jù)cry1的序列設(shè)計(jì)引物cry1F(5′-ATGTCTGGTTCTGTATCTGGTTG-3′)和cry1R(5′-TTACCCGGTTTGTGAAAGC-3′)，加上gateway的接頭attBF (5′-CAAAA AAGCAGGCTTC-3′)，attBR(5′-CAAGAAAGCTGGGTC-3′),以pBridge-cry1質(zhì)粒為模板，用連了接頭的cry1全長引物進(jìn)行第一輪PCR克隆，以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，用attB接頭引物擴(kuò)增出含有接頭的cry1全長的目的片段?；厥占兓骳ry1全長與入門載體pDONER-ZEO在BP酶的作用下構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入DH5α檢驗(yàn)后經(jīng)測序驗(yàn)證重組質(zhì)粒pDONER-ZEO-cry1的正確性。測序結(jié)果返回后，重組質(zhì)粒pDONER-ZEO-cry1與誘餌空載體pDEST32在LR酶的作用下構(gòu)建目的克隆載體pDEST32-cry1。

1.2.2 酵母融合

本方法參照Clontech酵母雜交手冊采用酵母雙雜交融合篩庫法，具體如下：將構(gòu)建的誘餌重組載體pDEST32-cry1和BD空載pDEST32分別轉(zhuǎn)化入酵母菌株AH109；AD空載pDEST22 轉(zhuǎn)化入酵母菌Y187。分別在單缺選擇性培養(yǎng)基-Leu、-Trp的平板上挑選陽性克隆以進(jìn)行后續(xù)的酵母融合。將表達(dá)了pDEST32-CRY1和pDEST32的AH109重組菌株分別與轉(zhuǎn)錄因子酵母庫中的表達(dá)了單個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的Y187酵母融合。融合后的酵母細(xì)胞涂布于-Leu/-Trp的雙缺培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)3～5 d。點(diǎn)板至-Leu/-Trp/-His三缺選擇性培養(yǎng)基上，分別放于藍(lán)光和黑暗下，以期初步篩選到在藍(lán)光下有相互作用的陽性克隆。

1.2.3 酵母雙雜liquid assay 驗(yàn)證

用ONPG或者CPRG為底物的液體顯色試驗(yàn)(liquid assay)來測定酵母中l(wèi)acZ酶活性以進(jìn)一步驗(yàn)證經(jīng)酵母融合營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基初步篩選出來的轉(zhuǎn)錄因子與CRY1蛋白在藍(lán)光下的相互作用以及相互作用的強(qiáng)度。具體方法可參考Clontech的酵母雙雜交手冊。

1.2.4 CRY1結(jié)構(gòu)域與轉(zhuǎn)錄因子的相互作用

將CRY1全長、CRY1N493(氨基酸序列1～493)、CRY1N505(氨基酸序列1～505)、CRY1N515(氨基酸序列1～515)、CRY1M251-545(氨基酸序列251～545)、CRY1C301(氨基酸序列382～682)的CDS序列克隆后構(gòu)建到BD載體pDEST32，并轉(zhuǎn)入AH109酵母菌株中。經(jīng)-Leu單缺營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基篩選陽性克隆后，分別與酵母庫中表達(dá)了SPL3與IDD4轉(zhuǎn)錄因子蛋白的Y187酵母菌株融合。融合后的菌株經(jīng)-Leu/-Trp篩選陽性克隆。經(jīng)-Leu/-Trp/-His營養(yǎng)缺陷型和liquid assay(CPRG為底物)檢驗(yàn)CRY1各片段與SPL3與IDD4的相互作用。

1.2.5 mRNA組織表達(dá)分析

使用GE公司的RNA提取試劑盒提取各組織的RNA。采用Superscript first-strand cDNA合成系統(tǒng)(Invitrogen)取1 μg總RNA合成cDNA的第一鏈。Platinum SYBR Green qPCR Supermix-UDG (Invitrogen)進(jìn)行定量PCR反應(yīng)。簡單如下：將合成的cDNA稀釋50倍，取2 μL稀釋的cDNA于10 μL的qPCR反應(yīng)體系中作模板，95℃預(yù)變性5 min；95℃變性10 s，56℃退火15 s， 72℃延伸30 s，循環(huán)40次。以ACTIN2的mRNA水平作為內(nèi)參。定量PCR的結(jié)果為3次生物學(xué)重復(fù)結(jié)果。所使用的定量引物分別為qspl3F(AAGCAAAGC GGAAGGGAAG)，qspl3R(TCTCGACCTGACAAACTCCACT)；qIdd4F(TCGACGTTCAATTTGGAGAC A)，qIdd4R(GAAACTCCGCCACGAGCA)。

2　結(jié)果

2.1 酵母雙雜交篩選結(jié)果

CRY1具有明顯的自激活，黑暗下pDEST32-CRY1在100 mmol/L 3-AT濃度下自激活被明顯抑制，但是藍(lán)光下的自激活沒有被完全抑制，說明pDEST32-CRY1在藍(lán)光下還具有一定程度的藍(lán)光自激活[15]。當(dāng)3-AT的濃度高達(dá)200 mmol/L時(shí)，pDEST32-CRY1的自激活背景完全消除。在后續(xù)試驗(yàn)中選用含有100 mmol/L 3-AT的-Leu/-Trp/-His的營養(yǎng)缺陷型平板對pDEST32-CRY1與各轉(zhuǎn)錄因子融合的陽性克隆進(jìn)行相互作用的篩選，并分別放于50 μmol/m2s的藍(lán)光和黑暗下，生長3 d，初步篩選到41個(gè)陽性克隆。將篩選到的候選陽性克隆以O(shè)NPG為底物并以pDEST32-CRY1 / pDEST22為陰性對照，在藍(lán)光與黑暗下做進(jìn)一步的liquid assay試驗(yàn)以進(jìn)行驗(yàn)證，并計(jì)算藍(lán)光/黑暗下的β-半乳糖苷酶活性的倍數(shù)大小，結(jié)果如圖2，初步獲得3個(gè)與CRY1相互作用酶活性高，藍(lán)光/黑暗的酶活性倍數(shù)相對較大的轉(zhuǎn)錄因子。將獲得的3個(gè)酵母陽性克隆提取DNA后進(jìn)行測序以確定試驗(yàn)過程中無操作污染。這3個(gè)與CRY1相互作用的轉(zhuǎn)錄因子分別為3#A9(spl3 At2g33810)、3#E2(tcp2 At4g18390)和7#A12(idd4 At2g02080)。spl3是一個(gè)與開花相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子；tcp2是一個(gè)與細(xì)胞分化、葉片發(fā)育和形態(tài)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子；idd4是一個(gè)定位于葉綠體的轉(zhuǎn)錄因子。

2.2 藍(lán)光對CRY1與各轉(zhuǎn)錄因子相互作用的影響

為進(jìn)一步確定CRY1與篩選出的轉(zhuǎn)錄因子相互作用的藍(lán)光依賴性，將篩選出來的陽性克隆點(diǎn)在-Leu/-Trp/-His/+200 mmol/L 3-AT的營養(yǎng)缺陷型平板上，并在50 μmol/m2s藍(lán)光和黑暗下生長3 d。由于200 mmol/L的3-AT能消除pDEST32-CRY1在藍(lán)光和黑暗下的自激活背景，所以更能真實(shí)地反映CRY1與轉(zhuǎn)錄因子的相互作用。結(jié)果如圖3A，CRY1能分別與篩選出的3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子(SPL3、TCP2和IDD4)在營養(yǎng)缺陷型平板上藍(lán)光依賴地相互作用。以比ONPG靈敏度更高的CPRG為底物進(jìn)行l(wèi)iquid assay顯色復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，也同樣證明了CRY1與這3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白在藍(lán)光下的相互作用更強(qiáng)(圖3B)。通過測定不同藍(lán)光處理時(shí)間下CRY1蛋白與轉(zhuǎn)錄因子相互作用的酶活性，進(jìn)一步確認(rèn)了藍(lán)光對其相互作用的影響，隨著藍(lán)光時(shí)間的延長，其相互作用的酶活性也隨著增強(qiáng)(圖3C)。而從圖3C中各轉(zhuǎn)錄因子與CRY1相互作用酶活性隨藍(lán)光處理時(shí)間的變化曲線可知，3#E2(TCP2)與CRY1的相互作用隨藍(lán)光處理時(shí)間的延長增長速度最快，而3#A9(SPL3)與CRY1的相互作用不論是在黑暗還是藍(lán)光下，相較于其他兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，其酶活性都是最強(qiáng)的。

圖2 ONPG液體顯色試驗(yàn)篩選結(jié)果

Fig 2 The screening results of ONPG liquid assay

A、C：藍(lán)光和黑暗下初步篩選出來的轉(zhuǎn)錄因子蛋白與CRY1蛋白相互作用的β-半乳糖苷酶活性；B、D：對應(yīng)圖A和圖C中所選轉(zhuǎn)錄因子蛋白與CRY1蛋白相互作用藍(lán)光和黑暗下β-半乳糖苷酶活性的比值

2.4CRY1各結(jié)構(gòu)域與轉(zhuǎn)錄因子蛋白相互作用的分析

CRY1的結(jié)構(gòu)域主要包括兩個(gè)部分，綁定發(fā)色團(tuán)黃素腺嘌呤二核苷酸FAD的N端PHR結(jié)構(gòu)域和C端功能結(jié)構(gòu)域CCE。但是鑒于CRY1在藍(lán)光下有自激活活性，所以本研究想通過更細(xì)的分段，在研究結(jié)構(gòu)域與轉(zhuǎn)錄因子蛋白相互作用的同時(shí)能找到CRY1蛋白不會(huì)自激活的結(jié)構(gòu)域，所以本研究對CRY1的實(shí)際分段如方法1.2.4中所示。

由于3#E2(TCP2)與CRY1相互作用的較強(qiáng)的藍(lán)光依賴性，本研究已將其單獨(dú)進(jìn)行了更深入的研究[16]。在以His為報(bào)告基因的營養(yǎng)缺陷型試驗(yàn)中，在-Leu/-Trp/-His缺陷型培養(yǎng)基中加入10 mmol/L 3-AT，在藍(lán)光和黑暗下生長3 d的酵母顯示CRY1全長以及CRY1N493都具有很強(qiáng)的自激活，其相互作用的結(jié)果無法正確顯示，而CRY1N505與CRY1N515在10 mmol/L 3-AT的抑制下，His表達(dá)泄漏得到抑制，但是這兩個(gè)片段分別與3#A9和7#A12的相互作用的藍(lán)光依賴程度減弱了，藍(lán)光和黑暗下都能相互作用，CRY1M251～545與這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在藍(lán)光和黑暗下均無相互作用，而CRY1C301與3#A9在藍(lán)光下有較弱的相互作用，與7#A12在藍(lán)光和黑暗下均有較弱的相互作用，黑暗下相對較強(qiáng)(圖4A、B)。在以LacZ為報(bào)告基因的liquid assay顯色試驗(yàn)中，由于CRY1的自激活，導(dǎo)致背景很高，但是依舊可以判斷出與營養(yǎng)缺陷型試驗(yàn)相似的試驗(yàn)結(jié)果(圖4C、D)。

圖3 藍(lán)光對CRY1與轉(zhuǎn)錄因子相互作用的影響分析

Fig 3 Analysis of blue light influence to the interactions of CRY1 and transcription factors

A: 酵母雙雜交營養(yǎng)缺陷型試驗(yàn)結(jié)果顯示CRY1與各轉(zhuǎn)錄因子在藍(lán)光與黑暗下的相互作用，組氨酸缺陷型試驗(yàn)中，將酵母點(diǎn)在含有200 mmol/L 3-AT濃度的-Leu/-Trp/-His的平板上，并分別放置于50 μmol m2/s藍(lán)光與黑暗下生長3 d；B: β-半乳糖苷酶活性液體顯色試驗(yàn)分析CRY1與各轉(zhuǎn)錄因子在50 μmol/m2s藍(lán)光與黑暗下的相互作用，各P值均小于0.05；C: β-半乳糖苷酶活性液體顯色試驗(yàn)分析50 μmol/m2s藍(lán)光處理時(shí)間對CRY1與各轉(zhuǎn)錄因子相互作用影響的分析

圖4 CRY1各結(jié)構(gòu)域與篩選出的轉(zhuǎn)錄因子的相互作用分析Fig 4 Interactions anlaysis of CRY1 domains with transcription factors

A、B：酵母營養(yǎng)缺陷型試驗(yàn)結(jié)果顯示CRY1結(jié)構(gòu)域與轉(zhuǎn)錄因子在藍(lán)光和黑暗下的相互作用，酵母細(xì)胞生長條件與圖3A一致；C、D：β-半乳糖苷酶活性試驗(yàn)顯示與各轉(zhuǎn)錄因子相互作用需要的CRY1結(jié)構(gòu)域，酵母細(xì)胞在藍(lán)光或黑暗下處理4 h，3#A9(SPL3)和7#A12(IDD4)與CRY1、 CRY1N505、 CRY1N515、CRY1N493在藍(lán)光與黑暗下的P值均小于0.05。

2.5spl3與idd4 mRNA組織特異性表達(dá)分析

基因在各組織器官中的表達(dá)量，從側(cè)面可以反映其對該組織器官生長發(fā)育的影響。通過分析spl3和idd4在擬南芥不同組織器官中的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)spl3基因是一個(gè)廣譜表達(dá)的基因，在大部分的組織器官中都有表達(dá)，但是主要是在莖和花中表達(dá)積累，尤其是在花中表達(dá)量高(圖5A)，而idd4主要是在莖生葉和果莢中表達(dá)(圖5B)。

圖5 SPL3(A)和IDD4(B)在擬南芥不同組織中的表達(dá)Fig 5 SPL3(A) and IDD4(B) expressions in different tissues of Arabidopsis

3 討論

本研究的最初是為了篩選參與CRY1藍(lán)光信號傳導(dǎo)途徑的轉(zhuǎn)錄因子蛋白，所以在篩選時(shí)以在藍(lán)光下具有較強(qiáng)相互作用或具有較強(qiáng)的藍(lán)光依賴性為篩選宗旨。通過多次復(fù)篩并提高3-AT的濃度和液體顯色試驗(yàn)篩選驗(yàn)證，最終確定SPL3(3#A9)、TCP2(3#E2)和IDD4(7#A12) 3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白能與CRY1相互作用。篩選出來的3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子中TCP2 (3#E2)因其與CRY1的較強(qiáng)藍(lán)光依賴的相互作用而進(jìn)行了單獨(dú)深入的研究[16]，SPL3(3#A9)和IDD4(7#A12)與CRY1的相互作用雖然在藍(lán)光下的相互作用比在黑暗下的強(qiáng)，但是它們的相互作用藍(lán)光依賴性比較弱，尤其是SPL3(3#A9)，其與CRY1在黑暗下的相互作用也很強(qiáng)(圖3B和C)。暗示著第三方一個(gè)或者多個(gè)蛋白有可能參與它們之間的相互作用而影響CRY1與SPL3相互作用的藍(lán)光依賴性，而這一猜測是否真實(shí)需要在植物體內(nèi)驗(yàn)證其蛋白相互作用的藍(lán)光依賴性。

在CRY1結(jié)構(gòu)域與轉(zhuǎn)錄因子蛋白相互作用的分析中發(fā)現(xiàn)，CRY1N505和CRYN515的自激活活性較弱，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域與各轉(zhuǎn)錄因子相互作用的藍(lán)光依賴性相比CRY1全長有所減弱，能為以后研究CRY1蛋白與其他蛋白在酵母細(xì)胞中的相互作用，提供了可參考的結(jié)構(gòu)域分析以提高相互作用的可靠性。CRY1C301與SPL3(3#A9)的相互作用具有藍(lán)光依賴性，但是強(qiáng)度較弱(圖4A)，在液體顯色試驗(yàn)中，其相互作用β-半乳糖苷酶活性相對于具有自激活活性的其他結(jié)構(gòu)域很小。CRY1C301與IDD4(7#A12)的相互作用沒有明顯藍(lán)光依賴性，且其黑暗下的相互作用比藍(lán)光下的強(qiáng)(圖4B和D)。以上結(jié)果初步說明了CRY1與各轉(zhuǎn)錄因子藍(lán)光依賴的相互作用所依賴的結(jié)構(gòu)域，但是需要進(jìn)一步研究以確定CRY1C301是影響CRY1與SPL3(3#A9)相互作用藍(lán)光依賴性的結(jié)構(gòu)域，找出影響CRY1與IDD4(7#A12)藍(lán)光依賴相互作用的具體的結(jié)構(gòu)域。

spl3是一個(gè)具有SBP-box的轉(zhuǎn)錄因子，是leafy(lfy)、fruitfull(ful)和apetala1(ap1)的上游激活因子，受miRNA156的調(diào)節(jié)參與植物從營養(yǎng)生長到生殖生長的轉(zhuǎn)換以及頂端組織發(fā)育[17-19]。IDD4 (indeterminate domain 4)含有C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域，與DELLA蛋白相互作用并綁定DELLA蛋白的下游目標(biāo)基因的啟動(dòng)子如scl3，且DELLA與scl3競爭idd4以調(diào)節(jié)GA信號通路[20〗。本研究中對篩選出的轉(zhuǎn)錄因子的組織表達(dá)特異性分析結(jié)果與其功能一致，其與cry1的相互作用間接地說明了cry1有可能通過spl3調(diào)節(jié)植物的開花；通過idd4介導(dǎo)DELLA蛋白調(diào)控GA信號通路。

后期我們將通過BiFC、Co-IP以及免疫共定位等手段對CRY1與SPL3和IDD4的相互作用進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證，對這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在藍(lán)光下的轉(zhuǎn)基因或者突變體表型進(jìn)行分析以及其他遺傳學(xué)分析，以確定cry1是否會(huì)通過spl3介導(dǎo)植物的開花，通過idd4參與DELLA蛋白對GA信號通路的調(diào)控。

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Identification of CRY1-interactive transcription factor proteins

HE Zhi-min1, FENG Pan-pan1, RONG Duo-yan1, ZHAO Xiao-ying1, LIU Xuan-ming1,2

(1. State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Biological Sciences；2. Hunan Province Key Laboratory of Plant Functional Genomics and Developmental Regulation,College of Biological Sciences, Hunan University, Changsha 410082, China )

Arabidopsis CRY1 (cryptochrome 1) protein initiates blue light signal transduction in a protein interaction manner, consequently causes the photomorphogenesis in plants. To further study the mechanism of CRY1 mediating blue light signal transduction, CRY1 was used as a bait, the methods of yeast two hybrid system, such as preliminary auxotrophy, liquid assays and domain interactions analyses in yeast cells were employed to screen the transcription factor proteins from the Arabidopsis transcription factor yeast library. The results showed that 41 transcription factor proteins were screened out by the preliminary auxotrophy and the liquid assays with ONPG as substrate; the transcription factor proteins which interacted with CRY1 with high blue light dependent or strong enzyme activity were picked out for a further validation using liquid assay with CPRG as substrate, and found that their interactions with CRY1 showed blue light dependent and the activity of interactions would increase with the time of blue light treatment; the interactions analyses results of CRY1 domains and transcription factor protein showed that the transcription factor proteins SPL3 and IDD4 interacted with the N terminus of CRY1 primarily, and relatively weak with the C terminus, however, the blue light dependent existed between the interaction of the C terminus of CRY1 and SPL3, but not so obvious with IDD4.

CRY1; yeast two-hybrid system; transcription factors;Arabidopsisthaliana

2016-01-06；

2016-01-14

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31171176)；湖南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(11JJA002)；湖南省生物發(fā)育工程及新產(chǎn)品研發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心(20134486)

何志敏，博士，主要從事植物生化分析與分子生物學(xué)研究，E-mail：zhiminhe318@163.com；馮盼盼，碩士，主要從事植物生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究，E-mail：13787180145@163.com；何志敏與馮盼盼同為第一作者

劉選明，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事植物生化分析與分子生物學(xué)研究，E-mail：xml05@hnu.edu.cn；趙小英，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事植物生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究，E-mail：zxy_mm@163.com；劉選明與趙小英同為通信作者

Q71;Q943.2

A

2095-1736(2016)05-0047-06

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2016.05.047