魏冬霞 高 凱 袁燕波 湯正嬌 于曉南*

(1.北京林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，北京 100083； 2.國(guó)家花卉工程技術(shù)研究中心，北京 100083； 3.花卉種質(zhì)資源創(chuàng)新與分子育種北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083； 4.洛陽(yáng)農(nóng)林科學(xué)院，洛陽(yáng) 471002)

* 通信作者：E-mail:yuxiaonan626@126.com

觀賞芍藥幼胚不定芽離體誘導(dǎo)研究

魏冬霞1,2,3高 凱4袁燕波1湯正嬌1于曉南1,2,3*

(1.北京林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，北京 100083；2.國(guó)家花卉工程技術(shù)研究中心，北京 100083；3.花卉種質(zhì)資源創(chuàng)新與分子育種北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；4.洛陽(yáng)農(nóng)林科學(xué)院，洛陽(yáng) 471002)

通過(guò)對(duì)芍藥幼胚離體培養(yǎng)，可以有效縮短芍藥的育種周期。本文以‘粉玉奴’、‘朱砂判’、‘團(tuán)葉紅’三個(gè)芍藥品種不同采收期的種子為材料，研究不同胚發(fā)育時(shí)期、不同外殖體類(lèi)型、消毒方式及啟動(dòng)培養(yǎng)基配方對(duì)芍藥不定芽誘導(dǎo)的影響。結(jié)果表明，‘朱砂判’和‘團(tuán)葉紅’較適合胚培養(yǎng)成苗的發(fā)育時(shí)期分別為花后50和70 d；‘朱砂判’的合子胚相比于帶胚乳胚，更適于啟動(dòng)和成苗培養(yǎng)；外殖體消毒的最佳方法為將心皮用70%酒精處理30～60 s，再用2%NaClO消毒20 min，之后取出胚珠用2%NaClO處理10 min；適宜的啟動(dòng)培養(yǎng)基配方為1/2MS+1.0 mg·L-1IAA+0.5 mg·L-1GA3。

芍藥；胚培養(yǎng)；不定芽

芍藥(PeaonialactifloraPall.)隸屬于芍藥科(Paeoniaceae)芍藥屬(Paeonia)，是我國(guó)原產(chǎn)的著名傳統(tǒng)花卉，已有約4000年的栽培歷史[1]。芍藥因其豐富的色彩、多變的花型及其廣泛的用途，深受世界人民的喜愛(ài)[2～3]。長(zhǎng)期以來(lái)，芍藥主要采用實(shí)生苗繁殖和分株繁殖兩種方法。分株繁殖要求有較多的繁殖材料，并且只能在生長(zhǎng)季節(jié)進(jìn)行，因此效率低下[1]。由于芍藥種子存在復(fù)雜的連續(xù)休眠特性，自然條件下，芍藥種子發(fā)芽需要兩年左右的時(shí)間，此后還要經(jīng)過(guò)多年的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段才能開(kāi)花，繁殖周期過(guò)長(zhǎng)，也嚴(yán)重影響了雜交育種進(jìn)程[4]。而其他傳統(tǒng)繁殖方法則應(yīng)用較少，且普遍效率低下，無(wú)法滿足日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需要，也影響了新品種培養(yǎng)進(jìn)程，并進(jìn)一步制約分子生物學(xué)的研究與開(kāi)展[5]。

隨著植物組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，不僅很好的克服了上述問(wèn)題，還加速了芍藥的組織培養(yǎng)育種進(jìn)程[6]。芍藥的植物組織培養(yǎng)開(kāi)始于20世紀(jì)60年代中期，Yamada和Sinoto通過(guò)培養(yǎng)山芍藥的花瓣，首次成功誘導(dǎo)出愈傷組織。直到2006年，在加拿大Planteck Biotechnologies Inc.公司，首次開(kāi)始宣傳及推廣芍藥組培苗，令大家看到了芍藥產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的希望，但其可用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的品種極為有限(后因經(jīng)營(yíng)不善而夭折)。2003年，Raghavan等將宿根亞麻(LinumperenneL.)與奧地利亞麻(L.austriacum)的雜交敗育胚進(jìn)行體外培養(yǎng)，并獲得雜種植株，開(kāi)創(chuàng)了胚培養(yǎng)技術(shù)在遠(yuǎn)緣雜交育種中應(yīng)用的先河[7]。如今該技術(shù)廣泛應(yīng)用于植物的遠(yuǎn)緣雜交育種[8～9]。因此，用胚培養(yǎng)的技術(shù)進(jìn)行芍藥的繁育以解決遠(yuǎn)緣雜交育種中出現(xiàn)的各種問(wèn)題，是加速芍藥育種進(jìn)程的必然趨勢(shì)[10～11]。根據(jù)以往經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，成熟和未成熟的胚組織都是誘導(dǎo)產(chǎn)生胚狀體和芽的適宜材料，本文以不同發(fā)育時(shí)期的幼胚為材料，探討了基因型、消毒方式、外殖體以及胚齡等因素對(duì)芍藥胚培養(yǎng)不定芽形成的影響。主要目的是：選擇出合適發(fā)育時(shí)期的幼胚外殖體，篩選出最佳外殖體類(lèi)型、消毒處理方式以及誘導(dǎo)芽發(fā)生的最佳啟動(dòng)培養(yǎng)基配方。本研究結(jié)果為芍藥組培快繁和遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立奠定基礎(chǔ)，也為提高芍藥雜交育種效率提供科學(xué)的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料‘粉玉奴’(Peaonialactiflora‘Fen Yu Nu’)、‘朱砂判’(Peaonialactiflora‘Zhu Sha Pan’)和‘團(tuán)葉紅’(Peaonialactiflora‘Tuan Ye Hong’)均取自北京市昌平區(qū)小湯山基地，生長(zhǎng)狀況良好。

1.2 方法

1.2.1 消毒方式的篩選

以‘粉玉奴’、‘朱砂判’自然授粉 50 d的心皮和胚珠為材料，以包被于其中的合子胚為外殖體。首先，將心皮在流水下沖洗24 h，把其表面徹底刷洗干凈；然后用洗潔精和NaClO浸泡20 min；最后在流水下沖洗30 min，用吸水紙吸干表面的水分，放置到超凈工作臺(tái)上進(jìn)行消毒處理。此處消毒方式分為兩種：①一步消毒處理，即心皮包被著胚珠進(jìn)行消毒，最后直接取出合子胚進(jìn)行接種。②兩步消毒處理，即先心皮包被著胚珠進(jìn)行一次消毒，再取出胚珠進(jìn)行一次消毒，最后取出合子胚進(jìn)行接種。具體消毒方式見(jiàn)表1(表中酒精或次氯酸鈉消毒后，均用無(wú)菌水沖洗3次，每次3 min)。每處理15個(gè)外殖體，重復(fù)3次。消毒處理后轉(zhuǎn)移至1/2MS+1.0 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1GA3培養(yǎng)基中，30天后統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

表1 外殖體的消毒方法

1.2.2 啟動(dòng)培養(yǎng)基的篩選

以‘朱砂判’自然授粉70 d的種子為試驗(yàn)材料，合子胚為外殖體。采用1.2.1篩選出的消毒方式進(jìn)行消毒處理，1/2MS為基本培養(yǎng)基，激素組合設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。每處理12個(gè)外殖體，3次重復(fù)。

表2 不同激素組合設(shè)計(jì)

1.2.3 發(fā)育時(shí)期和外殖體類(lèi)型對(duì)胚培養(yǎng)的影響

以‘朱砂判’自然授粉30、50、70、90 d和‘團(tuán)葉紅’自然授粉30、50、70 d的種子為試驗(yàn)材料，外殖體類(lèi)型分別為胚珠、合子胚、帶部分胚乳的合子胚(本文簡(jiǎn)稱(chēng)帶胚乳胚)3種。以1.2.1篩選出的消毒方式進(jìn)行消毒處理，接種于配方為1/2MS+1.0 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1GA3的培養(yǎng)基中，每處理24個(gè)外殖體，重復(fù)3次。

1.2.4 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基中添加蔗糖30 g·L-1、瓊脂7 g·L-1，pH調(diào)為5.8～6.0，培養(yǎng)溫度為(23±2)℃，光照時(shí)間14 h·d-1，光照強(qiáng)度為2 000～3 000 lx。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

百分?jǐn)?shù)數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)換后，采用SPSS軟件進(jìn)行方差分析與多重比較。

污染率(%)=(接種污染數(shù)/接合子胚的總數(shù))×100%

(1)

萌發(fā)率(%)=(萌發(fā)的外殖體數(shù)/接合子胚的總數(shù))×100%

(2)

成苗率(%)=(成苗的外殖體數(shù)/接合子胚的總數(shù))×100%

(3)

抽真葉率(%)=(抽出真葉的胚數(shù)/接合子胚的總數(shù))×100%

(4)

胚軸膨大率(%)=(胚軸膨大的胚數(shù)/接合子胚的總數(shù))×100%

(5)

抽莖率(%)=(抽出莖的胚數(shù)/接合子胚的總數(shù))×100%

(6)

生根率(%)=(生根的幼苗數(shù)/接合子胚的總數(shù))×100%

(7)

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒方式的篩選

接種時(shí)，選用合適的外殖體消毒方法，可以很大程度地減少污染，降低頻繁接種的工作量，并有利于在盡可能短的時(shí)間內(nèi)建立起芍藥胚離體培養(yǎng)體系。由表3可知，兩個(gè)品種經(jīng)過(guò)4種消毒方法消毒后的污染率均無(wú)顯著性差異，但是兩步消毒方式能得到較低的污染率以及較高的萌發(fā)率和成苗率。此外，兩個(gè)品種經(jīng)方法4消毒后，萌發(fā)率和成苗率均最高，污染率均最低。因此，本試驗(yàn)認(rèn)為，將心皮用70%酒精處理30～60 s后，用2%NaClO消毒20 min，再取出胚珠用2%NaClO處理10 min(即方法4)能取得較好的消毒效果。

2.2 啟動(dòng)培養(yǎng)基的篩選

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用使各培養(yǎng)基上合子胚的胚軸普遍膨大，其中2號(hào)培養(yǎng)基的胚軸膨大率最高為94.44%，與1號(hào)培養(yǎng)基相比高出了30%以上，說(shuō)明IAA與GA3配合使用可提高合子胚的膨大率。經(jīng)方差分析，各培養(yǎng)基的胚軸膨大率差異不顯著，說(shuō)明無(wú)論是單一種類(lèi)的激素還是激素的混合使用，對(duì)胚軸的刺激作用均不明顯。就抽真葉率和抽莖率的指標(biāo)而言，2號(hào)培養(yǎng)基表現(xiàn)最好，均與單一IAA處理的萌發(fā)效果差異顯著。就生根率而言，2、3、6號(hào)培養(yǎng)基表現(xiàn)良好，相互間差異不顯著，但均顯著高于5號(hào)培養(yǎng)基。此外，2、4號(hào)培養(yǎng)基最終的成苗率最高，為58.33%，均與1、5號(hào)培養(yǎng)基差異顯著，此時(shí)GA3的濃度均為0.5 mg·L-1；而當(dāng)GA3的濃度升高到1 mg·L-1時(shí)，成苗率明顯下降，可見(jiàn)當(dāng)GA3的濃度過(guò)高時(shí)，不利于胚培養(yǎng)的成苗生長(zhǎng)。具體情況見(jiàn)表4。綜合以上指標(biāo)的分析得出，1/2MS+1.0 mg·L-1IAA+0.5 mg·L-1GA3(2號(hào)培養(yǎng)基)為最適宜成苗的啟動(dòng)培養(yǎng)基。

表3 不同消毒方法的效果

表4啟動(dòng)培養(yǎng)基對(duì)‘朱砂判’合子胚啟動(dòng)生長(zhǎng)和成苗的影響

Table4Effectsofmediumonembryocultureof‘ZhuShaPan’

編號(hào)No.抽真葉率Extractionrateofeuphylla(%)胚軸膨大率Swellrateofplumularaxis(%)抽莖率Extractionrateofstem(%)生根率Rootingrate(%)成苗率Seedlingsrate(%)150.00±16.67a63.89±31.55a44.44±12.73ab55.56±31.55ab30.56±9.62a280.56±12.73b94.44±9.62a69.44±4.81c66.67±25.00b58.33±16.67b358.33±16.67ab80.56±12.73a41.67±8.33ab69.44±12.73b36.11±9.62ab472.22±4.81ab83.33±8.33a66.67±8.33c63.89±19.25ab58.33±16.67b555.56±12.73ab69.44±9.62a27.78±12.73a27.78±12.73a25.00±8.83a666.67±16.67ab86.11±9.62a52.78±9.62bc69.44±4.81b36.11±12.73ab

2.3 不同發(fā)育時(shí)期和外殖體類(lèi)型對(duì)胚培養(yǎng)的影響

結(jié)果表明，兩個(gè)芍藥品種早期(30 d)胚珠培養(yǎng)不成功，培養(yǎng)3天后幾乎所有胚珠的種孔部位均出現(xiàn)乳白色液體，推測(cè)發(fā)生污染的原因是內(nèi)部合子胚未完成器官分化。從表5可以得出，‘朱砂判’合子胚的胚軸膨大率顯著高于帶胚乳胚，由此說(shuō)明接種時(shí)去掉胚乳有助于胚軸的膨大。此外，胚軸膨大率隨著胚齡的增長(zhǎng)成遞增趨勢(shì)，合子胚成熟后(90 d)的胚軸膨大率最高。就抽真葉率、抽莖率和生根率指標(biāo)而言，花后50和90 d合子胚的生長(zhǎng)表現(xiàn)優(yōu)于70 d，但差異不顯著。此外，花后50 d合子胚的成苗率顯著高于花后50 d帶胚乳胚和70 d的合子胚，與90 d的合子胚差異不顯著。綜合幾個(gè)指標(biāo)的分析可以得出，就外殖體而言，‘朱砂判’的合子胚與帶胚乳胚相比，更適于啟動(dòng)和成苗培養(yǎng)。就發(fā)育時(shí)期而言，花后90 d的合子胚有助于幼苗的胚軸膨大、抽真葉以及生根生長(zhǎng)；而花后50 d的合子胚有助于幼苗的抽莖和成苗生長(zhǎng)，并顯著高于花后70d的成苗率，由此得出‘朱砂判’花后50 d是比較適合胚培養(yǎng)成苗的發(fā)育時(shí)期。從表6可以看出，‘團(tuán)葉紅’花后70 d合子胚各個(gè)指標(biāo)的生長(zhǎng)表現(xiàn)均優(yōu)于花后50 d時(shí)，其中胚軸膨大率和生根率與之差異顯著。由此得出，‘團(tuán)葉紅’花后70 d是比較適合胚培養(yǎng)成苗的發(fā)育時(shí)期。綜合兩個(gè)品種花后50 d合子胚的數(shù)據(jù)來(lái)看，‘朱砂判’各項(xiàng)指標(biāo)的表現(xiàn)均高于‘團(tuán)葉紅’；綜合兩個(gè)品種花后70 d合子胚的數(shù)據(jù)來(lái)看，‘團(tuán)葉紅’的抽真葉率、抽莖率和生根率均高于‘朱砂判’，而胚軸膨大率和成苗率兩個(gè)指標(biāo)與‘朱砂判’表現(xiàn)一致。綜上所述，發(fā)育時(shí)期、外殖體類(lèi)型和基因型是影響胚培養(yǎng)的重要因素。

表5 不同發(fā)育時(shí)期和外殖體類(lèi)型對(duì)‘朱砂判’啟動(dòng)培養(yǎng)和成苗的影響

表6 不同發(fā)育時(shí)期對(duì)‘團(tuán)葉紅’啟動(dòng)培養(yǎng)和成苗的影響

3 討論

3.1 不同消毒方式的篩選

不同消毒方法的試驗(yàn)結(jié)果表明，將心皮用70%酒精處理30～60 s后用2%NaClO消毒20 min，再取出胚珠用2%NaClO處理10 min能取得較好的消毒效果，表現(xiàn)在污染率大幅降低、較高的萌發(fā)率和成苗率。芍藥離體快繁中常用的消毒劑種類(lèi)有酒精、次氯酸鹽、HgCl2等[12～13]，消毒方式的選擇也不能一概而論，如何桂梅認(rèn)為：牡丹胚珠離體培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)盡量采取直接消毒的方式，即胚珠經(jīng)70%的酒精消毒30～60 s后，用0.1%的HgCl2處理6 min[8]。所以，應(yīng)根據(jù)具體的需要篩選合適的消毒方式，從而保證良好的消毒效果[14]。

3.2 啟動(dòng)培養(yǎng)基的篩選

研究發(fā)現(xiàn)，1/2MS+1.0 mg·L-1IAA+0.5 mg·L-1GA3(2號(hào)培養(yǎng)基)為最適宜成苗的啟動(dòng)培養(yǎng)基，而且較高濃度的GA3(1 mg·L-1時(shí))不利于胚培養(yǎng)的成苗生長(zhǎng)。GA3和IAA配合使用能取得較好的解除休眠的效果，與王瑩等人的研究結(jié)果基本一致[15]。于曉南等也認(rèn)為GA3是誘導(dǎo)合子胚萌發(fā)和成苗的最主要因素[16]。高昌勇等試驗(yàn)中僅用GA3便打破芍藥胚休眠，促使其萌發(fā)[10]。孫曉梅等在芍藥胚離體培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)，GA3是影響上胚軸初代培養(yǎng)的關(guān)鍵因素，與6-BA配合使用可以有效打破芍藥合子胚上胚軸休眠，刺激莖的伸長(zhǎng)[17]。由此可見(jiàn)，適宜濃度的GA3在芍藥合子胚的啟動(dòng)培養(yǎng)中發(fā)揮重要作用。

3.3 不同發(fā)育時(shí)期和外殖體類(lèi)型對(duì)胚培養(yǎng)的影響

試驗(yàn)表明，外殖體的發(fā)育時(shí)期明顯影響離體培養(yǎng)的結(jié)果，內(nèi)部合子胚完成器官分化后方可培養(yǎng)成苗。而發(fā)育早期的胚珠(30 d)不能成功培養(yǎng)，與何桂梅的研究結(jié)果一致[8]，在塊根芍藥(P.intermedia)和珊瑚芍藥(P.mascula)的相關(guān)報(bào)道中也得到了相似結(jié)論[18]。推測(cè)其原因之一可能是：內(nèi)部合子胚處于游離核或細(xì)胞化時(shí)期，而胚原基的發(fā)生涉及原始的反分化過(guò)程，這必然要求更為嚴(yán)格的發(fā)育環(huán)境；或是合子胚已經(jīng)完成細(xì)胞化，處于胚原基發(fā)生和球形胚的階段，此時(shí)為異養(yǎng)時(shí)期，需要從胚乳中吸取足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因而所需的培養(yǎng)基配方比較復(fù)雜。另一方面，早期的胚珠可能未完成受精作用，因此離體培養(yǎng)較為困難。相對(duì)而言，花后50、70、90 d的合子胚培養(yǎng)更為容易?！焐芭小汀畧F(tuán)葉紅’分別于花后50和70 d適合胚培養(yǎng)成苗，與何桂梅認(rèn)為的牡丹剛完成器官分化的早期子葉胚(約60～65 d)可很快離體培養(yǎng)成苗的觀點(diǎn)基本一致[8]。

就外殖體類(lèi)型而言，‘朱砂判’的合子胚比帶胚乳胚更適于啟動(dòng)和成苗培養(yǎng)，推測(cè)原因可能是堅(jiān)硬的外種皮阻礙了合子胚對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的吸收，導(dǎo)致合子胚污染嚴(yán)重而不萌發(fā)。這一結(jié)論也與沈苗苗的研究結(jié)果一致[19～20]。而王瑩[15]以花后90和120 d的紫斑牡丹種子為材料，發(fā)現(xiàn)以帶全部胚乳的合子胚為外殖體進(jìn)行接種，對(duì)抽真葉、抽莖等方面的萌發(fā)生長(zhǎng)均有利。其原因可能是紫斑牡丹的胚乳中含有較多的還原糖和脂肪，為胚的萌發(fā)提供了豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[21]。綜合本試驗(yàn)兩個(gè)品種表現(xiàn)來(lái)看，‘朱砂判’花后50 d的各項(xiàng)指標(biāo)表現(xiàn)均高于‘團(tuán)葉紅’，而‘團(tuán)葉紅’花后70 d的抽真葉率、抽莖率和生根率均高于‘朱砂判’。綜上所述，合子胚發(fā)育時(shí)期、外殖體類(lèi)型和基因型是影響胚培養(yǎng)的重要因素。綜合前期雜交工作和本次胚培養(yǎng)的試驗(yàn)結(jié)果，我們認(rèn)為在芍藥遠(yuǎn)緣雜交育種中應(yīng)盡可能選擇發(fā)育較為早期的合子胚，以解決親本的雜交不親和或雜合子胚的早期敗育問(wèn)題。

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AdventitiousBudInductionwithImmatureEmbryoofHerbaceousPeony

WEI Dong-Xia1,2,3GAO Kai4YUAN Yan-Bo1TANG Zheng-Jiao1YU Xiao-Nan1,2,3*

(1.College of Landscape Architecture,Beijing Forestry University,Beijing 100083；2.National Flower Engineering Research Center,Beijing 100083；3.Beijing Key Laboratory of Ornamental Plants Germplasm Innovation and Molecular Breeding,Beijing 100083；4.Luoyang Academy of Agriculture and Forestry Sciences,Luoyang 471002)

Culture of zygotic embryos is an effective way to accelerate the breeding process of herbaceous peony. With the zygotic embryos of three herbaceous peony(PaeonialactifloraPall.) cultivars(‘Fen Yu Nu’, ‘Zhu Sha Pan’ and ‘Tuan Ye Hong’), we studied the affection of different embryo age, explant types, sterilization methods and starting medium formula on root initiation in vitro. The suitable development period were 50 and 70 d after flowering for embryo-culture of ‘Zhu Sha Pan’ and ‘Tuan Ye Hong’, respectively. We got better results when using excised zygotic embryos rather than keeping part of endosperm reserved. The optimal disinfection method for explant was that firstly treating carpel for 30-60 s with 70% alcohol, then for 20 min with 2% NaClO, and finally for 10 min with 2% NaClO. The optimal initial medium was 1/2MS+1.0 mg·L-1IAA+0.5 mg·L-1GA3.

Herbaceous peony;embryo-culture;root initiation

國(guó)家自然科學(xué)基金(31400591)

魏冬霞(1991—)，女，碩士研究生。主要從事芍藥資源與育種的研究。

2015-07-28

S682.1

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.02.006