王娟，黃允寧，顏貝，王紅紅，金秀，王瀟飛，徐遠義△

（1.寧夏醫(yī)科大學病理學系，寧夏銀川750004；2.寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院，銀川750002；3.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院精子庫，寧夏銀川750001）

硫酸右旋糖苷對人胃癌細胞腹腔種植轉移防治作用的對比研究*

王娟1，黃允寧2，顏貝3，王紅紅2，金秀1，王瀟飛1，徐遠義1△

（1.寧夏醫(yī)科大學病理學系，寧夏銀川750004；2.寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院，銀川750002；3.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院精子庫，寧夏銀川750001）

目的探討預防性使用硫酸右旋糖苷（DS）和治療性使用DS對人胃癌細胞腹腔種植的作用。方法培養(yǎng)胃癌BGC-823細胞，構建裸鼠動物模型：選用BALB/C裸鼠共110只，隨機分為預防組（60只）和治療組（50只）。預防組在注射腫瘤細胞的同時注射DS，治療組注射腫瘤細胞24 h后注射DS。打開裸鼠腹腔，觀察胃癌細胞腹腔種植的數(shù)量，所有結節(jié)經HE染色證實。應用免疫組織化學染色（SP法）檢測大網膜整合素β1蛋白的表達，應用RT-PCR方法檢測大網膜整合素β1 mRNA的表達。結果HE染色結果顯示治療組裸鼠腹腔轉移的腫瘤結節(jié)數(shù)量明顯多于預防組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），SP法結果顯示治療組整合素β1蛋白的表達量明顯高于預防組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），RT-PCR結果顯示治療組整合素β1 mRNA的表達量明顯高于預防組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。結論DS預防胃癌腹腔種植轉移的效果比治療胃癌腹腔種植轉移的效果更佳。

硫酸類；右旋糖酐類；胃腫瘤/病理學；腹腔；抗原，CD29；整合素β1；種植

腫瘤腹腔種植轉移是一個多因素、連續(xù)性、多個不同階段參與的復雜過程。腫瘤細胞黏附到腹膜上是腫瘤細胞腹腔種植轉移的基本步驟之一，是由多種因素決定的。有研究表明，腫瘤的浸潤及轉移與其黏附分子表達的改變有關［1］。整合素是黏附因子家族中的一員，其表達異常與腫瘤細胞腹腔種植轉移關系密切［2］。整合素是α、β亞基以非共價鍵形成的異二聚體［3］，以整合素β1的作用最為突出，其通過胞外區(qū)與多種細胞外基質黏附，參與細胞之間及細胞與細胞外基質之間的黏附，其胞內區(qū)也可通過與細胞骨架和多種信號分子結合形成黏附物進行信號轉導［4-5］，腫瘤的發(fā)生和轉移與整合素β1的表達量有密切關系。

Hagiwara等［6］研究及本課題組前期研究［7］結果表明，硫酸右旋糖苷（DS）可以通過抑制整合素β1的表達抑制胃癌細胞的腹腔種植轉移。本研究擬進一步探討使用DS對整合素β1的表達及胃癌腹腔種植轉移的預防和治療是否有差別。現(xiàn)報道如下。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞選用北京金紫晶公司腫瘤細胞庫培育的人胃癌BGC-823細胞株，儲存于液氮中，經復蘇接種于10%滅活小牛血清RPMI-1640完全培養(yǎng)基中，在溫度37℃、濕度70%、5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.1.2實驗動物選用購自北京維通利華公司的BALB/c裸鼠為實驗對象，動物許可證號：SCXX（京）2006-0009，均為雄性，5～6周齡，體質量18～22 g。裸鼠可自由攝入無菌食物和水。

1.1.3藥品與試劑大分子DS購自美國Sigma公司，用0.9%NaCl溶液稀釋后，再利用22 μm過濾器過濾，最終配制成0.3%DS溶液。濃縮型CD34兔抗多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，兔抗鼠VEGF兔抗多克隆抗體購自圣克魯斯生物技術公司，兔抗羊二抗即用型抗體購自北京中杉金橋公司，PCR試劑盒購自日本Takara公司，Total RNA Kit購自OmegaBio-Tek公司，RT reagentKit購自美國Frementas公司。

1.2方法人胃癌細胞株腹腔種植裸鼠模型的制備：將110只BALB/c裸鼠采用隨機數(shù)字表法分為預防組（60只）和治療組（50只）。所有裸鼠在造模前進行麻醉：將戊巴比妥鈉粉末用0.9%NaCl溶液配制成0.5%戊巴比妥溶液，采用50 mg/kg的劑量麻醉裸鼠，將所有裸鼠腹部皮膚和腹中線常規(guī)消毒，選擇左側正中旁切口，長為0.8cm，暴露胃壁，將濃度為每毫升1×107個的BGC-823胃癌細胞懸浮液懸空滴入裸鼠胃壁（每只0.2 mL），使胃癌細胞懸浮液延胃壁表面流入胃壁附近的腹腔并關腹，立即向預防組裸鼠腹腔中注射0.3%DS（每只1 mL）；治療組裸鼠于注射癌細胞24 h后向裸鼠的腹腔中注射0.3%DS（每只1 mL）。整個造模過程中嚴格遵循無菌操作。預防組分別在注射癌細胞后1、2、3、7、14 d處死裸鼠，并留一自然死亡組，根據這6個處死時間隨機均分為6個小組，每組10只。治療組分別在注射癌細胞的2、3、7、14 d處死裸鼠，并留一自然死亡組，根據5個處死時間隨機均分為5個小組，每組10只。

1.2.1實驗裸鼠的處理按時間點采用頸椎脫臼法處死裸鼠，取大網膜組織均分為2份，其中一份大網膜組織立即置于10%甲醛固定液中，用于HE染色、免疫組織化學染色（SP法）；另一份大網膜組織放入凍存管［預先消毒并用焦碳酸二乙酯溶液處理］中，在-80℃冰箱中儲存，用作RT-PCR實驗。

1.2.2HE染色及SP法將所取標本經如下步驟：10%甲醛固定，石蠟包埋、切片、HE染色、SP法處理。整合素β1經SP法后加入磷酸緩沖鹽溶液（PBS）代替一抗作陰性對照，以細胞膜及細胞質出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達標準。在IPP圖像自動分析系統(tǒng)中，400倍鏡下選定空白區(qū)作為測定標準，再選定具有代表性的5個視野，利用IPP圖像自動分析系統(tǒng)對所選視野的平均光密度（optical density，OD）值進行計算，比較各組整合素β1的表達情況。

1.2.3RT-PCR利用Total RNA Kit試劑盒提取大網膜組織的總RNA，按試劑盒說明書進行操作，反轉錄合成cDNA。上海生工生物工程有限公司合成整合素β1引物，上游引物：5′-CGTAGCAAAGGAACAGCAGA-3′，下游引物：5′-GTAAGACAGGTCCATAAGGTAGTAG-3′，擴增片段長度為168 bp，反應條件：94℃4 min，94℃30 s，54.2℃30 s，72℃1 min，共30個循環(huán)，72℃7 min。磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）引物購自美國Fermatans公司，上游引物：5′-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3′，下游引物：5′-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′，擴增片段長度為496 bp，反應條件：94℃4 min，94℃30 s，58℃30 s，72℃1 min，共30個循環(huán)，72℃7 min。對PCR產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，再用溴化乙啶進行染色，采用美國Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)進行拍照，記錄染色結果，采集圖像的擴增產物用Quantity One分析系統(tǒng)進行分析，基因表達豐度用相對光密度（relative optical density，ROD）代表，按整合素β1 ROD值/GAPDH ROD值計算各組的OD值。

1.3統(tǒng)計學處理應用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據分析，計量資料以表示，兩樣本比較采用t檢驗，多樣本比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1HE染色檢測預防組和治療組不同時間點腹腔種植的腫瘤結節(jié)數(shù)比較小鼠腹腔種植的腫瘤結節(jié)體積大小不一，質地略硬，表面較光滑，呈灰白色或瓷白色。界限清楚的腫瘤結節(jié)記為一個大結節(jié)，相互融合的記為一個獨立結節(jié)，所有結節(jié)均經HE染色證實病理類型為胃癌轉移結節(jié)。隨著注射癌細胞時間的延長，預防組和治療組腹腔種植的腫瘤結節(jié)數(shù)均逐漸增多，第14天、自然死亡時預防組小鼠腹腔種植的腫瘤結節(jié)數(shù)明顯少于治療組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。且兩組腹腔種植的腫瘤結節(jié)數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=2.296，P= 0.044）。見表1。

2.2SP法檢測預防組和治療組不同時間點整合素β1表達OD值比較預防組第2、3天及自然死亡時整合素β1表達OD值明顯低于治療組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。且兩組整合素β1表達OD值比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=243.890，P=0.000）。見圖1、表2。

2.3RT-PCR法檢測預防組和治療組不同時間點整合素β1mRNA表達ROD值比較與治療組比較，預防組第3、7、14天整合素β1 mRNA表達ROD值明顯下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。且兩組整合素β1 mRNA表達ROD值比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=49.844，P=0.002）。見表3。

表1　HE染色檢測預防組與治療組不同時間點腹腔種植的腫瘤結節(jié)數(shù)比較（，個）

表1　HE染色檢測預防組與治療組不同時間點腹腔種植的腫瘤結節(jié)數(shù)比較（，個）

注：-表示無此項。

組別預防組治療組t P n 10 10 --第1天第2天第3天第7天第14天自然死亡時FP 0.00±0.002.2960.044 ---0.00±0.00 0.33±0.52 -1.581 0.175 0.67±0.82 1.67±2.34 -0.989 0.346 4.60±3.20 6.83±3.55 -1.146 0.279 10.50±3.45 18.83±8.28 -2.244 0.049 41.83±3.75 58.00±2.90 -2.256 0.047 ----

表2　SP法檢測預防組和治療組不同時間點整合素β1表達OD值比較（）

表2　SP法檢測預防組和治療組不同時間點整合素β1表達OD值比較（）

注：-表示無此項。

組別預防組治療組t P n 10 10 --第1天第2天第3天第7天第14天自然死亡時FP 35.75±0.95 ---9.90±1.34 14.87±0.41 -6.190 0.003 28.84±2.15 49.41±1.22 -14.403 0.000 50.85±0.82 53.56±2.53 -1.757 0.154 58.36±0.81 57.22±1.62 1.096 0.335 94.35±3.49 171.57±11.98 -10.723 0.000 243.8900.000 ----

表3　RT-PCR法檢測預防組和治療組不同時間點整合素β1 mRNA表達ROD值比較（）

表3　RT-PCR法檢測預防組和治療組不同時間點整合素β1 mRNA表達ROD值比較（）

注：-表示無此項。

組別預防組治療組t P n 10 10 --第1天第2天第3天第7天第14天自然死亡時FP 1.05±0.0949.8440.002 ---1.22±0.11 1.60±0.27 -2.327 0.080 1.19±0.05 1.76±0.12 -7.410 0.002 1.56±0.10 2.44±0.10 -11.164 0.000 1.82±0.18 2.63±0.10 -6.652 0.003 2.22±0.08 2.15±0.17 0.652 0.550 ----

圖1　SP法檢測預防組和治療組第3天整合素β1的表達（400×）

3　討論

胃癌在全國和世界范圍內都有很高的發(fā)病率和死亡率，隨著近年來胃癌根治術的不斷開展和成熟，胃癌的治療和預后有了明顯的改善，但由于胃癌的復發(fā)和轉移使胃癌在各種惡性腫瘤中的病死率仍居于前列。胃癌術后的腹腔化療是阻止胃癌腹腔種植轉移的常規(guī)治療手段。目前用于胃癌腹腔化療的藥物很多，但由于在腹腔吸收快，無法達到長期有效藥物濃度等原因，治療效果不是十分理想。本研究采用的DS是一種大分子右旋糖苷，相對分子質量大，約為50×104，在腹腔的吸收慢，使其能夠在腹腔內長期維持有效的藥物濃度。國外自1997年就有科研人員開始研究DS的抗癌作用。有研究已表明，DS可以阻止B-16黑色素瘤細胞在大網膜乳斑和腹膜上種植［8-9］，可以安全地用于胃腸吻合手術。

腫瘤的侵襲和轉移是指腫瘤從原發(fā)部位脫離向周圍和遠處組織擴散形成另一同類型的腫瘤［1］，是一個多因素、多階段的復雜過程。其基本步驟包括：癌細胞脫落進入腹腔形成具有生物活性的脫落癌細胞；脫落癌細胞在腹腔內游走并黏附于腹膜；癌細胞著床，增殖侵襲，最終發(fā)展成具有生物活性的轉移癌結節(jié)。在這一過程中，細胞黏附是一個重要環(huán)節(jié)。有研究表明，無論體內還是體外實驗均證實，整合素β1在胃癌細胞黏附固定于腹膜的過程中起著關鍵的作用［6，8］。Matsuoka等［10］在研究胃癌細胞株OCUM-2MD3附著于腹膜的過程中，發(fā)現(xiàn)整合素β1在具有腹膜轉移特性的OCUM-2MD3細胞中表達量明顯增高，且明顯高于OCUM-2MD3（不具腹膜轉移特性胃癌細胞株）的表達?？梢娬纤卅?在腫瘤細胞離開腫瘤母體侵襲到腹膜的這一過程中，尤其在黏附過程中起著至關重要的作用。

本實驗將小鼠開腹注入癌細胞后，預防組立即注射DS，在胃癌細胞發(fā)生腹腔種植之前DS就以一定的濃度存在，以此研究DS的預防作用，而治療組是在癌細胞注射24 h后再注射DS，使胃癌細胞先于DS在腹腔中存在，以此研究DS的治療作用。本課題組前期的實驗結果已表明，DS可以減少胃癌細胞腹腔種植轉移瘤的數(shù)量，并可能通過抑制整合素β1的表達抑制胃癌細胞的腹腔種植轉移［11-12］。本研究中SP法和RT-PCR結果均顯示，預防組整合素β1的表達明顯低于治療組，預防組癌細胞腹腔種植的數(shù)量也明顯少于治療組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），說明DS預防胃癌腹腔種植轉移的效果明顯優(yōu)于治療的效果。

本課題組前期對DS抑制胃癌腹腔種植的作用進行了深入研究，但對于DS何時應用效果更好還沒有明確的支持依據。本研究通過比較預防組和治療組胃癌細胞腹腔種植轉移的腫瘤結節(jié)數(shù)和整合素β1的表達量，研究DS對胃癌腹腔種植轉移預防和治療效果的影響，結果顯示，預防性使用DS使癌細胞一進入腹腔就處于DS的藥物環(huán)境中比癌細胞注入24 h再治療性使用DS的效果好。這一研究結果為DS的具體臨床用藥時間提供了依據，為臨床胃癌腹腔種植轉移的預防性用藥提供了廣闊的前景。

［1］Kawamura T，Endo Y，Yonemura Y，et al.Significance of integrin alpha2/ beta1 in peritoneal dissemination of a human gastric cancer xenograft model［J］.Int J Oncol，2001，18（4）：809-815.

［2］NiuG，ChenX.Whyintegrinasaprimarytargetforimaging and therapy［J］. Theranostics，2011，1：30-47.

［3］Longhurst CM，Jennings LK.Integrin-mediated signal transduction［J］. Cell Mol Life Sci，1998，54（6）：514-526.

［4］Gruber G，Hess J，Stiefel C，et al.Correlation between the tumoral expression of beta3-integrin and outcome in cervical cancer patients who had undergone radiotherapy［J］.Br J Cancer，2005，92（1）：41-46.

［5］Miranti CK，Brugge JS.Sensing the environment：a historical perspective on integrin signal transduction［J］.Nat Cell Biol，2002，4（4）：E83-90.

［6］Hagiwara A，Sawai K，Sakakura C，et al.Prevention of peritoneal metastasis of cancer with dextran sulfate——an experimental study in mice［J］.Anticancer Drugs，1997，8（9）：894-897.

［7］徐遠義，黃允寧，王煒，等．硫酸右旋糖苷抑制人胃癌細胞粘附以及整合素β1基因表達的機制研究［J］．中國藥理學通報，2007，23（12）：1552-1555．

［8］Hagiwara A，Sakakura C，Yamasaki J，et al.Dextran sulfate inhibits injured abdominal wall-specific tumor implantation in mice［J］.Anticancer Drugs，2000，11（10）：873-877.

［9］Chen X，Liu S，Hou Y，et al.MicroPET imaging of breast cancer alphavintegrin expression with 64Cu-labeled dimeric RGD peptides［J］.Mol Imaging Biol，2004，6（5）：350-359.

［10］Matsuoka T，Hirakawa K，Chung YS，et al.Adhesion polypeptides are useful for the prevention of peritoneal dissemination of gastric cancer［J］. Clin Exp Metastasis，1998，16（4）：381-388.

［11］王娟，趙雪艷，榮小偉，等．硫酸右旋糖苷對人胃癌細胞腹腔種植轉移和整合素β1表達的影響［J］．診斷病理學雜志，2014，21（4）：224-227．

［12］王娟，趙雪艷，王紅紅，等．硫酸右旋糖苷對人胃癌細胞腹腔種植轉移和VEGF表達的影響［J］．臨床與實驗病理學雜志，2014，30（6）：625-628．

Comparative study of prevention and treatment effect of dextran sulfate on human gastric cancer cells celiac planting metastasis*

Wang Juan1，Huang Yunning2，Yan Bei3，Wang Honghong2，Jin Xiu1，Wang Xiaofei1，Xu Yuanyi1△
（1.Department of Pathology，Ningxia Medical University，Yinchuan，Ningxia 750004，China；2.Ningxia Hui Autonomous Region People′s Hospital，Yinchuan 750002，China；3.Sperm Bank，General Hospital of Ningxia Medical University，Yinchuan，Ningxia 750001，China）

ObjectiveTo study the effect of dextran sulfate（DS）between preventive use and treatment use on human gastric cancer cells celiac plantation.MethodsGastric cancer BGC-823 cells were cultured for constructing the nude mice model.One hundred and ten BALB/C nude mice were randomly divided into the prevention group（60 cases）and treatment group（50 cases）.The prevention group was simultaneously injected by tumor cells and DS，while the treatment group was injected with DS at 24 h after injecting tumor cells.The abdominal cavity of nude mice was opened for observing the celiac planting number of gastric cancer cells.The whole nodules were verified by the HE staining.The expression level of greater omentum integrin β1 protein was detected by immunohistochemistry and the expression of greater omentum integrin β1 mRNA was detected by reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）.ResultsThe HE staining showed the number of intraperitoneal metastatic tumor nodules in the treatment group was significantly more than that of the prevention group，the difference was statistically significant（P＜0.01）.The immunohistochemical results showed that the expression of integrin β1 protein in the treatment group was significantly higher than that in the prevention group，the difference was statistically significant（P＜0.05）.The RT-PCR results showed that the expression of integrin β1 mRNA in the treatment group was significantly higher than that in the prevention group，the difference was statistically significant（P＜0.01）.ConclusionDS has better effect for preventing gastric cancer celiac implanting metastasis than for treating gastric cancer celiac implanting metastasis.

Sulfuric acids；Dextrans；Stomach neoplasms/pathology；Abdominal cavity；Antigens，CD29；Integrin beta 1；Plant

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.18.004

A

1009-5519（2016）18-2793-03

寧夏回族自治區(qū)科技廳科技支撐項目（2002310201）；寧夏醫(yī)科大學校級課題項目（XM2015002）。

王娟（1987-），碩士研究生，從要從事腫瘤病理研究工作。

△，E-mail：nxxyy@hotmail.com。

（2016-04-15）