周思敏，唐嫻，鄧鵬，董蘭嵐，何元，賈燕，白群華，肖虹

（重慶醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與管理學(xué)院/醫(yī)學(xué)與社會(huì)發(fā)展研究中心/健康領(lǐng)域社會(huì)風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測治理協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶400016）

鉻還原酶ChrT工程菌的遺傳穩(wěn)定性研究*

周思敏，唐嫻#，鄧鵬，董蘭嵐，何元，賈燕，白群華，肖虹△

（重慶醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與管理學(xué)院/醫(yī)學(xué)與社會(huì)發(fā)展研究中心/健康領(lǐng)域社會(huì)風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測治理協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶400016）

目的研究重組鉻還原酶ChrT工程菌的遺傳穩(wěn)定性。方法將ChrT工程菌傳至50代，每10代進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性相關(guān)檢測。同時(shí)設(shè)置不加菌液的對(duì)照組作為空白對(duì)照組。結(jié)果各代ChrT工程菌的菌落生長形態(tài)、革蘭染色、生化反應(yīng)結(jié)果與原代菌株一致；各代ChrT工程菌質(zhì)粒穩(wěn)定，ChrT基因序列未見突變或丟失；經(jīng)異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)表達(dá)后，各代ChrT工程菌的目的蛋白表達(dá)水平與原代無明顯差別；在含六價(jià)鉻［Cr（Ⅵ）］50 mg/L的LB液體培養(yǎng)基中，與空白對(duì)照組比較，48 h后各代ChrT工程菌培養(yǎng)基中Cr（Ⅵ）的質(zhì)量濃度明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；各代ChrT工程菌間除Cr（Ⅵ）能力比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論ChrT工程菌生物學(xué)特性穩(wěn)定，可用于治理環(huán)境中Cr（Ⅵ）的污染。

鉻；大腸桿菌；基因表達(dá)；生物轉(zhuǎn)化；鉻還原酶；工程菌；遺傳穩(wěn)定性

鉻是一種非常重要的金屬元素，廣泛地應(yīng)用于冶金、制革、顏料、染料、香料、造幣、醫(yī)藥等制造行業(yè)，具有巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值［1］。隨著工業(yè)化進(jìn)程的不斷推進(jìn)，中國已成為世界鉻鹽生產(chǎn)大國，每年的產(chǎn)鉻總量超過30萬噸［2］；然而，含鉻廢水未經(jīng)處理直接排放及鉻渣的任意堆積，對(duì)水體和土壤等環(huán)境都造成了嚴(yán)重污染［3-4］。環(huán)境中常見的鉻其存在形式有三價(jià)鉻［Cr（Ⅲ）］和六價(jià)鉻［Cr（Ⅵ）］2種［4-6］；Cr（Ⅵ）由于有極高的水溶性，其毒性遠(yuǎn)大于水溶性低的Cr（Ⅲ），是國際公認(rèn)的致癌金屬物之一［2，7］。Cr（Ⅵ）可經(jīng)皮膚、呼吸和飲食進(jìn)入人類機(jī)體，對(duì)皮膚、呼吸道和消化道有刺激和致癌作用［8］。因此，治理環(huán)境中的Cr（Ⅵ）污染十分必要。

目前，國內(nèi)外處理環(huán)境中的Cr（Ⅵ）污染大多采用理化法，如化學(xué)還原法、離子交換法、吸附法、膜分離法等［9-10］，但理化法存在消耗原材料多、產(chǎn)生大量淤泥、處理費(fèi)用高、容易產(chǎn)生新污染等缺點(diǎn)［11］。近年發(fā)展起來的生物治理方式可利用微生物的吸附使環(huán)境中Cr（Ⅵ）的濃度降低，或利用微生物的鉻還原酶使Cr（Ⅵ）還原為Cr（Ⅲ），從而達(dá)到Cr（Ⅵ）解毒的目的［12-14］。這種微生物治理方法具有經(jīng)濟(jì)、高效、無須大量化學(xué)試劑、無二次新污染等諸多優(yōu)點(diǎn)［15］，已成為世界各國治理環(huán)境中Cr（Ⅵ）污染的研究熱點(diǎn)。鉻還原酶ChrT是一種黃素蛋白，以還原型輔酶Ⅱ（NADPH）為電子供體，以Cr（Ⅵ）為電子受體（底物），為呼吸鏈提供電子，同時(shí)達(dá)到還原底物的目的［16］，即將Cr（Ⅵ）還原為Cr（Ⅲ）。沙雷菌（Serratia sp.）S2是從長期Cr（Ⅵ）污染的環(huán)境中分離篩選出具有高效除Cr（Ⅵ）能力的細(xì)菌［17］，被證實(shí)具有鉻還原的相關(guān)基因ChrT［18］。目前已利用基因工程技術(shù)將ChrT基因連接至表達(dá)載體并轉(zhuǎn)入宿主菌大腸埃希菌（E.coli）BL21（DE3），使其獲得清除Cr（Ⅵ）能力，成功構(gòu)建了ChrT工程菌［19］；但對(duì)于實(shí)際應(yīng)用中工程菌的穩(wěn)定性并未深入研究。因此，本研究以鉻還原酶ChrT工程菌為基礎(chǔ)，探討其遺傳穩(wěn)定性，為工程菌實(shí)際應(yīng)用的可行性提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種與質(zhì)粒大腸埃希菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞［天根生化科技（北京）公司］，表達(dá)載體pET-28a（+）（Novagen公司）。

1.1.2主要試劑質(zhì)粒小提試劑盒、2×Pfu PCR Master-Mix高保真酶［天根生化科技（北京）公司］，異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）、DNA marker（日本Takara公司），LB培養(yǎng)基、卡那霉素［生工生物工程（上海）股份有限公司］；其他試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純?cè)噭?/p>

1.2方法

1.2.1ChrT工程菌傳代取適量ChrT工程菌接種于100 mL的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min離心，培養(yǎng)24 h轉(zhuǎn)種傳代，共傳50代。每10代取菌液進(jìn)行1次遺傳穩(wěn)定性相關(guān)檢測。

1.2.2菌落生長形態(tài)觀察每10代取菌液劃線接種于LB平板，于37℃培養(yǎng)24 h，觀察各代ChrT工程菌菌落生長形態(tài)。

1.2.3革蘭染色每10代取菌液按照常規(guī)方法［20］進(jìn)行革蘭染色，于普通光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)菌染色情況。

1.2.4生化反應(yīng)每10代取菌液接種大腸埃希菌微量生化反應(yīng)管，于37℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。

1.2.5重組質(zhì)粒鑒定每10代取適量菌液用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，操作步驟參照試劑盒說明書；以提取的質(zhì)粒為模板，進(jìn)行ChrT基因的PCR擴(kuò)增并將擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.6蛋白表達(dá)產(chǎn)物檢測每10代取1 mL菌液接種于100 mL LB培養(yǎng)液中，37℃，250 r/min離心；3 h后加入誘導(dǎo)劑IPTG，37℃，200 r/min離心；10 h后取菌液進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），檢測ChrT蛋白的表達(dá)水平。

1.2.7ChrT工程菌除Cr（Ⅵ）能力檢測每10代取1mL菌液接種于100 mL含50 mg/L Cr（Ⅵ）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min離心，48 h后取上清液，檢測其Cr（Ⅵ）水平，以確定各代ChrT工程菌去除Cr（Ⅵ）的能力。每一種處理均設(shè)置3個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)置不加菌液的對(duì)照組作為空白對(duì)照組。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以表示，采用2個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較各代ChrT工程菌與空白對(duì)照組的除Cr（Ⅵ）能力，單因素方差分析比較各代ChrT工程菌間的除Cr（Ⅵ）能力，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1ChrT工程菌菌落生長形態(tài)原代（第0代）與第50代ChrT工程菌在LB平板上的生長形態(tài)無明顯區(qū)別，均為典型的大腸埃希菌菌落形態(tài)：白色、圓形、隆起、光滑，無雜菌生長，與文獻(xiàn)［21］報(bào)道一致。見圖1。

2.2ChrT工程菌革蘭染色鏡下觀察，各代ChrT工程菌的革蘭染色結(jié)果均為革蘭陰性無芽孢桿菌，見圖2。

圖1　ChrT工程菌菌落生長形態(tài)

圖2　ChrT工程菌革蘭染色

2.3各代ChrT工程菌生化反應(yīng)各代ChrT工程菌的生化反應(yīng)結(jié)果均未發(fā)生改變，與大腸埃希菌相符，見表1。

表1　各代ChrT工程菌菌株生化反應(yīng)結(jié)果

2.4重組質(zhì)粒各代ChrT工程菌質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖3。各代均能擴(kuò)增出全ChrT基因（約600 bp），且各代ChrT基因的測序結(jié)果一致，并未發(fā)生變異。

圖3　各代ChrT工程菌質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物鑒定

2.5目的蛋白表達(dá)各代ChrT工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的目的蛋白表達(dá)結(jié)果見圖4。各代ChrT工程菌均能表達(dá)出目的蛋白（約為26×103），且表達(dá)水平與原代無明顯差別。

圖4　各代ChrT工程菌目的蛋白的表達(dá)水平

2.6ChrT工程菌鉻還原能力測定各代ChrT工程菌的除Cr（Ⅵ）效率見圖5。各代ChrT工程菌對(duì)Cr（Ⅵ）都具有一定還原能力；在含Cr（Ⅵ）50 mg/L的LB液體培養(yǎng)基中，與空白對(duì)照組比較，48 h后各代ChrT工程菌培養(yǎng)基中Cr（Ⅵ）的質(zhì)量濃度明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；同時(shí)，各代ChrT工程菌除Cr（Ⅵ）能力并未發(fā)生改變，各組間剩余的Cr（Ⅵ）質(zhì)量濃度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），除Cr（Ⅵ）率約為40%。

圖5　各代ChrT工程菌的除Cr（Ⅵ）能力

3　討論

微生物治理Cr（Ⅵ）污染的應(yīng)用中，由于Cr（Ⅵ）對(duì)細(xì)菌的DNA具有損傷，除Cr（Ⅵ）的效率和穩(wěn)定性不穩(wěn)定［22］。為解決這一問題，有研究者提出將鉻相關(guān)基因?qū)肫渌m應(yīng)力更強(qiáng)的宿主菌中，構(gòu)建高效除Cr（Ⅵ）工程菌［23］。ChrT工程菌是利用基因工程技術(shù)，以沙雷菌S2基因組DNA為模板，擴(kuò)增鉻還原酶ChrT基因，將所得ChrT基因連接至表達(dá)載體pET-28a（+）并轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞大腸埃希菌BL21（DE3）所獲得［24］；大腸埃希菌獲得了鉻還原酶ChrT基因并使之表達(dá)，從而具有了除Cr（Ⅵ）的能力。

大腸埃希菌具有易培養(yǎng)、遺傳背景清楚、載體受體系統(tǒng)完備、生長快速等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為基因工程構(gòu)建中的主要宿主菌之一［25-27］。然而，其質(zhì)粒加上外源基因并轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌BL21（DE3）之后，可能會(huì)產(chǎn)生一系列的生理效應(yīng)，影響其自身的穩(wěn)定性［22］；此外，在大腸埃希菌表達(dá)外源基因時(shí)，有時(shí)會(huì)引起重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定［28］。近年來，有學(xué)者指出工程菌的不穩(wěn)定包括了質(zhì)粒的不穩(wěn)定及其表達(dá)產(chǎn)物的不穩(wěn)定2個(gè)方面［26］，進(jìn)而直接影響工程菌性能及目的蛋白的表達(dá)；因此，對(duì)于利用基因工程技術(shù)擴(kuò)展微生物的實(shí)際應(yīng)用而言，這是一個(gè)必須解決的重要問題。就目前的研究來看，主要的解決方法為組建合適的載體、選擇適當(dāng)?shù)乃拗鳌⑹┘舆x擇壓力、控制基因過量表達(dá)、控制培養(yǎng)條件等［29-30］。

工程菌經(jīng)過多代增殖后，宿主菌穩(wěn)定性、質(zhì)粒穩(wěn)定性和表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性在實(shí)際應(yīng)用中至關(guān)重要。本研究通過對(duì)鉻還原酶ChrT工程菌進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并對(duì)不同代菌株的生物學(xué)、遺傳學(xué)特性的穩(wěn)定性進(jìn)行了全面檢測。結(jié)果表明，連續(xù)傳代50代，各代ChrT工程菌菌株的菌落生長形態(tài)、革蘭染色、生化反應(yīng)、重組質(zhì)粒、目的蛋白表達(dá)水平及除Cr（Ⅵ）能力均與原代一致，說明該ChrT工程菌具有良好的遺傳穩(wěn)定性，能夠確保ChrT基因在大腸埃希菌BL21（DE3）內(nèi)持續(xù)穩(wěn)定地表達(dá)，并在各代間保持量產(chǎn)、活性等一致，為大規(guī)模生產(chǎn)和實(shí)際應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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Study on genetic stability of recombinant chromium reductase ChrT engineered bacterium*

Zhou Simin，Tang Xian#，Deng Peng，Dong Lanlan，He Yuan，Jia Yan，Bai Qunhua，Xiao Hong△（School of Public Health and Management，Research Center for Medicine and Social Development，Collaborative Innovation Center for Social Risk Prediction and Governance in Health Field，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）

ObjectiveTo study the genetic stability of recombinant chromium reductase（ChrT）engineered bacterium. MethodsThe ChrT engineered bacterium was subcultured for 50 passages and the genetic stability related detection was performed in every 10 passages.At the same time the blank control group without adding the bacterial solution was set.ResultsThe colony growth pattern，Gram′s staining and biochemical reaction results of every passage of ChrT engineered bacterium were consistent with the primary bacterial strain；plasmids in each passage of ChrT engineered bacterium were stable and ChrT gene sequences had no mutation or loss；after IPTG induction expression，the expression level of target protein in each passage of ChrT engineering bacterium had no significant difference from the primary passage；in the liquid medium containing hexavalent Cr（Ⅵ）50 mg/L LB，the mass concentration of Cr（Ⅵ）after 48 h in the ChrT engineering bacterial medium in each passage was significantly decreased compared with the blank control group，the difference was statistically significant（P＜0.05）；except the Cr（Ⅵ）ability，the differences among different passages of ChrT engineering bacterium had no statistical significance（P＞0.05）.ConclusionThe ChrT engineeredbacteriumshowsstable biologicalcharacteristicsandcanbe usedto governthe environmentalCr（Ⅵ）contamination.

Chromium；Escherichia coli；Gene expression；Biotransformation；Chromate reductase；Engineered strain；Genetic stability

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.18.003

A

1009-5519（2016）18-2789-04

重慶市教委科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（KJ1500216）；重慶醫(yī)科大學(xué)大學(xué)生科學(xué)研究與創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目（201410）。

周思敏（1992-），碩士研究生，主要從事微生物與環(huán)境污染治理工作；唐嫻（1993-），本科，主要從事衛(wèi)生檢驗(yàn)方向研究。#為共同第一作者。

△，E-mail：xhk20@163.com。

（2016-05-19）