王穎，黃勇，張小容，羅高興，賀偉峰，吳軍

（第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院全軍燒傷研究所/創(chuàng)傷、燒傷及復合傷國家重點實驗室/疾病蛋白組學重慶市市級重點實驗室，重慶400038）

尿蛋白電泳分析和質(zhì)譜鑒定

王穎，黃勇，張小容，羅高興，賀偉峰，吳軍△

（第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院全軍燒傷研究所/創(chuàng)傷、燒傷及復合傷國家重點實驗室/疾病蛋白組學重慶市市級重點實驗室，重慶400038）

目的探究尿蛋白的最佳沉淀方法，且對常規(guī)損失蛋白進行鑒定分析。方法采用有機溶劑沉淀法，即用三氯乙酸/90%丙酮法、三氯乙酸/100%丙酮法和90%丙酮法分別沉淀尿液中蛋白質(zhì)，對90%丙酮法所得到沉淀的可溶部分和不溶部分進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺分離和質(zhì)譜鑒定。結(jié)果90%丙酮沉淀法獲得的尿蛋白量相對較高。將90%丙酮法沉淀的尿蛋白不溶部分和可溶部分進行質(zhì)譜鑒定，可溶部分得到53種蛋白，不溶部分得到49種蛋白，且不溶部分特有的蛋白包括免疫球蛋白κ輕鏈基因1～5、谷氨酰氨肽酶、突變體1、芳基硫酸酯酶A前體等14種。結(jié)論尿液沉淀的不溶部分中特有蛋白的發(fā)現(xiàn)有助于尿液蛋白質(zhì)組的全譜研究，對臨床特異蛋白的檢測具有重要意義。

蛋白尿/診斷；沉淀；電泳，聚丙烯酰氨凝膠；蛋白質(zhì)組學；質(zhì)譜分析法

尿液是血液經(jīng)腎小球濾過，腎小管和集合管重吸收、排泄及分泌產(chǎn)生的終末代謝產(chǎn)物［1］。因此，能在血清中發(fā)現(xiàn)的蛋白也可能在尿蛋白中被檢測到。尿液的組成與性狀可反映整個泌尿系統(tǒng)狀況，尤其是尿液中蛋白質(zhì)種類和數(shù)量的變化攜帶有泌尿系統(tǒng)疾病發(fā)生、發(fā)展及預后的各種信息，尿液還能反映其他人體器官的相關(guān)情況。尿液來源簡單、方便、無損傷，患者容易接受，無不適感及禁忌證。隨著尿液蛋白質(zhì)組學的發(fā)展，各種沉淀尿蛋白的方法得到大量探索。劉靖芳等［2］采用丙酮沉淀法、乙腈/0.1%三氟乙酸沉淀法及三氯乙酸/丙酮沉淀法沉淀尿液標本中蛋白質(zhì)，對沉淀蛋白進行雙向電泳，結(jié)果顯示，三氯乙酸/丙酮沉淀法能提高尿液標本雙向電泳蛋白檢出靈敏度，提高檢測效果。有研究采用50%丙酮沉淀法、超濾離心法提取尿蛋白，結(jié)果顯示，丙酮沉淀法獲得的蛋白質(zhì)譜鑒定數(shù)目更多［3］。有研究采用醋酸、丙酮、乙腈、硫酸銨、氯仿、乙醇、甲醇分別按10%、25%、50%、75%、90%進行蛋白沉淀發(fā)現(xiàn)，90%乙醇沉淀的尿蛋白獲得最高回收率［4］。Adachi等［5］通過超慮法濃縮尿蛋白，質(zhì)譜鑒定到1 500種高可信蛋白。Lee等［6］對真空離心、乙醇沉淀、超濾、富集柱4種方法比較蛋白回收率發(fā)現(xiàn)，真空離心蛋白回收率最高。盡管蛋白質(zhì)技術(shù)在不斷發(fā)展、更新，尿蛋白提取方法仍是尿液蛋白質(zhì)組學發(fā)展中的瓶頸技術(shù)［7］。為更好地進行疾病相關(guān)的尿液蛋白質(zhì)組學的定量研究，準確反應(yīng)各種蛋白質(zhì)在尿液中的真實分布，綜合文獻報道，本研究針對常用的幾種有機溶劑方法對尿液蛋白質(zhì)富集的影響進行了進一步探討，通過一維十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（twelve alkylsodium sulfate-polyacrylamide，SDS-PAGE）初步觀察蛋白提取效果，并針對一些實驗中遇到的常規(guī)問題進行了具體分析，現(xiàn)報道如下。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1標本來源收集16例健康者（健康體檢正常的志愿者）晨中段尿液各40 mL，其中男8例，女8例；年齡25～27歲。等份混合后12 000 g、4℃離心30 min，去掉細胞碎片等雜質(zhì)，上清液按每管1 mL分裝，于-80℃保存待用。

1.1.2儀器與試劑Bradford試劑盒（Thermo，USA）、胰酶（Promega，USA）、電泳使用的試劑（上海生工公司）、沉淀使用的有機試劑（重慶川東化工廠）、超速低溫離心機（Beckman，USA）、垂直電泳裝置（Bio-Rad，USA）、微量注射器、通風櫥、掃描儀（Bio-Rad，USA）、高效液相色譜（hygh-performance liquid chromatography，HPLC）-芯片（Chip）-串聯(lián)質(zhì)譜（massspectrometry，MS）/MS（Agilent6330，USA）等。

1.2方法

1.2.1尿蛋白提取將尿液樣品按以下3種方法進行蛋白質(zhì)提取。

1.2.1.1組一（三氯乙酸/90%丙酮法）取男、女尿液各1份于冰上融化，分別加入111 μL 4℃預冷的三氯乙酸溶液達到10%，充分混勻，置4℃冰箱沉淀14 h后經(jīng)12 000 g、4℃離心30 min棄上清液，沉淀用1 mL 90%丙酮溶液重懸后12 000 g、4℃離心30 min棄上清液，置通風櫥內(nèi)吹干備用。

1.2.1.2組二（三氯乙酸/100%丙酮法）取男、女尿液各1份于冰上融化，分別加入111 μL 4℃預冷的三氯乙酸溶液達到10%，充分混勻，置4℃冰箱沉淀14 h后經(jīng)12 000 g、4℃離心30 min棄上清液，沉淀用1 mL 100%丙酮溶液重懸后12 000 g、4℃離心30 min棄上清液，置通風櫥內(nèi)吹干備用。

1.2.1.3組三（90%丙酮法）取男、女尿液各1份于冰上融化，分別加入9 mL 4℃預冷的丙酮達到90%，充分混勻，置4℃冰箱沉淀14 h后12 000 g、4℃離心30 min棄上清液，沉淀置通風廚內(nèi)吹干備用。

1.2.2沉淀物重溶將三組干燥的沉淀用40 μL去離子水溶解，組一、二沉淀物均完全溶解，組三重懸后能觀察到明顯的不溶物，5 000 g、4℃離心10 min，分離組三可溶和不溶物部分。

1.2.3SDS-PAGE電泳將組一、二、三沉淀的重溶上清液及組三不溶部分用裂解液裂解后分別用10%分離膠進行SDS-PAGE電泳，上樣量為各組分全部樣品，采用考馬斯亮藍G-250染色。

1.2.4膠內(nèi)酶解將SDS-PAGE膠b、c所有條帶進行膠內(nèi)酶解（有明顯條帶者按條帶切取樣品、肉眼觀察無明顯條帶者盲切樣品），分別經(jīng)脫色、還原、烷基化、胰酶消化等步驟獲得蛋白的肽混合物，冷凍真空抽干備用。

1.2.5質(zhì)譜分析樣品用10 μL 0.1%甲酸溶解后用HPLC-Chip-MS/MS進行鑒定。儀器參數(shù)：Chip含Zarbox 300SB-C18（30 mm×300 μm，5 μm）富集柱和Zarbox300SBC18（45 mm×75 μm，3.5 μm）分離柱；液相系統(tǒng)的流動相：流動相A為0.1%甲酸水溶液、流動相B為90%乙腈/ 10%/0.1%甲酸水溶液；洗脫梯度：5 min時流動相B由5%升至10%、35 min時流動向B由10%升至40%、40 min時流動相B由40%升至100%、45 min時流動相B回到5%。質(zhì)譜參數(shù)：毛細管電壓1 850 V、干燥氣溫度325℃、流速4 L/min、質(zhì)量掃描范圍400～1 600 m/z。分離器電壓設(shè)置為40 V，Cap Exit為250 V，Oct1 DC為12 V，Oct2 DC為4.62 V，Trap Drive為85，Oct RF為216 Vpp，Lens1設(shè)置為-5 V，Lens 2設(shè)置為-60 V。

1.3數(shù)據(jù)處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)應(yīng)用Spectrum Mill MS Proteomics Workbench（Rev A.03.02.060，Agilent）軟件進行檢索，數(shù)據(jù)庫為IPI-human。參數(shù)設(shè)置：允許2個不完全裂解位點，且包括在搜索中氧化甲硫氨酸和N-末端谷胺酰胺轉(zhuǎn)化成5-氧-2-吡咯烷羧酸的變量修正。如前向-逆轉(zhuǎn)得分大于2分，列1～2得分大于2分，得分閾值大于7.67，得分百分比峰強度大于70%，認為肽段是有效的。只有當?shù)鞍踪|(zhì)具有2個或2個以上有效肽段、總得分大于25分時認為是有效的，可以報告。

2　結(jié)果

2.1SDS-PAGE分析組一、二沉淀尿蛋白的效率和條帶分布比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但沉淀后的尿蛋白男性略微高于女性，且獲得的沉淀均可完全重溶。獲得的蛋白量明顯低于組三，但條帶分布較組三清晰，見圖1。

圖1　不同有機沉淀法提取尿蛋白的SDS-PAGE圖譜

2.2質(zhì)譜鑒定結(jié)果質(zhì)譜鑒定所有條帶后經(jīng)軟件分析搜索鑒定到的蛋白質(zhì)共69種，其中蛋白質(zhì)上清液中53種，蛋白質(zhì)不溶沉淀物中49種。質(zhì)譜篩選出的沉淀不溶部分中特有的蛋白包括免疫球蛋白κ輕鏈基因1～5、谷氨酰氨肽酶、突變體1、芳基硫酸酯酶A前體等14種，見表1。沉淀不溶部分和上清液中均鑒定出He等［8］前期實驗篩選出的18種腫瘤相關(guān)蛋白中的9種，見表2。部分蛋白質(zhì)的特征質(zhì)譜圖見圖2。

表1　沉淀不溶部分中14種特有蛋白

表2　沉淀不溶部分和可溶部分鑒定出與前期研究相關(guān)的蛋白

圖2　部分蛋白質(zhì)的特征質(zhì)譜圖

3　討論

隨著蛋白質(zhì)組學的發(fā)展，人們對尿液蛋白質(zhì)組學的研究也越來越深入。多種蛋白質(zhì)組學技術(shù)被應(yīng)用于尿液的研究，如雙向電泳技術(shù)、熒光差異雙向電泳技術(shù)、HPLC-質(zhì)譜法、蛋白質(zhì)芯片-質(zhì)譜、毛細管電泳-質(zhì)譜等［9-11］。在尿液中尋找具有診斷價值的生物標志物或建立尿液的蛋白質(zhì)圖譜已得到多方面的探索。目前，尿液蛋白質(zhì)組學在疾病領(lǐng)域研究最多的是針對各種泌尿系統(tǒng)疾病發(fā)生、發(fā)展機制方面的研究，如腎小球疾病、腎移植、腎臟腫瘤、膀胱癌、狼瘡性腎炎、糖尿病腎炎、急性腎損傷、尿毒癥等。然而尿液蛋白質(zhì)組學發(fā)展的瓶頸技術(shù)仍是尿蛋白富集技術(shù)，大量的方法研究尚未得到合理的統(tǒng)一，標準的尿液標本收集、儲存、富集等技術(shù)尚需進一步的完善和推廣［12-13］。He等［8］經(jīng)多次嘗試超濾離心法富集尿蛋白相對穩(wěn)定，未觀察到不溶性蛋白，但該法成本較高，且有部分蛋白吸附在膜上和其他部件上而丟失，因此，選擇合適的富集尿蛋白方法對全面了解尿蛋白至關(guān)重要。對有機溶劑沉淀的尿蛋白不溶物一般不進行后續(xù)研究，源于不溶部分影響定量的準確性，且大多認為無法進行電泳分析。本研究沉淀的可溶部分和不可溶部分均鑒定出大部分前期研究篩選出的腫瘤標志物，如免疫球蛋白κ輕鏈基因1～5與人類免疫反應(yīng)密切相關(guān)；谷氨酰氨肽酶為肝臟富含的一種蛋白酶，與肝病的發(fā)生、發(fā)展具有直接聯(lián)系；突變體1是近年來在干細胞研究領(lǐng)域倍受關(guān)注的細胞膜糖蛋白，屬5TM受體家族，在多種組織中的表達已使其成為部分腫瘤干細胞標志物之一。但本研究由于使用樣品量少、方法單一和所用的質(zhì)譜儀檢測靈敏度較低，尿蛋白檢出量有限，但沉淀中的不溶部分在尿液研究中的作用已不容小覷，尤其是針對疾病生物標志物的研究。尿液蛋白質(zhì)組學的相關(guān)研究大多是針對可重溶的部分蛋白質(zhì)，而本研究表明，不能重溶的沉淀部分含有大量重要的蛋白質(zhì)信息，仍具有較大的研究價值。因此，如何發(fā)展更優(yōu)化的尿蛋白提取方法，盡可能減少不能復溶的蛋白量是下一步研究的方向。

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Electrophoretic analysis and mass spectrometric identification of urinary proteins

Wang Ying，Huang Yong，Zhang Xiaorong，Luo Gaoxing，He Weifeng，Wu Jun△
（Institute of Burn Research/State Key Laboratory of Trauma，Burn and Combined Injury/ ChongqingKeyLaboratoryforDiseaseProteomics，SouthwestHospital，ThirdMilitaryMedicalUniversity，Chongqing400038，China）

ObjectiveTo explore the best urine protein precipitation method，and to identify the routine loss protein. MethodsThe organic solvent precipitation method，i.e.，TCA/90%acetone，TCA/100%acetone and 90%acetone，was used to precipitate urinary proteins，and the obtained soluble and insoluble proteins by the 90%acetone method were separated and identified by SDS-PAGE and mass spectrum.ResultsThe urinary proteins amounts obtained by 90%acetone precipitation were relatively higher.The soluble and insoluble parts obtained by 90%acetone precipitation were identified by mass spectrometry.Fiftythree proteins were obtained from the soluble part and 49 proteins from insoluble part，moreover the specific proteins in insoluble part included immunoglobulin kappa light chain1-5（IGKV1-5），glutamyl aminopeptidase（ENPEP），PROM1，arylsulfatase A（ARSA）precursor，etc.ConclusionThe discovery of these proteins in insoluble parts of urine precipitation may contribute to the whole spectrum study of urinary proteome，and has an important clinical significance to the specific protein detection.

Proteinuria/diagnosis；Precipitation；Electrophoresis，polyacrylamidegel；Proteomics；Mass spectrometry

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.12.009

A

1009-5519（2016）12-1803-03

王穎（1986-），碩士研究生，主要從事疾病蛋白組學的研究

△，E-mail：junwupro@126.com。

（2016-03-03）