趙 青 張 強 周 鵬 林 峰 方炎明*

(1.南京林業(yè)大學南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，生物與環(huán)境學院，南京 210037； 2.江蘇省林業(yè)科學研究院，南京 211153； 3.南京林業(yè)大學現(xiàn)代分析測試中心，南京 210037)

5種木蘭科植物的DNA-C值及倍性分析

趙 青1張 強1周 鵬2林 峰3方炎明1*

(1.南京林業(yè)大學南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，生物與環(huán)境學院，南京 210037；2.江蘇省林業(yè)科學研究院，南京 211153；3.南京林業(yè)大學現(xiàn)代分析測試中心，南京 210037)

以紫玉蘭為內(nèi)標或外標，利用流式細胞術(shù)測定了雜交馬褂木(Liriodendronchinense×tulipifera)、深山含笑(Micheliamaudiae)、長蕊含笑(Michelialongistamina)、廣玉蘭(Magnoliagrandiflora)和二喬玉蘭(Magnoliasoulangeana)5種木蘭科植物的DNA-C值及倍性。結(jié)果表明，兩種含笑屬植物及雜交馬褂木均為二倍體，廣玉蘭為六倍體，二喬玉蘭為四倍體，5種植物的C值各不相同，最大的是廣玉蘭，最小的是雜交馬褂木，它們的C值大小屬于小到中等水平。

流式細胞術(shù)；DNA-C值；倍性；木蘭科

木蘭科(Magnoliaceae)大多是第三紀古熱帶植物區(qū)系的古老孑遺植物，被認為是現(xiàn)存被子植物中較原始的類群，對研究被子植物的起源和系統(tǒng)發(fā)育具有重要意義[1]。狹義的木蘭科分為15屬250種，分布于亞洲的熱帶和亞熱帶地區(qū)，少數(shù)在北美南部和中美洲，我國現(xiàn)存12屬136種，集中分布在西南部、南部及中南半島[2]。木蘭科植物樹姿優(yōu)美多態(tài)、花大而美麗、花色清新高潔、芳香濃郁宜人，葉、果皆具有獨特的觀賞價值。由于人為影響和自身繁殖能力的限制，木蘭科植物不少種已處于瀕危或極危狀態(tài)，現(xiàn)有39種被列為國家重點保護樹種[3]。研究木蘭科植物的C值及其倍性，可以為木蘭科植物的雜交育種、種質(zhì)資源保護、園林造景及合理的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

核DNA-C值(基因組大小)的概念最早由Swift提出，指未復制的單倍體基因組的DNA含量[4]。對此定義的不同理解導致了之后應用上的混淆，比如在計算芭蕉屬三倍體植物的C值時，Lysák等[5]用測得的2C值除以3得到1C值，并特指一個核基因組拷貝的DNA含量；而Arumuganathan等[6]用2C值除以2計算1C值，特指未復制的單倍體基因組的DNA總量。Greilhuber等[7]更正、統(tǒng)一了C值這一術(shù)語，將其定義為全倍體基因組(Holoploid Genome，染色體數(shù)n)的DNA含量。為避免混淆且加以區(qū)分，又引入Cx值的概念，特指單倍體基因組(Monoploid Genome，染色體數(shù)x)的DNA含量。因此二倍體(2n=2x)的C值與Cx值相等，四倍體(2n=4x)的C值為Cx值的二倍，以此類推。

C值是植物的一項重要特征參數(shù)，與植物的種群進化、物種分類與分布、遺傳信息總量等有密切關(guān)系[8]。C值在不同分類學水平上的變異對研究物種的親緣關(guān)系以及系統(tǒng)發(fā)育具有重要意義，同時結(jié)合倍性水平分析也可用來鑒定雜交物種[9～11]。每年對已經(jīng)測定出的C值進行統(tǒng)計并收錄到數(shù)據(jù)庫中是一項很有價值的工作。從2001年9月第一個被子植物DNA C-值數(shù)據(jù)庫出版以來，新測定出核DNA C-值的種數(shù)以每年高達10倍的速度不斷增加，至今該版本已更新至8.0(http://data.kew.org/cvalues/)。DNA C-值數(shù)據(jù)庫目前包含8 510種植物的數(shù)據(jù)。它結(jié)合了被子植物DNA C-值數(shù)據(jù)庫(8.0，2012年12月)、裸子植物DNA C-值數(shù)據(jù)庫(5.0，2012年12月)，蕨類植物DNA C-值數(shù)據(jù)庫(5.0，2012年12月)，苔蘚植物DNA C-值數(shù)據(jù)庫(3.0，2010年12月)，以及藻類DNA C-值數(shù)據(jù)庫(1.0，2004)中所有的C值數(shù)據(jù)，方便科研工作者查詢與分析。

測定C值的方法主要有Feulgen顯微密度法，流式細胞術(shù)(FCM)，化學提取法、復性動力學法、脈沖場凝膠電泳以及全基因組測序等8種[12～13]。流式細胞術(shù)以其操作簡單、結(jié)果可信等優(yōu)點被越來越多的學者應用到植物C值測定中[14]。由于G0/G1期的DNA含量(2C值)可反映該細胞的倍性水平，因此利用流式細胞術(shù)測得植物C值的同時可以獲得其倍性結(jié)果。在被子植物C值數(shù)據(jù)庫中，僅收錄了5種木蘭科植物的C值，包括北美鵝掌楸(Liriodendrontulipifera)，日本玉蘭(Magnoliakobus)，廣玉蘭(M.grandiflora)，紫玉蘭(M.liliiflora)和二喬玉蘭(M.soulangiana)。其中廣玉蘭和紫玉蘭的C值通過流式細胞術(shù)測定，其他3種植物的C值由顯微密度法測定。目前對木蘭科植物倍性分析主要依靠染色體計數(shù)法。王亞玲等[15]對木蘭科13個分類群和12個雜交組合的染色體數(shù)目進行了研究，其中落葉木蓮(Manglietiadecidua)、香港木蘭(Magnoliachampionii)、馨香玉蘭(M.odoratissima)、香玉蘭(M.guangnanensis)等12個種的染色體數(shù)目為首次報道。龔洵等[16]研究了木蘭屬和含笑屬間兩個雜交組合后代的染色體，發(fā)現(xiàn)四倍體紫玉蘭(M.liliiflora)和二倍體云南含笑(Micheliayunnanensis)的雜交后代染色體數(shù)目為2n=3x=57，從而支持含笑屬與木蘭屬玉蘭亞屬具有較近親緣關(guān)系的觀點。孟愛平等[17]對中國木蘭科11屬40種進行了核型研究，所研究的20種木蓮屬(Manglietia)植物均為二倍體，已觀察的含笑屬均為二倍體?，F(xiàn)在木蘭科植物染色體計數(shù)約達13屬106種[15]。進行木蘭科植物的C值和倍性鑒定對木蘭科的系統(tǒng)分類學、系統(tǒng)發(fā)育學、生態(tài)與環(huán)境、基因組學、物種保護、細胞分子生物學以及生理學等各學科領域都具有十分重要的指導意義。本研究以紫玉蘭為內(nèi)標或外標，利用流式細胞術(shù)測定了雜交馬褂木(Liriodendronchinense×tulipifera)、深山含笑(Micheliamaudiae)、長蕊含笑(M.longistamina)、廣玉蘭(Magnoliagrandiflora)以及二喬玉蘭(M.soulangeana)5種木蘭科植物的C值及倍性。

1 材料與方法

1.1 材料

以四倍體紫玉蘭為標樣，以雜交馬褂木、深山含笑、長蕊含笑、廣玉蘭以及二喬玉蘭為研究對象，采用芽內(nèi)未展開的幼葉為供試材料，采樣后立即進行流式細胞術(shù)分析。樣品均采自南京林業(yè)大學校園內(nèi)。

1.2 方法

1.2.1 細胞核懸液制備

待測樣品和標樣的芽內(nèi)幼葉各取0.05 g放入預冷的培養(yǎng)皿里，加入預冷的LB01解離液[18](15 mmol·L-1Tris，2 mmol·L-1EDTA-Na2，0.5 mmol·L-1四鹽酸精胺，80 mmol·L-1KCl，20 mmol·L-1NaCl，15 mmol·L-1β-巰基乙醇，0.1%(v/v)TritonX-100，pH 7.5)1 mL，用鋒利刀片將組織切碎，用40 μm的濾網(wǎng)過濾，即得細胞核懸液。整個過程在冰上完成。

另取5個待測樣品和一個標樣的芽內(nèi)幼葉各0.05 g，以同樣的方法制備細胞核懸液作為空白對照；以紫玉蘭作內(nèi)標時，分別取5個待測樣品各0.05 g以上述方法制備細胞核懸液后與紫玉蘭細胞核懸液混合進行流式細胞術(shù)分析。

1.2.2 DNA染色

將得到的細胞核懸液于4℃，1 000 r·min-1，離心5 min，棄上清液。在沉淀中加入500 μL預冷的PI-RNase染液[19]，置于4℃冰箱避光染色15～30 min；空白對照組在沉淀中加入500 μL預冷的RNA酶液，置于4℃冰箱避光放置15～30 min。

1.2.3 流式細胞儀檢測

利用BD InfluxTM流式細胞儀對經(jīng)染色后的細胞核懸液樣品上機檢測，采用488 nm藍光激發(fā)，收集5 000～10 000個顆粒。使用BD FACSTMSortware 1.0.0.650分析軟件作圖分析。待測樣品的DNA-C值和倍性按照以下公式[20]計算：

2 結(jié)果與分析

2.1 目標樣品峰的確定

將空白對照組與樣品組在相同儀器狀態(tài)下上機檢測，以排除細胞自發(fā)熒光的干擾。如圖1所示，左圖為紫玉蘭空白對照，右圖為染色后的紫玉蘭。由圖可見，對照只有碎片峰而沒有目標樣品峰，染色后的紫玉蘭出現(xiàn)清晰的G0/G1期峰圖，而且S期及G2/M期細胞分布狀態(tài)均可以觀察到。流式分析的準確性一般以變異系數(shù)(CV)來表示，CV值越小，峰圖結(jié)果分析就越準確。一般來說CV值小于5%，實驗結(jié)果才可信，但由于植物組織的樣品制備難度較大，CV值可控制在8%以內(nèi)[21]。待測樣品的目標峰圖確定方法同上。

2.2 5種木蘭科植物的C值及倍性

圖2為5種木蘭科植物的流式細胞術(shù)測定結(jié)果，分別比較各樣品與紫玉蘭的G0/G1期峰值相對位置，可以得出它們的2C值與倍性結(jié)果，進而可以計算得到1C值與1Cx值。從被子植物C值數(shù)據(jù)庫中查得紫玉蘭的C值為4.95 pg，據(jù)此可計算得出5種木蘭科植物的C值及倍性結(jié)果(表1)。5種植物的DNA-C值各不相同，最大的是廣玉蘭，最小的是雜交馬褂木。根據(jù)植物C值大小的5個等級：很小(≤1.4 pg)、小(≤3.5 pg)、中等(>3.5，<14.0 pg)、大(≥14.0 pg)、很大(≥35.0 pg)[22]，該5種木蘭科植物C值大小屬于小到中等水平。由全倍體基因組大小2C值除以倍性可以得到基礎基因組大小1Cx值，其范圍是1.97～2.72 pg，除了深山含笑的1Cx值大小與紫玉蘭相同之外，其他種的1Cx值皆有差異，表明其基礎基因組大小存在一定程度的變異。

圖1 紫玉蘭的流式直方圖Fig.1 The FCM histogram of M.liliiflora

種名SpeciesDNA?C值DNA?Cvalue(pg)DNA?2C值DNA?2Cvalue(pg)倍性PloidylevelCx值Cxvalue(pg)已報道C值Cvalueinpreviouswork(pg)紫玉蘭Magnolialiliiflora?4．959．902n=4x2．484．56[23]，5．09[24]雜交馬褂木Liriodendronchinense×tulipifera1．973．942n=2x1．97N深山含笑Micheliamaudiae2．484．962n=2x2．482．28[23]，1．76[24]長蕊含笑Michelialongistamina2．725．432n=2x2．72N廣玉蘭Magnoliagrandiflora6．9213．832n=6x2．315．61[23]，6．81[24]，4．53?二喬玉蘭Magnoliasoulangeana4．599．182n=4x2．305．50[24]，5．98?

注：*C值數(shù)據(jù)庫(http://data.kew.org/cvalues)；N.尚未報道

Note:*the database of C-value(http://data.kew.org/cvalues)；N.Has not been reported

圖2 以紫玉蘭為對照5種木蘭科植物的流式直方圖Fig.2 Controlled by M.liliiflora,the FCM histogram of five species in Magnoliaceae

3 討論

對于同一種植物而言，由于采用不同的標樣、解離液、材料類型、染色方法、流式細胞儀和畫圖軟件，C值測定值都會有所不同[25]。本研究采用的標樣與待測樣品同屬一科，細胞核含量相近，滿足內(nèi)標法參照樣本的選擇條件[19]。以紫玉蘭為內(nèi)標，雜交馬褂木與深山含笑的流式峰圖如圖1中A與B所示，目標樣本峰同參照樣本峰均不重疊，且CV值均小于6%，結(jié)果比較可靠。本研究也對長蕊含笑、廣玉蘭及二喬玉蘭3種植物嘗試過紫玉蘭內(nèi)標法，發(fā)現(xiàn)目標樣本峰均與參照樣本峰部分重疊，故改用外標法來測定其C值與倍性。外標法在進行常規(guī)的倍性分析與細胞核DNA含量測定時沒有內(nèi)標法精確，因此通過預實驗提高外標法的實驗精確度尤為重要。選擇合適的解離液、材料類型、保存方法及材料用量等可以有效提高實驗精確度。通過預實驗得出：解離液采用LB01，實驗材料選擇未展開的芽內(nèi)幼葉，采樣后立即進行實驗且材料用量0.05 g可以有效減少實驗誤差。為進一步提高實驗精度，所有樣本均采用相同染色液(PI)，并加入RNA酶，以排除RNA的干擾。染色溫度控制在4℃左右，從而增強熒光染料結(jié)合的穩(wěn)定性，減少熒光損耗。此外，每個樣品采集5 000～10 000個細胞，變異系數(shù)最大不能超過8%，盡量控制在5%左右，以保證實驗結(jié)果的可靠性。國內(nèi)外對木蘭科植物的細胞學研究主要集中在核型分析上，其倍性水平大多已知，而關(guān)于DNA-C值的報道相對較少。木蘭科核型研究表明[26]，除木蘭屬有二倍體、三倍體、四倍體、五倍體和六倍體外，其他屬都為二倍體。本研究所得兩種含笑屬植物以及雜交馬褂木的流式結(jié)果均為二倍體，木蘭屬植物二喬玉蘭和廣玉蘭分別為四倍體和六倍體，與報道相符。據(jù)文獻報道，深山含笑的C值為2.28 pg[23]或1.76 pg[24]，本研究測得的結(jié)果為2.48 pg；廣玉蘭C值測定結(jié)果為6.92 pg，文獻報道其值為5.61 pg[23]或6.81 pg[24]，均比被子植物C值數(shù)據(jù)庫中收錄的廣玉蘭C值4.53 pg大；數(shù)據(jù)庫中收錄的二喬玉蘭C值為5.98 pg，另有文獻報道其值為5.50 pg[24]，而本研究測得的二喬玉蘭C值偏小，為4.59 pg。究其原因，可能是由于不同的操作方法導致了測定結(jié)果的差異。除此之外，二喬玉蘭為雜交種，在園林上栽培品種繁多，不同品種的C值可能存在一定的差異[27]。而且不同植物材料由于生境的不同C值也可能會發(fā)生變異，如Price等[28]測定了向日葵(Helianthusannuus)在不同光照條件下植株不同器官的核DNA-C值，發(fā)現(xiàn)在裸露的有直射光照的樣地上，向日葵葉片DNA C-值為6.56±0.06 pg，半蔭條件(從附近區(qū)域接收直射光和散射光)下向日葵葉片核DNA含量為6.21±0.07 pg。

Leitch等[29]由整個陸生植物基因組大小比較研究得出植物基因組大小進化趨勢是朝著增大的方向進行。從木蘭科內(nèi)各屬種的系統(tǒng)進化角度分析，是否也符合這種趨勢呢？木蓮屬是木蘭科最原始的類群，Parris等[23]測定的10種木蓮屬植物平均C值為2.44 pg；鵝掌楸屬是木蘭科最進化的類群，該屬3個種的平均C值為1.80 pg。木蘭屬的界限歷來是木蘭科分類中爭議的焦點，分子研究表明玉蘭亞屬與含笑屬親緣關(guān)系較其與木蘭亞屬更近[30]。木蘭亞屬(Subgen.Magnolia，)為較原始的類群，16種該亞屬植物的平均C值為2.68 pg[23]；而玉蘭亞屬(Subgen.Yulania)為較進化的類群，14種玉蘭亞屬植物的平均C值為4.07 pg[23]。含笑屬為較進化類群，19種含笑屬植物的C值平均數(shù)為2.31 pg[23]。2種擬單性木蘭屬植物的平均C值為6.02 pg[24]，該屬是木蘭科中兩性花向單性花過渡的中間類群[31]。根據(jù)葉江林等[24]的研究，古老種蓋裂木(Talaumahodgsoni)的C值為2.95 pg，進化種合果木(Paramicheliabaillonii)與觀光木(Tsoongiodendronodorum)的C值分別為2.67與2.09 pg。由此可見，在木蘭科中，基因組大小的進化趨勢總體上是從大到小，但這種趨勢是否正確需要更多數(shù)據(jù)來進一步探索。

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introduction：ZHAO Qing(1991—),female,graduate,major in plant physiology and biochemistry.

date:2016-09-06

AnalysisofDNAC-valueandPloidyofFiveSpeciesinMagnoliaceae

ZHAO Qing1ZHANG Qiang1ZHOU Peng2LIN Feng3FANG Yan-Ming1*

(1.College of Biology and the Environment,Nanjing Forestry University,Nanjing 210037；2.Jiangsu Academy of Forestry,Nanjing 211153；3.Advanced Analysis and Testing Center,Nanjing Forestry University,Nanjing 210037)

In this study, the C-value and ploidy of five species in Magnoliaceae was estimated by flow cytometry usingMagnolialiliifloraas the reference. The results showed that the two species ofMicheliaare diploid,Magnoliagrandiflorais hexaploid, andM.soulangeanais tetraploid. The C-Values of five species are different from each other. The C-value ofM.grandiflorais the largest among the five species investigated, while the C-value ofLiriodendronchinense×tulipiferais the smallest. The sizes of C-values of the five species are small to medium level.

flow cytometry;C-value;ploidy;Magnoliaceae

趙青(1991—)，女，碩士研究生，主要從事植物生理生化方面的研究。

* 通信作者：E-mail：jwu4@njfu.edu.cn

2016-09-06

* Corresponding author：E-mail：jwu4@njfu.edu.cn

Q949.747.1

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.06.008