陜西省人民醫(yī)院(西安710068)

李連香 于翠革 陳麗宏 楊曉梅

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miR-99b在新輔助化療宮頸癌組織中的表達(dá)*

陜西省人民醫(yī)院(西安710068)

李連香 于翠革 陳麗宏 楊曉梅

目的：研究miRNA-99b(miR-99b)在新輔助化療宮頸癌組織中的表達(dá)。方法：宮頸癌患者55例分別于新輔助化療前后收集腫瘤組織標(biāo)本行micRNA的提取、反轉(zhuǎn)錄、實(shí)時(shí)定量PCR檢測miR-99b的表達(dá)。結(jié)果：宮頸癌新輔助化療后miRNA99b表達(dá)顯著上升,與治療前表達(dá)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。結(jié)論：新輔助化療可通過上調(diào)miRNA-99b表達(dá),實(shí)現(xiàn)對(duì)宮頸癌的抑制。

宮頸癌傳統(tǒng)的治療方法是手術(shù)和放療,近年來宮頸癌的化療逐漸成為關(guān)注和研究的熱點(diǎn)。吳維光等[1]為探討miRNA-99b(miR-99b)調(diào)控宮頸癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的可能機(jī)制,應(yīng)用Western blot 檢測了miR-99b 靶基因CDC-25A 蛋白表達(dá),發(fā)現(xiàn)miR-99b 上調(diào)表達(dá)后,細(xì)胞CDC-25A 表達(dá)降低。表明miR-99b 可通過調(diào)控靶基因CDC-25A 表達(dá),調(diào)控宮頸癌細(xì)胞的增殖和凋亡。據(jù)此分析,miR-99b 在宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展過程中可能起重要作用,上調(diào)miR-99b 表達(dá)可抑制宮頸癌細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。miR-99b 有可能成為宮頸癌治療的靶基因。本研究在前期觀察了新輔助化療對(duì)巨快性宮頸癌的臨床治療效果的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步研究miR-99b在新輔助化療宮頸癌前后組織中的表達(dá)。

資料與方法

1 一般資料 收集2014年1月至2015年6月我科就診的宮頸癌患者55例,年齡35～68歲,平均54歲。Ib2期25例,IIa期 18例,IIb～I(xiàn)Va期 12例。鱗癌39例,腺癌14例,鱗腺癌2例。高分化29例,中分化15例,低分化11例。55例患者分別于新輔助化療前后收集腫瘤組織標(biāo)本。

2 實(shí)驗(yàn)方法 ①組織中micRNA的提取：使用RNAiso for Small RNA(TAKARA D340A)試劑盒進(jìn)行組織中RNA的提取。②反轉(zhuǎn)錄：使用One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis (TAKARA D350A)一步法miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行miRNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),取1000 ng RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。③實(shí)時(shí)定量PCR：使用SYBR Premix Ex TaqTMII (TAKARA DRR081)實(shí)時(shí)定量試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測。將反轉(zhuǎn)錄得到的20μl cDNA添加RNase Free dH2O補(bǔ)足至100μl。取2μl稀釋液加入到Real Time PCR反應(yīng)體系中,進(jìn)行定量檢測。③數(shù)據(jù)分析：使用ABI 7300分析軟件,用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法分析宮頸癌組織新輔助化療前后miRNA表達(dá)水平變化,從has-miR-99b中挑選出表達(dá)水平變化趨勢與芯片分析結(jié)果一致的miRNA,以Human_RNU1A作為內(nèi)參。

結(jié) 果

1 組織中miRNA的提取 使用RNAiso for Small RNA小RNA提取試劑盒,從組織中提取small RNA，RNA比值在1.8～2.0,說明組織中的RNA質(zhì)量完好,電泳圖顯示小RNA結(jié)果,如圖1。

M：50bp DNA Ladder Marker；1, 2：small RNA

2 RT-PCR 電泳結(jié)果 以small RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板,以miRNA上下游引物擴(kuò)增目的片段,取8 μl qPCR產(chǎn)物進(jìn)行3 % 瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果顯示擴(kuò)增出來的miRNA即為目的片段,片段大小為90bp，結(jié)果如圖2。

7,8：has- miR-99b Mix 擴(kuò)增產(chǎn)物/平行樣；1,2：陰性對(duì)照 dH2O

3 實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證結(jié)果 使用相對(duì)定量法檢測新輔助化療前后miRNA-99b，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法校正批次之間的差異。通過定量擴(kuò)增計(jì)算出miRNA-99b的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：內(nèi)參Human_RNU1A為：y=-3.62x+22.44；has-miR-99b為：y =-3.1x+31.13；其擴(kuò)增效率為:1.04在0.8與1.2之間(見圖3～5)。新輔助化療治療前后miR99b表達(dá)水平改變倍數(shù)發(fā)生了明顯的變化,新輔助化療后miRNA99b表達(dá)較治療前表達(dá)明顯增高(P<0.05)。

討 論

目前,已發(fā)現(xiàn)多種microRNA(miRNA)與腫瘤發(fā)生相關(guān),但與宮頸癌新輔助化療治療機(jī)制相關(guān)的miRNA仍在探索之中。有研究發(fā)現(xiàn),miRNA-99b(miR-99b) 在人乳頭瘤狀病毒(HPV) 陽性的宮頸腺癌組織中低表達(dá)[2-3]。但這并不表明表達(dá)量有變化的miRNA分子都參與了腫瘤的形成。很多miRNA可能只是間接地受到癌變過程中基因組或生理變化的影響，而不是根本起因。目前癌癥研究的主要目標(biāo)之一是發(fā)掘真正與癌癥形成相關(guān)的miRNA[4]。

現(xiàn)有的研究表明,在宮頸癌中,miRNAs表達(dá)分上調(diào)和下調(diào)兩種。其中上調(diào)表達(dá)的miRNAs有miRNA-210，182,183,200c,203,193b,34a,31,210,27a,503,27b,199a,199b,145,133a,133b,214和127等。而下調(diào)表達(dá)的miRNAs包括：miRNA-126,145,451,195,143,199b,1,495,497,133b,223,146a,126-AS,150,376a,214,487b,10b,218,149和203等[5-6]。本研究通過前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)新輔助化療能明顯降低巨塊型宮頸癌的直徑,增加手術(shù)機(jī)會(huì),提高手術(shù)幾率,為根治手術(shù)創(chuàng)造條件。通過實(shí)時(shí)定量PCR發(fā)現(xiàn)與宮頸癌新輔助化療確切相關(guān)的miRNA為miRNA-99b。治療后兩者皆顯著上升(P<0.05)。

miRNA-99b與宮頸癌的關(guān)系目前國外尚未見報(bào)道,國內(nèi)報(bào)道較少。吳維光等[1]通過基因芯片發(fā)現(xiàn)miRNA-99b與HPV感染的宮頸癌相關(guān)。HPV感染的宮頸癌細(xì)胞miRNA-99b呈低表達(dá)。我們的研究也發(fā)現(xiàn),經(jīng)過新輔助化療,宮頸癌組織中miRNA-99b呈上調(diào)趨勢,較治療前增加近6倍,且前期臨床觀察發(fā)現(xiàn)宮頸癌新輔助化療后癌灶明顯減小,證明了新輔助化療可能通過上調(diào)miRNA-99b表達(dá),促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡,從而達(dá)到抑制腫瘤的治療效果。從此研究結(jié)果也證明了新輔助化療將miRNA-99b作為宮頸癌治療靶點(diǎn)的可能性。

綜上所述,新輔助化療可通過上調(diào)miRNA-99b表達(dá),實(shí)現(xiàn)對(duì)宮頸癌的抑制。然而miRNA-99b的靶蛋白及其涉及的相關(guān)通路尚待進(jìn)一步研究。

[1] 吳維光,孫小麗,陳 勃,等.microRNA-99b 表達(dá)調(diào)控對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖和凋亡的作用[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展,2008,17(10)：752-755.

[2] Zhou WY,Chen JC,Jiao TT,etal.MicroRNA-181 targets YinYang 1 expression and inhibits cervical cancer progression[J].Mol Med Rep,2015,11( 6) : 4541-4546．

[3] Wang L,Chang L,Li Z,etal.miR-99a and -99b inhibit cervicalcancer cell proliferation and invasion by targeting mTOR signalingpathway[J].Med Oncol,2014,31(5)：934．

[4] Yanihara N,Caplen N,Bowman E,etal. Unique microRNA molecμLar profiles in lung cancer diagnosis and prognosis[J]. Cancer Cell,2011,9(3)：189-198.

[5] Reshmi G,Radhakrishna PM.Beyond HPV:Oncomirs as new players in cervical cancer[J]. FEBS Letters,2008,582(30)：4113-4116.

[6] 任 俊. MicroRNA在腫瘤中的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2012,18(8)：1170-1173.

(收稿：2016-02-23)

Expression of the miR-99b before and after neo adjuvant chemotherapy of cervical cancer

Shaanxi Provincial People’s Hospital(Xi’an 710068)

Li Lianxiang Yu Cuige Chen Lihong et al

Objective：To study the expression of the miR-99b before and after neo adjuvant chemotherapy of cervical cancer.Methods: Through micRNA extraction,reverse transcription, timing quantitative PCR detection the expression of miR-99b in the tumor tissue respectively before and after neoadjuvant chemotherapy in the patients with cervical cancer.Results: After neoadjuvant chemotherapy the cervical cancer miR-99b expression was significantly higher(P<0.05).Conclusion: Neoadjuvant chemotherapy can inhibition of cervical cancer through raising the expression of the miR-99b.

Uterine cervical neoplasms Gene expression regulation,neoplastic @miRNA-99b

*陜西省社發(fā)攻關(guān)資助項(xiàng)目(2010K01-156)

子宮頸腫瘤 基因表達(dá)調(diào)控,腫瘤 @miRNA-99b

R737.33

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2016.10.007