王未琢　吳彬彬　鮑文燕　柯青青　俞瑩瑩　杜月光?

葛根芩連湯對糖尿病大鼠腎臟的保護作用及對ERK通路的影響

王未琢吳彬彬鮑文燕柯青青俞瑩瑩杜月光?

目的 觀察葛根芩連湯（GQD）對糖尿病大鼠腎臟的保護作用，從ERK/MAPK信號通路探討其機制。方法 以鏈脲佐菌素（STZ）復(fù)制雄性糖尿病大鼠模型。隨機分為6組：正常對照組、模型組、葛根芩連湯低、中、高劑量治療組、二甲雙胍治療組。藥物干預(yù)8周后，生化檢測空腹血糖（FBG）、血肌酐（SCr）、尿肌酐（UCr）、尿總蛋白（UTP），計算內(nèi)生肌酐清除率（CCr）；PAS染色，光鏡觀察腎臟組織形態(tài)學(xué)改變；Western-blot法測定腎臟p-ERK、ERK蛋白的表達。結(jié)果 與正常對照組比較，模型組大鼠FBG、UTP、UCr、CCr升高（P＜0.05），腎小球體積肥大，p-ERK/ERK相對蛋白量表達增加（P＜0.05）。與模型組比較，葛根芩連湯治療組的FBG、UTP、UCr降低（P＜0.05），腎小管上皮細胞空泡化程度較輕，p-ERK/ERK蛋白的相對表達量降低（P＜0.05）。結(jié)論 葛根芩連湯可能通過降低p-ERK的表達水平，改善健存腎單位的超濾作用，減輕DM大鼠的腎臟病理改變，延緩糖尿病腎?。―N）的進展。

糖尿病腎病 葛根芩連湯 p-ERK ERK MAPK

糖尿病腎?。―N）是糖尿病（DM）常見的慢性并發(fā)癥之一，屬于DM微血管病變，是DM致殘、致死的主要原因。據(jù)報道，我國DN發(fā)病率亦呈上升趨勢，目前已成為終末期腎病的主要原因。DN的腎臟早期病理改變主要以腎小球體積肥大，腎小管細胞空泡樣變性為特征。研究表明細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）信號通路的激活調(diào)節(jié)腎臟細胞增生分化是導(dǎo)致DN發(fā)病的重要機制之一［1-3］。近年來臨床觀察發(fā)現(xiàn)葛根芩連湯（GQD）能有效延緩DN的進展［4］。2015年7月至10月作者通過實驗研究，觀察葛根芩連湯對DM大鼠腎臟的影響，并其對ERK信號通路的調(diào)控作用。

1　材料和方法

1.1材料 （1）實驗動物：清潔級雄性SD大鼠36只，體重180～220g，購自上海西普爾-必凱動物有限公司，許可證號：SCXK（滬）2013-0016，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心。（2）試劑與儀器：鏈尿佐菌素（STZ）（美國Sigma公司）。葛根芩連湯：葛根、黃芩、黃連、炙甘草，均由浙江中醫(yī)藥大學(xué)名中醫(yī)館藥房統(tǒng)一提供。鹽酸二甲雙胍（上海信宜藥業(yè)公司）。一抗p-ERK 1/2；ERK 1/2；β-actin（C4）；二抗Goat anti-Mouse IgG（H+L）；Goat anti-Rabbit IgG（H+L）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強型）；碧云天；自動血糖儀（三諾公司）；Thermo Pierce；紫外分光光度計（美國Beckman）；低溫高速離心機（德國Eppendorf）；Mini-PROTEAN電泳系統(tǒng)及Mini Trans-Blot轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（美國Bio-Rad）；水平脫色搖床（國產(chǎn)華利達）。

1.2方法 （1）動物模型復(fù)制：在36只雄性SD大鼠中隨機選取30只，在室溫（22±3）℃的環(huán)境中飼養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進行模型復(fù)制。禁食24h后以2%STZ緩沖液配液50mg/（kg·d）行腹腔注射，第3天后斷尾取血以葡萄糖氧化酶法測定空腹血糖，將血糖值≥16.7mmol/L作為造模成功的標準。（2）藥品制備：葛根芩連湯由葛根、黃芩、黃連、炙甘草以8∶3∶3∶2配比組成［5］。每次煎煮7d的藥量：取葛根266g、黃芩98g、黃連98g、炙甘草70g，用3500ml蒸餾水浸泡30min后煎煮1h（從煮沸開始計時），取出濾液；在藥渣中加入2500ml蒸餾水煎煮1h，取濾液；將2次的濾液合并煎煮，濃縮至250ml，最終濃縮煎劑含生藥2.1g/ml。每次灌胃取中藥濃縮煎劑26.25ml，從中取出3.75ml、7.5ml分別稀釋至15ml作為低、中濃度藥液，其余15ml為高濃度藥液，濃度分別為0.525g/ml、1.05g/ ml，2.10g/ml。二甲雙胍組灌胃液：每次制備1周的藥量：取8片二甲雙胍（0.25g /片）共計2.0g，研磨至粉狀，溶解于105ml蒸餾水，配成約20mg/ml的二甲雙胍溶液，為臨床使用的等效劑量。（3）分組及給藥：將造模成功的30只大鼠隨機分為五組：糖尿病模型組、葛根芩連湯低劑量組、中劑量組、高劑量組、二甲雙胍組，每組6只。其余6只設(shè)正常對照組，自由飲水進食。正常對照組和模型組：每天給予蒸餾水2.5ml灌胃；葛根芩連湯低、中、高劑量組：分別以不同濃度的中藥灌胃2.5ml；二甲雙胍組：每只大鼠灌入二甲雙胍溶液2.5ml。上午9時灌胃1次/d，持續(xù)8周。實驗過程中，所有大鼠均自由飲水，以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)。（4）標本收集：末次給藥后，大鼠禁食不禁水12h后稱重并記錄；之后置大鼠于代謝籠，收集24h尿液，離心，取上清液，用于相應(yīng)指標檢測。之后按1.0mg/kg腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉，腹主動脈取血，離心，取血清做生化指標檢測。切取大鼠左側(cè)腎臟，置于10%中性甲醛固定用于病理形態(tài)學(xué)觀察。切取大鼠右側(cè)腎臟并剪碎，保存于液氮中用于ERK相關(guān)蛋白表達檢測。

1.3觀察及檢測指標 （1）生化指標測定：空腹血糖（FBG）檢測：用葡萄糖氧化酶法測定。肌酐（Cr）：苦味酸法測定；尿總蛋白（UTP）：半定量法測定。（2）腎臟形態(tài)學(xué)觀察：經(jīng)10%中性甲醛固定的腎組織常規(guī)脫水、石蠟包埋、制成4μm厚的切片，行PAS染色，鏡下觀察腎臟病理結(jié)構(gòu)改變。（3）腎組織p-ERK、ERK蛋白表達的測定：采用Western-blot技術(shù)。用總蛋白提取試劑盒提取樣品總蛋白，然后采用BCA定量試劑盒定量測定總蛋白。配制分離膠和濃縮膠，每個孔取60μg總蛋白進行上樣，每孔10～15μl，濃縮膠60V，分離膠80V電泳2h。PVDF膜甲醇中浸泡20s，之后轉(zhuǎn)移到Tris-Glycine緩沖液中平衡5min；SDS-PAGE凝膠在Tris-Glycine緩沖液平衡30min；轉(zhuǎn)膜2h。之后放到T-TBS，室溫封閉1h，然后T-TBS漂洗。一抗［p-ERK、ERK稀釋度1∶800；β-actin（C4）稀釋度1∶1500］溶于T-TBS，4℃孵育過夜；然后T-TBS漂洗。二抗（1∶5000）溶于T-TBS，室溫1h；然后T-TBS漂洗。制備約1mlECL工作液，室溫孵育轉(zhuǎn)印膜1min，然后去除多余ECL試劑，保鮮膜密封，然后進行顯影和定影。采用BandScan5.0軟件分析條帶的光密度值，每個條帶重復(fù)3次，目的蛋白相對表達量=［目的蛋白（光密度值）/內(nèi)參（光密度值）］×10n。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1葛根芩連湯對大鼠血糖、體重、腎重及腎指數(shù)的影響 見表1。

表1　葛根芩連湯對大鼠血糖、體重、腎重及腎指數(shù)的影響（x±s）

2.2葛根芩連湯對大鼠尿總蛋白、內(nèi)生肌酐清除率的影響 見表2。

表2　葛根芩連湯對大鼠尿總蛋白、內(nèi)生肌酐清除率的影響（x±s）

2.3葛根芩連湯對DM大鼠腎臟組織形態(tài)的影響 PAS染色可見：正常對照組腎小球，腎小管上皮細胞結(jié)構(gòu)正常，排列整齊。模型組腎小球體積增大，腎小管上皮細胞空泡變性明顯，伴炎癥細胞浸潤。各治療組病變改善，以中濃度葛根芩連湯組病變改善最明顯。見圖1。

圖1　葛根芩連湯對DM大鼠腎臟組織形態(tài)的影響

2.4葛根芩連湯對p-ERK/ERK的相對表達量的影響：Western-blot結(jié)果顯示，與正常對照組比較，模型組p-ERK表達量明顯增加（P＜0.05）。與模型組比較，各濃度中藥組的p-ERK表達量降低（P＜0.05）。與二甲雙胍組比較，兩者的p-ERK的表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2　葛根芩連湯對p-ERK/ERK的相對表達量的影響

3　討論

DN是DM常見的慢性微血管并發(fā)癥之一，DN早期的組織學(xué)病變是腎小球體積肥大及腎小管空泡化［6-7］。目前DN早期發(fā)病機制尚不明確。20世紀80年代初，Brenner等提出腎小球過度濾過學(xué)說：部分腎單位被破壞后，健存腎單位血流動力學(xué)發(fā)生改變，其血流量和血管內(nèi)流體靜壓的增高使GFR相應(yīng)增高，從而形成腎小球“高壓力、高灌注、高濾過”的三高狀態(tài)。學(xué)術(shù)界認為糖尿病狀態(tài)下持續(xù)高糖刺激使血液中糖基化終末產(chǎn)物、炎性介質(zhì)和細胞因子增加，促進腎小球系膜細胞增殖，細胞外基質(zhì)產(chǎn)生增加，部分腎小球受損，功能腎單位減少，健存腎單位代償性高濾過，引起血液流變學(xué)及血流動力學(xué)改變，從而促使DN發(fā)生發(fā)展［8］。ERK信號傳導(dǎo)通路是目前研究較透徹的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族通路［9］。在DN中，ERK通路的活化可分為蛋白激酶C系統(tǒng)（PKC）依賴性與非蛋白激酶C系統(tǒng)依賴性。其中，PKC依賴性活化途徑表現(xiàn)為PKC活化時一方面激活Ras/Raf/ERK通路，使ERK活化，另一方面抑制MAPK磷酸酶-1，使ERK處于持續(xù)活化狀態(tài)，從而使ERK1/2磷酸化并活化胞內(nèi)磷脂酶A，誘導(dǎo)前列腺素、血栓素和血小板活化因子等炎癥因子的產(chǎn)生，從而引起DM血流動力學(xué)改變［10］。ERK在腎臟細胞調(diào)節(jié)中的作用：（1）誘導(dǎo)腎小球細胞肥大。（2）促進細胞外基質(zhì)積聚。（3）與炎性介質(zhì)（前列腺素、血栓素、血小板活化因子）的產(chǎn)生有關(guān)。（4）參與小球基底膜增厚等。鑒于p-ERK/ERK在DN中的重要作用，提示抑制其過度表達可減輕腎臟細胞病變。

近年來有關(guān)中醫(yī)藥治療DN的研究越來越多，祖國醫(yī)學(xué)認為DM患者胃納過多，脾運不化而生濕，中滿內(nèi)熱、濕熱內(nèi)阻為其核心病機［11］。葛根芩連湯由葛根、黃芩、黃連、炙甘草組成，重用味甘辛涼、解表退熱，升發(fā)脾胃而治下利的君藥葛根，臣以清熱燥濕、且厚胃腸的黃芩黃連，使以炙甘草甘緩和中，四藥合用，解表清里，用于消渴日久的DM具有中醫(yī)理論基礎(chǔ)［12］。藥理研究表明葛根的生理活性物質(zhì)黃酮類和皂苷類化合物具有增強胰島素敏感性的作用［13］，可改善DM導(dǎo)致的基底膜增厚以及糖化血紅蛋白值的升高。臣藥黃芩的黃酮類成分黃芩苷、黃芩素等具有抗氧化、抗自由基、消炎的作用［14］，黃連通過抑制醛糖還原酶活性達到降血糖的作用［15］，以上結(jié)果表明葛根芩連湯應(yīng)用于DN的治療具中醫(yī)理論及臨床藥理基礎(chǔ)。

本資料結(jié)果顯示，與模型組比較，葛根芩連湯的各濃度的血糖降低，血肌酐降低，尿肌酐升高，內(nèi)生肌酐清除率降低，腎小球體積減小，p-ERK低表達；中、高濃度治療組的生化及檢測指標均優(yōu)于二甲雙胍組（P＜0.05），提示中藥可能是通過抑制ERK1/2磷酸化及激活，改善健存腎單位的超濾狀態(tài)，減輕高糖環(huán)境下腎小球體積病理性肥大、改善腎小管上皮細胞的空泡變性來發(fā)揮保護作用。

［1］ 劉沙，王建平.MAPK-ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在糖尿病腎病中的研究進展.世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘，2015，62（15）:30-31.

［2］ 張明霞，李龍，王曉宇.Raf激酶抑制蛋白和p-ERK在糖尿病腎病大鼠腎組織中的表達及意義.中國病理生理雜志，2013，29（02）:358-360.

［3］ 郝祥俊，王鵬，喬志燕，等.糖尿病腎病ERK信號通路激活機制的研究進展.承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2013，30，（02）:161-164.

［4］ 陳麗紅，唐于平，王強.葛根芩連湯的現(xiàn)代研究進展.中草藥，2010，41（4）.676-680.

［5］ 彭智平，劉文科，郭允，等.仝小林教授因病施量策略芻議.世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2012，07（05）:377-379.

［6］ 傅蘭君，余晨.糖尿病腎病病理結(jié)構(gòu)改變及與功能的聯(lián)系.腎臟病與透析腎移植雜志，2010，19（06）:559-562.

［7］ Napoli R， Gibson L， Hirshman M F， et al. Epinephrine and insulin stimulate different mitogen-activated protein kinase signaling pathways in rat skeletal muscle. Diabetes， 1998，47（10）:49-54.

［8］ 柴可夫，柴瑞，王亞麗.糖腎湯對糖尿病大鼠腎損傷的保護作用.浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志， 2005，15（9）:532-534.

［9］ Ehud Wainstein， Rony Seger. The dynamic subcellular localization of ERK: mechanisms of translocation and role in various or ganelles. Current Opinion in Cell Biology， 2016， 39 （09）: 15-20.

［10］ Kyriakis J M. Making the connection: coupling of stress-activated ERK/MAPK （extracellular-signal-regulated kinase/mitogenactivated protein kinase） core signalling modules to extracellular stimuli and biological responses. Biochemical Society symposium，1999， 64（07）: 29-48.

［11］ 黃能培.葛根芩連湯聯(lián)合二甲雙胍治療濕熱證2型糖尿病的療效.求醫(yī)問藥，2012，10（06）:299，868.

［12］ 張穎，蔡春沉.葛根芩連湯飲片治療2型糖尿病的療效觀察.遼寧中醫(yī)雜志， 2016，43（04）:783-785.

［13］ 趙瑛，李文亭，孟曉紅，等.葛根芩連湯與其有效部位群對代謝綜合征大鼠作用的比較.中藥藥理與臨床，2009，25（04）:7-10.

［14］ 張瑜，武斌，許建衛(wèi).黃芩藥理作用的研究進展.醫(yī)學(xué)綜述，2013，19（06）:1091-1093.

［15］ 張春靜.黃連藥理作用研究進展概述.科技創(chuàng)新與應(yīng)用，2013，45（05）:101.

ive】 Objective To explore the effect and mechanism of Gegen Qinlian Decoction（GQD）on the kidneys of diabetic rats in the ERK/ MAPK signal pathway. Methods Rats were induced by streptozotocin（STZ）as diabetic ones. Then rats were randomly divided into normal group，model group，low，medium and high dose with GQD treatment groups，the metformin group. Fasting blood glucose（FBG），serum creatinine（SCr），urine creatinine（UCr），and urinary total protein（UTP）were detected by biochemical detection after drug intervention for eight weeks；The renal tissue morphology changes were observed by PAS staining in light microscope；The p-ERK，ERK protein expression in renal tissue was analyzed by Western blot method. Results Compared with normal group，F(xiàn)BG，UTP，UCr，CCr were markedly increased in model group（P＜0.05）. The glomerular size was enlarged and the protein expression of p-ERK/ERK was increased. Compared with model group，F(xiàn)BG，UTP，UCr were decreased in GQD group（P＜0.05）. The vacuolation of renal tubular epithelial cells was lightened and the protein expression of p-ERK/ ERK in renal tissue was highly inhibited（P＜0.05）. Conclusion GQD can improve the ultrafi ltration of functional nephron，relieve the pathological changes and retard the progress of DN. GQD inhibited the protein expression of p-ERK by regulating the activity of ERK.

Diabetes mellitus Gegen Qinlian Decoction p-ERK ERK signal pathway

浙江省大學(xué)生新苗人才計劃項目（2015R410019）

310053 浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院