陳　潔　宋立強?

TNF-α基因的多態(tài)性與肺炎支原體肺炎的相關(guān)性分析

陳潔宋立強?

目的 探討人腫瘤壞死因子（TNF）-α-308位點的多態(tài)性，為人肺炎支原體肺炎疾病的預(yù)防及治療提供理論基礎(chǔ)。方法 選取肺炎支原體肺炎患者92例為觀察組，同期選擇與觀察組年齡匹配，無血緣關(guān)系的92例健康志愿者為對照組。采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）檢測TNF-α基因的多態(tài)性；分析兩組各個基因型的實際值和期望值，及各基因型和等位基因的分布頻率；利用DNA測序?qū)山MTNF-α-308位點的多態(tài)性與人肺炎支原體肺炎易感性之間的關(guān)系進行分析；ELISA檢測兩組患者血清TNF-α蛋白濃度。結(jié)果 TNF-α-308位點存在野生型（GG），雜合型（GA）和突變型（AA）三種基因型，兩組均以GG型為主，兩組各基因型的頻率間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。此外，研究還發(fā)現(xiàn)兩組間等位基因A和G分布差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且等位基因A與肺炎支原體肺炎易感性具有顯著的相關(guān)性（P＜0.05）；ELISA結(jié)果顯示觀察組血清TNF-α蛋白濃度高于對照組健康人群。在觀察組AA基因型的TNF-α蛋白的蛋白濃度顯著高于GG型（P＜0.05）。結(jié)論 人腫瘤壞死因子（TNF）-α-308位點的多態(tài)性與人肺炎支原體肺炎易感性具有一定的相關(guān)性。

腫瘤壞死因子-α 多態(tài)性 肺炎支原體肺炎 基因分型

支原體肺炎是肺炎支原體引起的急性呼吸道感染肺炎。該疾病一般起病緩和，但病程長，常引起多系統(tǒng)肺外的并發(fā)癥，導(dǎo)致支氣管炎及支氣管擴張等疾病。腫瘤壞死因子（TNF）是體內(nèi)具有多種生物活性的內(nèi)源性細(xì)胞因子。研究表明，TNF-α在肺炎支原體肺炎患者體內(nèi)含量顯著增高［1］，可刺激氣道平滑肌細(xì)胞分泌內(nèi)皮素-1，使氣道平滑肌收縮，氣道細(xì)胞增殖，引起氣道重構(gòu)［2］，促進支氣管上皮細(xì)胞及肺泡巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-6和IL-8［3］。但TNF-α在支原體肺炎中的具體作用機制還不完善。本文探討TNF-α基因-308位點多態(tài)性與肺炎支原體肺炎的關(guān)系，為該疾病的深入研究提供理論基礎(chǔ)。

1　臨床資料

1.1一般資料 2010年8月至2014年12月本院收治肺炎支原體肺炎患者92例為觀察組，同期選擇92例與觀察組年齡匹配，無血緣關(guān)系的健康志愿者為對照組。肺炎支原體肺炎患者的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《兒科學(xué)》第六版。所有研究對象均自愿簽署知情同意書。兩組性別及年齡差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2血清中TNF-α蛋白濃度的測定 空腹抽取靜脈血2ml，采用武漢博士德生物公司的試劑盒，用酶聯(lián)吸附實驗（ELISA）嚴(yán)格按照說明書進行血清中TNF-α蛋白水平的測定。

1.3DNA的提取和PCR擴增 采用酚-仿法提取血液中的DNA。根據(jù)Genbank基因序列rsl800629設(shè)計TNF-α引物序列，上游引物為5'-AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT-3'；下游引物為，5'-TCCTCCCTGCTCCGATTCCG-3'，引物由寶生物工程公司合成。RT-PCR總反應(yīng)體系為50μl（2.5μl dNTP，上下游引物各1μl，5μl 10×Taqbuffer，0.3μl E-Taq，1.5μl PCR產(chǎn)物，ddH2O 39.4μl）。反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃ 5min，30個循環(huán)的變性95℃，30s；退火55℃，45s；延伸72℃，1min，最后一個循環(huán)的72℃，5min的延伸。PCR產(chǎn)物通過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4RFLP基因分型 用Ncol內(nèi)切酶來對PCR擴增產(chǎn)物切割，然后通過瓊脂糖凝膠電泳來完成RFLP分型。反應(yīng)體系：PCR產(chǎn)物25μl，內(nèi)切酶1μl，緩沖液3μl，ddH2O 1μl。37℃酶切12h。取15μl酶切產(chǎn)物通過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。根據(jù)RFLP的分析結(jié)果，用切膠回收試劑盒回收不同基因型的擴增片段，純化后連接到pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化到DH5α，提取質(zhì)粒鑒定后測序。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件。數(shù)據(jù)以（x±s）表示。Hardy-Weinberg 平衡檢驗進行群體代表性分析。優(yōu)勢比（OR）及Miettinen方法計算的95%可信區(qū)間來檢測TNF-α基因-308位點的多態(tài)性與肺炎支原體肺炎的相關(guān)性［4］。通過Bonferroni t檢驗方法統(tǒng)計基因型與TNF-α間的關(guān)系［5］。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1PCR-RFLP基因分型 PCR產(chǎn)物經(jīng)檢驗特異性擴增良好，無非特異行擴增，片段大小與實際相符，可進行RFLP分析。對PCR產(chǎn)物進行Ncol內(nèi)切酶酶切的RFLP分析，經(jīng)瓊脂糖電泳檢測發(fā)現(xiàn)TNF-α存在多態(tài)性，共得到3種基因型GG、GA和AA（圖1a）。其中單一條帶的為兩種純合基因型，兩條帶為雜合型。將兩種純合型個體進行基因測序并通過Genbank進行BLAST比對發(fā)現(xiàn)，在TNF-α-308處存在多態(tài)性，其中GG為野生型，GA為雜合基因型，AA為突變型（見圖1b、c）

2.2Hardy-Weinberg平衡檢驗結(jié)果 根據(jù)PCRRFLP和基因測序測序的結(jié)果統(tǒng)計實驗個體中的GG、GA和AA基因型的數(shù)目，利用Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，計算觀察組和對照組各個基因型的實際值和期望值。通過χ2檢驗表明，本實驗選擇的實驗群體中的基因型頻率分布的期望值和實際值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），表明群體中TNF-α基因-308位點的基因型符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。進一步表明本研究采用的研究對象具有群體代表性（見表1）。

圖1　PCR-RFLP基因分型

表1　兩組TNF-α基因-308位點基因型的遺傳平衡檢驗

2.3TNF-α基因-308位點的基因型和等位基因的分布 觀察組三種基因型AA，AG和GG的頻率分別為5.43%、23.91%和70.65%，而對照組為1.09%，8.15%和91.85%，兩組均以GG基因為主，3種基因型的分布差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.16，P＜0.05）。觀察組A，G等位基因頻率的構(gòu)成比分別為17.39%和82.61%，而對照組為8.15%和91.85%，兩組間等位基因分布比較差異有統(tǒng)計學(xué)有意義（χ2=6.25，P＜0.05）。見表2。

表2　TNF-α基因-308位點的基因型和等位基因的分布頻率 ［n（%）］

2.4TNF-α基因-308位點的基因多態(tài)性和等位基因與肺炎支原體肺炎易感性分析 本研究通過AA和GA基因型對GG基因型和等位基因A對G的優(yōu)勢比（OR）的計算，來表征基因型與肺炎支原體肺炎感染的相關(guān)性。結(jié)果如表3所示，GA和AA基因型OR值均大于1，表明這兩種基因型人的發(fā)病風(fēng)險增加。但是經(jīng)過χ2檢驗，兩組之間P值均大于0.05，差異并不顯著。而觀察組等位基因A的基因頻率（17.39%）顯著高于對照組（8.15%）。上述結(jié)果說明等位基因A與肺炎支原體肺炎易感性有關(guān)聯(lián)，含有等位基因A個體的發(fā)病率為G的2.37倍。

表3　TNF-α基因-308位點的基因多態(tài)性和等位基因與肺炎支原體肺炎易感性的關(guān)系

2.5血清TNF-α蛋白濃度及與基因型的關(guān)聯(lián)分析 經(jīng)過酶聯(lián)反應(yīng)測得觀察組血清TNF-α蛋白濃度顯著高于對照組（見圖2）。進一步對觀察組TNF-α蛋白濃度與TNF-α基因-308位點基因多態(tài)性進行相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，觀察組中AA基因型患者TNF-α蛋白的蛋白濃度最高（16.52±0.53），其次是GA基因型（12.85±0.91），GG基因型患者TNF-α蛋白的蛋白濃度最低（10.34±1.24），且三組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2　觀察組和對照組間TNF-α蛋白濃度濃度的比較

3　討論

研究發(fā)現(xiàn)TNF-α啟動子區(qū)-308位點核苷酸的多態(tài)性與各種疾病的發(fā)病率顯著相關(guān)。Sakao等［6］用PCR技術(shù)檢測日本群體中慢性阻塞性肺疾?。–OPD）組和對照組血淋巴細(xì)胞的基因DNA，發(fā)現(xiàn)TNF-α基因型在兩者間有明顯不同，且-308位上AA純合子和GA雜合子基因型均使COPD的發(fā)病風(fēng)險增加。在我國江西、山東等地，TNF-α-308啟動子基因的多態(tài)性與支氣管哮喘發(fā)病的風(fēng)險有關(guān)［7-8］。另外，TNF-α-308位點的多態(tài)性與肺癌的易感性也有密切的關(guān)系。Shih等［9］通過Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)肺癌組TNF-α-308 G/A和A/A的基因型頻率高于G/G型。在本資料中，觀察組等位基因A的基因頻率高于對照組，含有等位基因A個體的發(fā)病率是G的2.37倍。表明等位基因A可能與肺炎支原體肺炎易感性之間具有一定的關(guān)聯(lián)。

TNF-α基因多態(tài)性與TNF-α的功能相關(guān)，基因啟動子區(qū)的多態(tài)性可能會影響其轉(zhuǎn)錄水平，進而影響疾病的發(fā)展和預(yù)后［10-11］。Gonzalez等［12］報道TNF-α啟動子區(qū)-308位點核苷酸G被A替換后，TNF-α基因轉(zhuǎn)錄效率增加7倍。體外研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α基因在-308位上有A/G的轉(zhuǎn)換，當(dāng)用脂多糖刺激后，A等位基因的雜合子個體產(chǎn)生的TNF-α較GG基因型多［13］。本資料結(jié)果顯示，TNF-α基因308位點處為AA基因型的肺炎支原體肺炎患者的TNF-α濃度顯著高于GA和GG基因型，表明TNF-α基因308位點處的G/A突變與肺炎支原體肺炎患者TNF-α的水平間具有重要的關(guān)系。TNF-α基因啟動子區(qū)域內(nèi)轉(zhuǎn)錄起始位點上游第308位點G/A突變能顯著影響TNF-α基因的表達水平。支原體肺炎患者血清中TNF-α的水平與支原體肺炎存在顯著相關(guān)性，其水平可為支原體肺炎診斷和治療提供理論依據(jù)和參考［14］。因此，TNF-α基因啟動子區(qū)域內(nèi)轉(zhuǎn)錄起始位點上游第308位點的突變對支原體肺炎病情的判斷和治療可能具有一定的作用。

綜上所述，肺炎支原體肺炎患者TNF-α基因在308位點處存在AA，GA和GG 3種基因型，且均與正常人出現(xiàn)頻率具有顯著性差異。進一步研究發(fā)現(xiàn)A等位基因可能是調(diào)控TNF-α基因在肺炎支原體肺炎患者表達的重要因素，且與肺炎支原體肺炎的發(fā)生具有異性的關(guān)聯(lián)。從TNF-α基因308位點處的G/A突變著手，可為肺炎支原體肺炎的診斷和治療提供一定的依據(jù)和方向。

［1］ 賀金娥，李靜，高春燕.肺炎支原體肺炎患兒血清細(xì)胞因子IL-6、TNF-α檢測及臨床價值.陜西醫(yī)學(xué)雜志，2015，44（9）:1151-1152.

［2］ 李壽軍，張云，武能舜，等.小兒支原體肺炎IL-6、IL-10、TNF-α檢測及其與病情嚴(yán)重程度的關(guān)系.南昌大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版）， 2012， 52（8）: 35-37.

［3］ 李芳，閆少鋒，蘇秀蘭.腫瘤壞死因子α基因多態(tài)性在慢性阻塞性肺疾病相關(guān)性的研究進展.內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2010，32（4）: 53-55.

［4］ 顏虹，徐勇勇，趙耐青.醫(yī)學(xué)統(tǒng)計學(xué).北京:人民衛(wèi)生出版社. 2005.86-91， 160-162.

［5］ 張勤， 徐寧迎， 賈青，等. 生物統(tǒng)計學(xué). 2版. 北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社. 2008: 65-121.

［6］ Sakao S， Tatumi K， Igari H， et al. Association of tumor necrosis factor-α gene promoter polymorphism with the presence of COPD. Am J Respir Crit Care Med， 2001， 163（2）:420-422.

［7］ Mahdaviani SA， Rezaei N， Moradi B， et al. Proinflammatory cytokine gene polymorphisms among Iranian patients with asthma. J Clin Immunol， 2009， 29（1）:57-62.

［8］ 郭宇玲，周世良.腫瘤壞死因子α啟動子基因多態(tài)性與支氣管哮喘及其嚴(yán)重程度的相關(guān)性研究.江西醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2004，44（5）:28-31.

［9］ 翟芳芝，李玉.腫瘤壞死因子-α基因多態(tài)性與支氣管哮喘相關(guān)性研究. 山東醫(yī)藥， 2004， 44（25）:4-6.

［10］ Shih C M， Lee Y L， Chiou H L， et al. Association of TNF-α polymorphism with susceptibility to and severity of non-small cell lung cancer. Lung Cancer，2005，52（1）:15-20.

［11］ Johannes C N，Sylvia S-J， Gunnstein B. Tumor Necrosis Factor-α Promoter-308/238 Polymorphism Association with Less Severe Disease in Ankylosing Spondylitis is Unrelated to Serum TNF-α and Does Not Predict TNF Inhibitor Response . The journal of Rheumatology， 2014， 41（8）:1675-7682.

［12］ Scardapane A， Ferrante R， Nozziang M， et al. TNF-α gene polymorphisms and juvenile idiopathic arthritis: Influence on disease outcome and therapeutic response . Seminars in Arthritis and Rheumatism， 2015，45（1）:35-41.

［13］ González S， Rodrigo L， Martínez-Borra J， et al. TNF-alpha 308A Promoter polymorphism is associated with enthanced TNF-alpha production and inflammatory activity in Crohn's patients with fistulizing disease. Am J Gastroenterol， 2003， 98（5）:1101-1106.

［14］ 孫軍鋒，高文杰，王偉，等.支原體肺炎患兒支原體肺炎患兒TNF-α、IL-6及IL-10的變化及其臨床意義. 海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2013，19（1）:50-57.

Objective To provides a theoretical basis for the prevention and treatment of the mycoplasma pneumoniae pneumonia by studing the single nucleotide polymorphism of human TNF-α-308. Methods The actual and expected value of each genotype in the disease group and control group and the diatribution frequency of the genotype and allele were calculated. A total of 92 cases in mycoplasma pneumoniae pneumonia（diease group）and 92 subjects in control healthy people（control group）were studied in the present study. Single nucleotide polymorphism in the TNF-α-308 were detected by PCR-RFLP. The actual and expected value of each genotype，and the diatribution frequency of the genotype and allele were calculated. The DNA sequencing analysis was used to detect TNF-α 308 site polymorphism，and analyze the relationship between susceptibility of mycoplasma pneumoniae pneumonia and TNF-α 308 site polymorphism. The concentration of serum TNF-α was measured using ELISA kits. Results There were wild type（GC），hybrid type（GA）and mutant type（AA）in the site of TNF-α-308 .The genotypes in diease and control group were GG in majority there genotypy in hunman the differences of genotype and allele above between two groups were all statistical signifi cant（P＜0.05），The difference of genotypes GA and AA were not signifi cance. There were remarkably relevance between allele A and the susceptibility of mycoplasma pneumoniae pneumonia（P＜0.05）. Serum level of TNF-α in disease group was signifi cantly higher than that in control group. Conclusions There is a certain connection between the single nucleotide polymorphism of human TNF-α-308 and the usceptibility of mycoplasma pneumoniae pneumonia

TNF-α Polymorphism Mycoplasma pneumoniae pneumonia Genotyping

710000 第四軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸科