沙紅蘭　何陳云　李　詠　劉　蓉　何愛琴?

ICAM-3蛋白表達在預測宮頸癌放射抵抗性中的價值

沙紅蘭何陳云李詠劉蓉何愛琴?

目的 探討細胞間粘附分子-3（ICAM-3）、血管內皮生長因子（VEGF）的蛋白表達水平與宮頸鱗癌放射抵抗性的相關性。方法 采用免疫組織化學S-P法檢測90例中晚期宮頸鱗癌患者癌組織中ICAM-3和VEGF的蛋白表達，所有患者均采用同步放化療。其中25例為放療后未控，65例為放療后緩解。結果 ICAM-3在90例宮頸鱗癌組織中的陽性表達54例（60.0%）；VEGF呈陽性表達56例（62.2%）。ICAM-3在宮頸鱗癌放療后未控組中的陽性表達率84.0%，放療后緩解組中的陽性表達率50.8%，兩組差異有統計學意義（P=0.008）；VEGF在宮頸鱗癌放療后未控組中的陽性表達率80.0%，放療后緩解組中的陽性表達率55.4%，兩組差異有統計學意義（P=0.031）。ICAM-3和VEGF高表達均與腫瘤病理分級及淋巴結轉移顯著相關，而與臨床分期無明顯相關性。結論 ICAM-3、VEGF蛋白高表達與宮頸鱗癌放射抵抗性相關，可作為預測宮頸癌放療敏感性的指標。

細胞間粘附分子-3 血管內皮生長因子 宮頸鱗癌 放射治療 免疫組化

細胞間粘附因子-3（ICAM-3）即CD50，屬于免疫球蛋白超家族，研究證明，ICAM-3與血液系統、淋巴系統腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關，并參與腫瘤細胞的免疫逃脫作用［1］。本課題前期研究發(fā)現［2］在宮頸鱗癌中的表達水平明顯高于宮頸上皮內瘤變（CINⅡ～Ⅲ）及正常宮頸。Young等基礎研究證明［3］，ICAM-3在放射抵抗的宮頸癌細胞株SiHa/R中表達水平上調，認為ICAM-3的高表達與宮頸癌細胞株放射抵抗性有關。本文探討ICAM-3和VEGF在預測宮頸癌放射抵抗中的價值，分析ICAM-3、VEGF高表達與病期及淋巴結轉移的相關性。

1　臨床資料

1.1一般資料 2010年1月至2011年12月南通大學附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤科行根治性放療后未控的存檔宮頸鱗癌組織標本25例，另選同期放療后完全緩解的宮頸鱗癌組織標本65例為對照組。所有患者取材前均未進行放療或化療，且臨床資料完整?；颊吣挲g43～71歲，平均年齡52.5歲。按2009年FIGO分期標準進行臨床分期，Ⅱb期42例、Ⅲ期48例。影像學提示淋巴結陽性35例、陰性55例。組織病理分級：Ⅰ～Ⅱ級52例、Ⅲ級38例。所有患者均給予同步放化療。外照射采用高能X線行前后對穿野治療：TD 4500～5000cGy.其中全盆野劑量TD 3000cGy，四野（中間擋鉛）劑量TD 1500～2000cGy，高劑量率腔內后裝治療4～5次，A點劑量700cGy/次。同步化療采用順鉑治療：30mg/（m2·周），4～6周。

1.2療效判斷標準 根據WHO實體瘤客觀療效評定標準，結合宮頸癌放療后病灶的變化情況，放療結束后3個月內原發(fā)腫瘤或部分腫瘤持續(xù)存在或盆腔內出現新的病灶為放療后未控；完成放療后1個月復查病灶完全消退，盆腔內未出現新的病灶為放療后緩解。

1.3ICAM-3H和VEGF檢測方法 將90例宮頸癌組織標本石蠟塊連續(xù)切片，每張厚度3～4μm。1張進行HE染色病理確認，免疫組化標記用玻片均經防脫片處理。分別由兩位病理科主任醫(yī)師進行免疫組化讀片，判定結果。兔抗人ICAM-3單克隆抗體購自R&D公司，兔抗人VEGF單克隆抗體、S-P免疫組化試劑盒購自北京中杉生物技術公司。采用S-P法（鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法）檢測。免疫標記陽性對照組為人體脾組織，陰性對照組用PBS（磷酸鹽緩沖液）替代第一抗體進行免疫標記操作。免疫組化程序嚴格按S-P試劑說明書進行。

1.4檢測結果分析方法 ICAM-3定位于細胞膜出現棕黃色顆粒，用半定量法分析結果，判斷標準如下：按染色細胞占細胞總數的比例分為5個等級：＜10%：0級；10%～25%：1級；25%～50%：2級；50%～75%：3級；＞75%：4級。根據細胞染色的強度分為4個等級：陰性：0級；淡黃色：1級；棕黃色：2級；棕褐色：3級。將染色細胞數評分與細胞染色強度評分相乘得出免疫染色評分，染色評分0分為陰性（-），1～4分為弱陽性（+），5～8分為陽性（++），9～12分為強陽性（+++）。VEGF免疫組化染色以細胞漿中出現棕黃色顆粒為其陽性判定標準。判斷標準如下：陽性細胞數＜1%為（-），陽性細胞數1%～10%為（+），陽性細胞數11%～50%為（++），陽性細胞數＞51%為（+++）。

1.5統計學方法 采用SPSS 11.0統計軟件。各組間率的比較采用χ2檢驗，相關性分析用Spearman等級相關分析法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1ICAM-3在放療未控組和緩解組中的表達情況 ICAM-3陽性表達主要位于癌細胞的細胞膜，陽性和陰性表達見圖1、2。90例宮頸鱗癌組織中的ICAM-3陽性表達54例。ICAM-3在放療后未控組中有21例呈陽性表達，陽性表達率84.0%。在放療后緩解組中有33例呈陽性表達，陽性表達率50.8%，兩組比較差異有統計學意義（χ2=6.98，P=0.008）。見表1。

圖1　宮頸鱗癌 ICAM-3（+）（×200）

圖2　宮頸鱗癌ICAM-3（+++）（×200）

表1　ICAM-3在宮頸鱗癌放療后未控組和緩解組中的表達（n）

2.2VEGF的表達結果 VEGF在宮頸癌組織中的表達主要位于腫瘤組織的細胞漿，呈彌漫性或散在分布的棕褐色顆粒，其陽性和陰性表達見圖3、4。90例宮頸癌中，VEGF呈高表達56例。VEGF在放療后未控組25例中有20例呈陽性表達，陽性表達率80.0%。在放療后緩解組中有36例呈陽性表達，陽性表達率55.4%，兩組比較差異有統計學意義（χ2=4.65，P=0.031）。見表2。

圖3　宮頸癌VEGF表達（-）（×400）

圖4　宮頸癌VEGF表達（++）（×400）

表2　VEGF在宮頸鱗癌放療后未控組和緩解組中的表達（n）

2.3CIAM-3、VEGF表達與臨床特征的相關性 見表3。

表3　ICAM-3、VEGF在不同病期、分級及淋巴結轉移中的表達［n（%）］

3　討論

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤，臨床上＞70%宮頸癌患者需接受放射治療。關于宮頸癌放射治療敏感性的影響因素已逐漸受到關注。國內外較多學者研究腫瘤放療敏感相關因子，但迄今為止，在預測宮頸癌放射敏感性方面的研究尚不充分。

細胞間粘附分子（ICAMs）指一類調節(jié)細胞與細胞間、細胞與細胞外基質間相互結合和起粘附作用的膜表面糖蛋白，目前發(fā)現有3種：ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3。本課題前期研究發(fā)現［2］，ICAM-3在CINⅢ和宮頸癌組織中高表達，而在正常宮頸組織中低表達，提示其表達水平與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展相關。本課題組前期采用PCR技術已證明ICAM-1的高表達與宮頸癌的放射抵抗相關［4］。有研究發(fā)現ICAM-3可與LFA-1結合通過分子結構而調節(jié)ICAM-1（CD54）/LFA-1的相互作用［5］。因此推測ICAM-3高表達與宮頸癌的放射抵抗相關。本資料顯示ICAM-3在放療后未控組中的表達高于緩解組，提示ICAM-3高表達與宮頸癌的放射抵抗有關。可能的機制是ICAM-3可能參與或調節(jié)VEGF的FAK信號途徑，FAK已被證實會誘導抑制輻射后的細胞凋亡［6-7］，從而引起宮頸癌放射抵抗性增加。因此臨床上在治療前通過檢測ICAM-3表達水平，預測宮頸癌的放療敏感性，進一步判斷預后和指導治療方案的制定。

Bachtiary B［8］等研究發(fā)現，宮頸癌患者放療前VEGF水平高者，放療后的近期腫瘤緩解率和遠期療效均相對較差。本資料結果顯示，VEGF在放療后未控組中的表達高于緩解組，差異有統計學意義（P＜0.05），與前述研究結果一致。VEGF引起腫瘤細胞放射抵抗的機制可能是：（1）放射治療通過激活EGFR而激活P13K/Akt通路，刺激VEGF受體高表達，進而誘導腫瘤新生血管的形成，促進腫瘤侵襲和轉移［9］。（2）缺氧可上調VEGF基因的表達，引起腫瘤自身侵襲性增加和對放化療的抗拒性增加［10］。

本資料結果提示ICAM-1和VEGF高表達與宮頸癌的病理分級和淋巴轉移相關。研究表明［11］，ICAM-3表達于血管及淋巴管內皮細胞，通過與細胞漿內酪氨酸磷酸化的小分子β-catenin結合，調節(jié)內皮細胞的增殖和血管新生，另外ICAM-1、ICAM-3等細胞粘附因子可能作為信號傳導分子調節(jié)內皮細胞間以及內皮細胞與細胞外基質間的粘附和去粘附，促進血管和淋巴管的增生，在腫瘤的浸潤和淋巴結轉移中發(fā)揮著重要作用。血管內皮生長因子（VEGF），是目前公認一種重要的促血管生成因子，研究發(fā)現［12］，VEGF通過選擇性與內皮細胞上的受體結合，使細胞內的Ca2+水平迅速升高，通過磷酸肌醇特異性磷酸脂酶C途徑，使細胞內肌醇三磷酸水平升高，轉導細胞內信號，從而使血管內皮細胞分裂增殖、促進血管生長和提高血管通透性，利于惡性腫瘤的侵襲和轉移。而和臨床分期無關。由于本資料選擇的是適合放療的Ⅱb～Ⅲ期宮頸鱗癌患者，結果可能未能反映所有臨床分期，還需進一步進行全面分期的研究。

［1］ 陳玲，于桂蘭，李元堂，等.ICAM-3在急性白血病中的作用.山東大學學報，2008，（6）:608-611.

［2］ 李詠，何愛琴.ICAM-3蛋白表達在宮頸鱗癌組織中的表達及臨床意義，中國婦幼保健，2013，28（29）:4873-4875.

［3］ Young Min Chung， Byoung-Gie Kim， Chang-Soo Park. Increased expression of ICAM-3 is associated with radiation resistance in cervical cancer. Cancer， 2005，117:194-201.

［4］ 何愛琴.宮頸癌組織ICAM-1和VEGF表達與放療敏感性的研究.中華腫瘤防治雜志，2014，21（4）:284-288.

［5］ Kobayashi R，Tawa A，Hanada R，et al.Extramedullary infiltration at diagnosis and prognosis in children with acute myelogenous leukemia.Pediatr Blood Cancer，2007，48（4）:393-398.

［6］ Kasahara T， Koguchi E， Funakoshi M， et al.Antiapoptotic action of focal adhesion kinase （FAK） against ionizing radiation. Antioxid Redox Signal，2002，4:491-499.

［7］ Moon HS， Park WI， Choi EA， et al.The expression and tyrosine phosphorylation of E-cadherin/catenin adhesion complex，and focal adhesion kinase in invasive cervical carcinomas. Int J Gynecol Cancer， 2003，13:640-646.

［8］ Bachtiary B， Selzer E， Knocke TH， et al. Serum VEGF levels in patients undergoing primary radiotherapy for cevical cancer impact on progression-free survival. Cancer Lett， 2002， 179（2）:197-203.

［9］ Prenzel N，FishcherOM，Streit S，et al.The epidermal growth factor receptor family as a central element for cellular signal transduction and diversification.Endocr Relat Cancer，2001，8（1）:11-31.

［10］ Kaluz S， Kaluzova M， Stanbridge EJ.Regulation of gene expression by hypoxia:integration of the HIF-transduced hypoxicsignal at the hypoxiaresponsive element.Clin Chim Acta ， 2008， 395（1-2）: 6-13.

［11］ 張文彩，譚玉珍.血小板內皮粘附因子1、血小板內皮粘附因子3和CD44在體外淋巴管新生中的作用.解剖學報，2005，36（1）:94-98.

［12］ 李夏芳.VEGF及其受體與卵巢癌關系的研究進展.贛南醫(yī)學院學報，2012，32（4）:633-635.

Objective To study the relationship between Intercellular Adhesion Molecule-3、Vascular endothelial growth factor With radioresistance of human cervical squamous cancer. Methods S-P immunohistochemical method was performed to detect the expression of ICAM-3 and VEGF in 90 patients with advanced cervical squamous cell carcinoma，of which 25 cases were non-well treated after radiotherapy，65 cases were well treated after radiotherapy. Result The positive expression level of ICAM-3 and VEGF were related to clinical stage and lymph nodes metastasis；The expression level of ICAM-3 in non-well treated group was higher than that in well treated group（84.0% vs 50.8%，P=0.008）. The expression level of VEGF in non-well treated group was higher than that in well treated group（80.0% vs 55.4%，P=0.031）. The expression of ICAM-3 and VEGF were signifi cantly related to lymph node metastasis and grade of differentiation，but no relation to clinicai stage. Conclusion The expressions of ICAM-3 and VEGF are related to radioresistance of cervical squamous cell carcinoma.

ICAM-3 VEGF cervical squamous cell carcinoma radiotherapy immunohistochemistry

江蘇省南通市衛(wèi)生科技計劃項目（20112KX11008）

226500 江蘇省如皋市人民醫(yī)院（沙紅蘭）

226361 南通大學附屬腫瘤醫(yī)院（何陳云 李詠 劉蓉何愛琴）