李鳴，金春梅，李紅旺，孫經(jīng)宇，宋賀，趙冠姝，于龍政

（延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，吉林延吉133000）

延邊某地長(zhǎng)角血蜱和全溝硬蜱體內(nèi)東方泰勒蟲的分子生物學(xué)檢測(cè)

李鳴，金春梅，李紅旺，孫經(jīng)宇，宋賀，趙冠姝，于龍政

（延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，吉林延吉133000）

為調(diào)查吉林省延邊地區(qū)自然生境內(nèi)游離蜱攜帶東方泰勒蟲的情況，以東方泰勒蟲主要表面蛋白基因（MPSP）基因?yàn)榘谢?，采用PCR方法對(duì)延邊地區(qū)自然生境內(nèi)的游離蜱DNA進(jìn)行擴(kuò)增。在長(zhǎng)角血蜱的DNA中檢測(cè)了東方泰勒蟲，檢出率為29%；而全溝硬蜱中沒有檢測(cè)到東方泰勒蟲。結(jié)果表明，自然生境中的游離長(zhǎng)角血蜱體內(nèi)攜帶著東方泰勒蟲。

蜱；東方泰勒蟲；長(zhǎng)角血蜱；全溝硬蜱

東方泰勒蟲（Theileria orientalisi）舊稱瑟氏泰勒蟲（Theileria sergenti），隸屬孢子蟲綱、梨形蟲亞綱、梨形蟲目、泰勒科、泰勒屬的血液原蟲，寄生于紅細(xì)胞或淋巴細(xì)胞內(nèi)，引起東方泰勒蟲病，該病臨床癥狀以高熱、消瘦、貧血、出血和體表淋巴結(jié)腫大為主［1］。東方泰勒蟲病是廣泛分布于世界各地，感染該病的牛常常會(huì)成為病原體的攜帶者，直接影響牛的健康發(fā)育和牛類產(chǎn)品的產(chǎn)量與質(zhì)量［2］。蜱是一類寄生在哺乳動(dòng)物、鳥類、爬行類和兩棲類脊椎動(dòng)物體表的節(jié)肢動(dòng)物，在刺叮宿主，吸食血液傳播人和多種動(dòng)物疾病，對(duì)人畜造成很大危害［3］。據(jù)報(bào)道，蜱可攜帶或傳播83種病毒、14種細(xì)菌、18種螺旋體、32種原蟲、1種支原體、1種巴爾通氏體［4］。目前牛東方泰勒蟲病引起了國(guó)內(nèi)外獸醫(yī)界的廣泛關(guān)注，對(duì)牛東方泰勒蟲的流行病調(diào)查增多，但多數(shù)集中在對(duì)牛體內(nèi)的東方泰勒蟲的調(diào)查，而對(duì)自然生境游離蜱體內(nèi)東方泰勒蟲的調(diào)查較少。本研究采用PCR方法，對(duì)吉林省延邊地區(qū)游離蜱進(jìn)行東方泰勒蟲檢測(cè)，旨在分析東方泰勒蟲在自然生境內(nèi)的流行情況。

1材料與方法

1.1樣本來源2014年5月-7月，在吉林省延邊地區(qū)采集的游離蜱，經(jīng)鑒定為長(zhǎng)角血蜱和全溝硬蜱［5］。

1.2蜱DNA的提取將蜱用超純水反復(fù)沖洗、剪碎，用Qiagen公司組織DNA提取試劑盒提取蜱DNA，操作步驟按照說明書進(jìn)行。

1.3引物根據(jù)Yu等（2011）報(bào)道［6］，合成特異性擴(kuò)增東方泰勒蟲MPSP基因的引物，分別為TsU 5′-CACGCTATGTTGTCCAAGAG-3′，TsR 5′-TGTGAGACTCAATGCGCCTA-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度853 bp。1.4PCR擴(kuò)增PCR擴(kuò)增體系為20 μL：10×PCR Buffer 2 μL，dNTP 2 μL，上下游引物各2 μL，DNA 2 μL，ddH2O 9.8 μL，rTaq酶0.2 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.5PCR產(chǎn)物判定陰性陽(yáng)性PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，通過紫外凝膠成像儀觀察結(jié)果，在875 bp處得到單一條帶的視為陽(yáng)性，無目的條帶的視為陰性。

2結(jié)果

2.1牛東方泰勒蟲PCR擴(kuò)增牛體表長(zhǎng)角血蜱和全溝硬蜱的DNA進(jìn)行牛東方泰勒蟲特異性表面蛋白MPSP基因進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果從長(zhǎng)角血蜱的DNA中擴(kuò)增出牛東方泰勒蟲特異的DNA片段，大小約為875 bp，與預(yù)期結(jié)果一致（見圖1），但未能從全溝硬蜱的DNA中擴(kuò)增出牛東方泰勒蟲特異的DNA片段（數(shù)據(jù)未顯示）。

圖1長(zhǎng)角血蜱體內(nèi)牛東方泰勒蟲MPSP基因PCR擴(kuò)增

2.2MPSP基因的序列測(cè)定與同源性分析測(cè)序結(jié)果表明，長(zhǎng)角血蜱DNA中擴(kuò)增出的MPSP基因的長(zhǎng)度為875 bp，包含一個(gè)完整閱讀框，共編碼283個(gè)氨基酸（圖2）。應(yīng)用DNAStar軟件將長(zhǎng)角血蜱體內(nèi)擴(kuò)增的MPSP基因與GenBank中查到的東方泰勒蟲甘肅寧縣株（FJ515689）、吉林琿春株（HQ322618、HQ322619、HQ322620、HQ322621）的MPSP基因進(jìn)行比較分析，核苷酸序列的同源性為88.3%～99.8%（圖3）。

2.3蜱體內(nèi)牛東方泰勒蟲的感染情況隨機(jī)對(duì)14只長(zhǎng)角血蜱和6只全溝硬蜱進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，來檢測(cè)牛東方泰勒蟲。其中全溝硬蜱沒有檢測(cè)到牛東方泰勒蟲，14只長(zhǎng)角血蜱有4只檢測(cè)到了牛東方泰勒蟲，感染率為29%。

圖2長(zhǎng)角血蜱體內(nèi)東方泰勒蟲MPSP部分基因序列及推導(dǎo)的氨基酸序列

圖3MPSP基因核苷酸同源性比較分析

3討論

近年來，隨著我國(guó)養(yǎng)牛業(yè)的不斷發(fā)展和牛只在不同牧區(qū)、不同省份之間的頻繁運(yùn)輸，東方泰勒蟲病的發(fā)生呈上升趨勢(shì)。在疫區(qū)，外地引進(jìn)牛只東方泰勒蟲病發(fā)病率和致死率均較高，給畜牧業(yè)帶來了較大的經(jīng)濟(jì)損失。蜱是牛東方泰勒蟲的傳播媒介，已知能傳播東方泰勒蟲蜱有長(zhǎng)角血蜱（Haemaphysalis longicornis）、嗜群血蜱（H.concinna）和日本血蜱（H.japonica）3種，經(jīng)過我們調(diào)查在吉林省延邊地區(qū)存在長(zhǎng)角血蜱和全溝硬蜱［5］。本試驗(yàn)提取了長(zhǎng)角血蜱和全溝硬蜱的DNA，通過PCR鑒定，初步判定延邊地區(qū)自然環(huán)境中的長(zhǎng)角血蜱含有東方泰勒蟲的DNA，感染率為29%，而在全溝硬蜱DNA中沒有檢測(cè)到東方泰勒蟲。東方泰勒蟲在自然界的長(zhǎng)角血蜱體內(nèi)是存在的，對(duì)放牧牛有潛在的感染風(fēng)險(xiǎn)，因此要加強(qiáng)對(duì)放牧牛的體表驅(qū)蜱工作。

DNA是生物體主要的遺傳物質(zhì)，其基本功能是遺傳信息的傳遞和表達(dá)。對(duì)DNA的來源的鑒定可以幫助我們對(duì)病原體的檢測(cè)。東方泰勒蟲可以存在長(zhǎng)角血蜱的馬氏管中，其核酸可以通過PCR方法檢測(cè)到，但是因?yàn)楹可?，所以有效的提取方法有助于病原體的檢測(cè)。本試驗(yàn)采用DNA試劑盒提取蜱的基因組DNA，通過DNA試劑盒法替代傳統(tǒng)的乙醇沉淀法提取基因組DNA，盡可能避免在傳統(tǒng)乙醇沉淀過程中因DNA沉淀不完全而導(dǎo)致的DNA損耗，獲取最大量的基因組DNA。

牛東方泰勒蟲MPSP基因是一種保守性蛋白基因，該基因在良性泰勒蟲屬中已作為流行病學(xué)調(diào)查和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究的標(biāo)志性蛋白基因［2］。引物的特異性和敏感性對(duì)病原體的檢測(cè)很重要。本試驗(yàn)中用到TsU和TsR引物是擴(kuò)增東方泰勒蟲MPSP的基因，MPSP基因錨定在東方泰勒蟲表面，含量相對(duì)豐富。TsU和TsR是一對(duì)檢測(cè)東方泰勒蟲特異性引物，廣泛用于東方泰勒蟲的檢測(cè)，提高了試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

［1］楊艷玲，張西臣，張國(guó)才，等.牛東方泰勒蟲P32主要表面蛋白基因的克隆與分析［J］.寄生蟲與醫(yī)學(xué)昆蟲學(xué)報(bào)，2007，04: 204-207.

［2］Inoue M，Van Nguyen D，Meas S，et al.Survey of Theileria parasite infection in cattle in Cambodia and Vietnam using piroplasm surface protein gene-specific polymerase chain reaction［J］.J Vet Med Sci，2001，63（10）：1155-1157.

［3］Chen Z，Yang X，Bu F，et al.Ticks（acari：ixodoidea:argasidae，ixodidae）of China［J］.Exp Appl Acarol，2010，51（4）：393-404.

［4］Nava，S，Guglielmone A A，Mangold A J，et al.An overview of systematics and evolution of ticks［J］.Front Biosci（Landmark Ed），2009，14（1）：2857-2877.

［5］于龍政，海旭南，許應(yīng)天，等.吉林省延邊地區(qū)自然生境內(nèi)蜱種類的調(diào)查［J］.國(guó)際醫(yī)學(xué)寄生蟲病雜志，2015，42（1）：22-23.

［6］Yu L，Zhang S，Liang W，et al.Epidemiological survey of Theileria parasite infection of cattle in Northeast China by allele-specific PCR［J］.J Vet Med Sci，2011，73（11）：1509-1512.

TheMolecular detection ofTheileria orientalisiinHaemaphysalis longicornisandIxodes persulcatusin Yanbian area

LI Ming，JIN Chun-mei，LI Hong-wang，SUN Jing-yu，SONG He，ZHAO Guan-shu，YU Long-zheng
（Department of Veterinary Medicine，Yanbian University，Yanji 133002，China）

In order to investigate the existence of Theileria orientalisi in free ticks in Yanbian area of Jilin province，the polymerase chain reaction（PCR）method was used to amplify major piroplasm surface protein（MPSP）gene of T.orientalisi.The MPSP gene was detected in Haemaphysalis longicornis DNA，and the detection rate was 29%.However，the MPSP gene was not detected in Ixodes persulcatus DNA samples.The results showed that the free H.longicornis in the natural habitat of Yanbian carried the T.orientalisi.

tick；Theileria orientalisi；Haemaphysalis longicornis；Ixodes persulcatus

YU Long-zheng

S857.74+6

A

0529-6005（2016）08-0090-02

2015-08-12

延邊大學(xué)科技計(jì)劃項(xiàng)目（201518）；延邊大學(xué)大學(xué)生第七屆科研項(xiàng)目（ydbksky2015227）；吉林省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（201534）

李鳴（1995-），男，本科生，就讀于動(dòng)物醫(yī)學(xué)專業(yè)，E-mail：389404597@qq.com

于龍政，E-mail：lzyu@ybu.edu.cn