高海洋，李高榮，師文慶，凌旭煒，李思東

（1.廣東海洋大學海洋與氣象學院，廣東 湛江 524088；2.廣東海洋大學理學院，廣東 湛江 524088；3.廣州市格棱生物科技開發(fā)有限公司吳川生物養(yǎng)殖基地，廣東 吳川 524000）

LED光照對螺旋藻生長及鋅富集的影響

高海洋1，李高榮1，師文慶2，凌旭煒3，李思東2

（1.廣東海洋大學海洋與氣象學院，廣東 湛江 524088；2.廣東海洋大學理學院，廣東 湛江 524088；3.廣州市格棱生物科技開發(fā)有限公司吳川生物養(yǎng)殖基地，廣東 吳川 524000）

采用LED光照技術研究光照波長、照度和光照時間對螺旋藻生長及鋅生物富集作用的影響。結果表明，不同波長LED光照下螺旋藻生物量增長的順序為紅光（655～665 nm）＞藍光（465～475 nm）＞綠光（522～532 nm）＞黃光（570～580 nm），與對照組比，光照14 d生物量增加為紅光組13.97%，藍光組10.12%，綠光組1.44%，黃光組則減少2.88%；不同波長LED光照對螺旋藻鋅富集作用的影響順序為黃光＞綠光＞藍光＞紅光，實驗8 d螺旋藻鋅含量趨于穩(wěn)定，與對照組比，黃光組增加43.73%，綠光組增加23.98%，藍光組增加14.29%，紅光組增加9.04%。以LED紅光做光源，在照度0～10 000 lx范圍內(nèi)，螺旋藻生物量與照度成正相關；在照度0～8 000 lx范圍內(nèi)，螺旋藻鋅含量與照度正相關；在光照時間0～6 h內(nèi)，螺旋藻生物量和鋅含量均隨LED紅光光照時間增加而增大。

螺旋藻；生長；鋅；生物富集；LED

螺旋藻是一種原核多細胞型絲狀微藻，屬于藍藻門、段殖藻目、顫藻科、螺旋藻屬［1］。螺旋藻含有豐富的營養(yǎng)成分及多種生物活性物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、氨基酸、不飽和脂肪酸、維生素、礦物元素、藻藍蛋白、藻多糖和β-胡蘿卜素等［2］，研究表明，螺旋藻及其提取物具有抗疲勞、耐缺氧、免疫調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)血脂、抑制腫瘤等生理功能［3-4］。

鋅是人體正常新陳代謝必需的一種微量元素。國內(nèi)外許多研究發(fā)現(xiàn)，與鋅有關的酶類至少有200多種，鋅在免疫系統(tǒng)發(fā)育和維持宿主防御功能中起決定性作用，尤其是鋅對人的智力發(fā)展具有極其重要的作用［5］。人體缺鋅時會導致生長發(fā)育不良，味覺障礙和免疫力下降等癥狀［6］。螺旋藻具有培養(yǎng)簡便，生長速率快，對鋅離子具有較強的生物富集能力等優(yōu)點，是鋅生物有機化的理想載體［7］。通過螺旋藻的生物富集轉化作用，可將無機鋅轉化為有機鋅，以提高鋅的生理活性與吸收率，從而獲得富含有機鋅的功能性螺旋藻。LED是發(fā)光二極管的簡稱，為全固體發(fā)光體，具有波長固定、光質(zhì)純度高、耗能少和低發(fā)熱等優(yōu)點［8］，研究其對藻類生長發(fā)育、物質(zhì)代謝及形態(tài)構建的影響已成為熱點［9］。

關于螺旋藻鋅富集的研究大多數(shù)集中在螺旋藻類型、鋅添加量和添加方式，以及照度、pH等［10-12］對螺旋藻富集鋅的影響，而系統(tǒng)地研究LED光照對螺旋藻富集鋅的影響鮮見報道。本研究LED光照波長、照度及光照時間對螺旋藻生長以及對鋅生物富集作用的影響，以期為富含有機鋅的功能性螺旋藻的生產(chǎn)提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 藻種

藻種為鈍頂螺旋藻，采自廣州市格棱生物科技開發(fā)有限公司吳川生物養(yǎng)殖基地，在實驗室中培養(yǎng)，備用。

1.2 實驗藥品和儀器

實驗藥品主要有碳酸氫鈉、硝酸鈉、氯化鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鉀、七水硫酸鋅等，均為分析純，微量元素溶液A5、B6直接購買。主要儀器有722S分光光度計、TAS-990原子吸收分光光度計、RXZ-280B人工氣候箱、ST-80C照度計、AuY120分析天平等。

1.3 接種和培養(yǎng)條件

以Zarrouk培養(yǎng)液作為實驗的基礎培養(yǎng)基［13］。在Zarrouk培養(yǎng)液中添加ZnSO4·7H2O，配制初始的Zn2+質(zhì)量濃度ρ始為7.00 mg/L［7］的實驗培養(yǎng)液。取對數(shù)生長期的藻種接入實驗培養(yǎng)液中，調(diào)節(jié)藻液的初始光密度D（560 nm）為0.100～0.200。實驗用1 000mL三角燒瓶，培養(yǎng)體積750mL，置于人工氣候箱中培養(yǎng)。除實驗設置改變條件外，基本培養(yǎng)條件為：溫度30℃，濕度90%，照度6 000 lx，光照時間12 h/d，每天定時攪拌3次。培養(yǎng)14 d。

1.4 實驗設置

LED光源波長分別為紅光（655～665 nm）、黃光（570～580 nm）、綠光（522～532 nm）、藍光（465～475 nm），對照組為日光燈，照度為6 000 lx，光照時間為4 h；選擇適宜的LED單色光，設定照度梯度為0、2 000、4 000、6 000、8 000、10 000 lx，光照時間為4 h；選擇適宜的LED單色光，照度為6 000 lx，設定光照時間梯度為0、2、4、6 h。每個實驗設兩個平行組。

1.5 生物量測定和生長曲線繪制

采用光密度法，使用 722S分光光度計，以Zarrouk培養(yǎng)液作空白，取混勻的藻液在560 nm波長下測定光密度 D（560 nm）。按照參考文獻［14］的實驗方法，得到藻液生物量ρ與D（560 nm）的線性回歸方程ρ = 0.603 4 D（560 nm）-0.012 9，培養(yǎng)過程中每天定時取樣測定并記錄D（560 nm）值，將每天測定的藻液D（560 nm）換算成生物量ρ（g/L）。以培養(yǎng)時間t為橫坐標，生物量ρ為縱坐標，繪制螺旋藻生長曲線。

1.6 鋅含量測定和鋅含量曲線繪制

每天定時從培養(yǎng)藻液中濾取1.00mL溶液，使用TAS-990原子吸收分光光度計測定溶液中剩余鋅的質(zhì)量濃度ρ余。

富集鋅質(zhì)量mZn=（ρ始-ρ余）V；

螺旋藻鋅質(zhì)量分數(shù) wZn= 富集鋅質(zhì)量 mZn/ 螺旋藻質(zhì)量msp；

以培養(yǎng)時間為橫坐標，螺旋藻鋅質(zhì)量分數(shù) wZn為縱坐標，繪制螺旋藻鋅含量wZn隨培養(yǎng)時間變化曲線。

2 結果與分析

2.1 LED光照波長對螺旋藻生長及鋅富集的影響

圖1和圖2分別表示在照度6 000 lx，光照時間4 h，不同波長LED光照下培養(yǎng)14 d的螺旋藻生長曲線和螺旋藻鋅含量變化曲線。如圖1所示，1-2 d時生長曲線的斜率較小，為培養(yǎng)適應期；之后曲線斜率增大，進入對數(shù)生長期；培養(yǎng)14 d后，螺旋藻生物量ρ達到最大。螺旋藻通過光照進行光合作用，增加細胞數(shù)量（生物量）。不同波長的光照對螺旋藻具有不同的吸收效率，導致光合作用效率不同，生物量的增長速度也各有差異。從圖1可見，不同波長LED光照對螺旋藻生長的影響順序為：紅光（655～665 nm）＞藍光（465～475 nm）＞綠光（522～532 nm）＞對照組＞黃光（570～580 nm）。紅光最好，培養(yǎng)14 d后螺旋藻生物量ρ從0.182 g/L增加到1.990 g/L，與對照組相比（1.746 g/L），提高了13.97%；藍光培養(yǎng)的螺旋藻生物量ρ為1.923 g/L，提高了10.12%；綠光培養(yǎng)的螺旋藻生物量ρ為1.771 g/L，提高了1.44%；黃光培養(yǎng)的螺旋藻生物量ρ為1.696 g/L，降低了2.88%。

在圖2的曲線中，2 d之前的斜率較大，并且不同波長LED光照的影響差異較小，可能是此期間螺旋藻對鋅的作用以物理吸附為主；之后曲線斜率變小，主要為生物吸收；實驗8 d螺旋藻鋅質(zhì)量分數(shù)wZn達到最大值，隨后趨于穩(wěn)定。螺旋藻通過光合作用將光能轉變?yōu)樯锬?，光照除了影響螺旋藻的生長外，還影響螺旋藻細胞對營養(yǎng)鹽的吸收。圖2顯示，不同波長LED光照對螺旋藻富集鋅的效果不同，黃光＞綠光＞藍光＞紅光＞對照組。與對照組相比，第8 d螺旋藻鋅質(zhì)量分數(shù)wZn，黃光的提高了43.73%，綠光的提高了23.98%，藍光的提高了14.29%，紅光的提高了9.04%，效果明顯。

圖2 LED光照波長對螺旋藻鋅含量的影響Fig.2 Effect of LED light wavelength on the content of zinc in spirulina

2.2 LED照度與螺旋藻生長及鋅富集的關系

以LED紅光為光源，光照時間4 h，研究照度與螺旋藻生長和螺旋藻鋅含量的關系。從圖3可見，生物量與照度的增加成正比，LED照度對螺旋藻生長的影響順序為：10 000 lx ＞ 8 000 lx＞6 000 lx＞4 000 lx＞2 000 lx＞對照組，照度10 000 lx，培養(yǎng)14 d后螺旋藻生物量ρ從0.175 g/L增加到2.057 g/L，與對照組相比（1.728 g/L），提高了15.36%。

圖3 LED紅光光照強度對螺旋藻生長的影響Fig.3 Effect of LED red light irradiation intensity on the growth of spirulina

由圖4可見，實驗1～ 6 d，螺旋藻鋅質(zhì)量分數(shù)wZn與照度成正比，10 000 lx＞8 000 lx、6 000 lx＞4 000 lx＞2 000 lx＞對照組。實驗10 d后鋅含量變化趨于穩(wěn)定，且差異逐漸變小。但8 d后，10 000 lx高強度光照的效果下降，在10 d時螺旋藻鋅富集情況見圖5，8 000 lx才是最佳照度。

圖4 LED紅光光照強度對螺旋藻鋅含量的影響Fig.4 Effect of LED red light irradiation intensity on the content of zinc in spirulina

圖5 10 d時螺旋藻鋅富集情況Fig.5 The zinc enrichment of spirulina in the 10th day

2.3 LED光照時間對螺旋藻生長及鋅富集的影響

圖6和圖7分別以LED紅光為光源，強度為6 000 lx，不同光照時間下培養(yǎng)14 d的螺旋藻生長曲線和螺旋藻鋅含量變化曲線。圖6表明，螺旋藻生物量ρ隨光照時間增加而增大，13 d時趨于穩(wěn)定。圖7表明，LED光照時間對螺旋藻鋅富集作用的影響，所得螺旋藻鋅質(zhì)量分數(shù)wZn均大于對照組，隨光照時間增加而增大。14 d后，光照6 h螺旋藻鋅質(zhì)量分數(shù)wZn為399.6 μg/g，與對照組（347.0 μg/g）相比，提高了15.16%；光照4 h螺旋藻鋅質(zhì)量分數(shù)wZn為384.8 μg/g，提高了10.89%；光照2 h螺旋藻鋅質(zhì)量分數(shù)wZn為370.9 μg/g，提高了6.89%。

圖6 LED紅光光照時間對螺旋藻生長的影響Fig.6 Effect of LED red light irradiation time on the growth of spirulina

圖7 LED紅光光照時間對螺旋藻鋅含量的影響Fig.7 Effect of LED red light irradiation time on the content of zinc in spirulina

3 討 論

3.1 LED光照波長、照度和光照時間對螺旋藻生長的影響

螺旋藻是光合自養(yǎng)生物，光合作用是螺旋藻最重要的生理過程，螺旋藻通過光合作用實現(xiàn)太陽能向生物能以及無機碳向有機碳的轉化。光照是螺旋藻光合作用的限制因子，在一定范圍內(nèi)，螺旋藻吸收光能的總量與光合作用的總量正相關，決定生物量的增加量及速度［1］。影響光能吸收總量的因素主要有光照波長、照度和光照時間。

螺旋藻對不同波長的光照具有不同的吸光效率，直接影響光能吸收總量，即光合作用總量，宏觀表現(xiàn)為生物量。螺旋藻光合作用的色素主要是葉綠素a、藻膽素和類胡蘿卜素。葉綠素a對光的吸收峰分別位于紅光區(qū)的680 nm和藍光區(qū)的440 nm附近，類胡蘿卜素的最大吸收帶在藍光區(qū)，藻膽素含藻紅素、藻藍素和異藻藍素，它們吸收光譜范圍較分散，最大值是在橙紅色部分，集中在紅光區(qū)［15］。由于螺旋藻進行光合作用的主要色素是葉綠素a和藻膽素，所以LED紅光和藍光對螺旋藻生長的促進效果最好［16-18］。

光能吸收總量在一定范圍內(nèi)還與照度和光照時間成正比關系。藻類生長最適照度范圍為2 000 ～10 000 lx［1］，當環(huán)境溫度和營養(yǎng)底物不限制藻類的生長時，螺旋藻的生長主要取決于照度，在一定范圍內(nèi)，隨照度增加總光合作用速率呈直線上升［19］。因此LED紅光在照度0～10 000 lx和光照時間0～6 h范圍內(nèi)，照度越大，光照時間越長，則越有利于螺旋藻的生長。

3.2 LED光照波長、照度和光照時間對螺旋藻鋅富集的影響

鋅是藻類正常生長和代謝的必需元素之一，可調(diào)控藻類細胞的生長與物質(zhì)積累［20］。藻類細胞主要是通過細胞外的結合與沉積和細胞內(nèi)的吸收與轉化，實現(xiàn)對金屬離子的富集作用［21］。一般認為，螺旋藻鋅富集作用包括兩個階段［22］。第一階段是物理吸附過程，與代謝無關。在該階段中鋅可能通過物理吸附及微沉淀、配位、離子交換等作用中的一種或幾種復合至細胞表面。在此過程中，金屬與生物物質(zhì)的作用較快，反應速率和離子濃度成正比，一般數(shù)小時完成。第二階段是生物吸收過程，該過程進行得較慢。在此階段中藻細胞與鋅的相互作用，不僅需要能量，而且需要某些特定酶的參與，其過程較為復雜，與藻體中蛋白質(zhì)、糖類、脂類等的代謝密切相關［23］。所以在培養(yǎng)的前2 d內(nèi)，螺旋藻鋅含量直線上升，不同光照波長、照度和光照時間幾無影響，主要進行物理吸附過程。2 d后，螺旋藻鋅含量增速減慢，鋅富集作用主要由生化過程控制，增速比物理吸附要慢得多。

光照是調(diào)節(jié)藻類生長和發(fā)育的重要生態(tài)因子，能影響藻類色素和某些活性物質(zhì)的合成，藻類酶的活性也受光照的影響［24］。有研究表明，光照不僅影響藻類生長，還是營養(yǎng)鹽吸收的重要因子［25］。黃光和綠光處于藻膽素的光能吸收區(qū)［26］，有利于藻膽蛋白的合成，黃光可促進螺旋藻多糖的合成和積累［18］，這些都有利于鋅富集。螺旋藻的鋅富集作用主要是生物吸收過程，受藻體中蛋白質(zhì)、糖類、脂類等代謝的影響。因此黃光對螺旋藻鋅富集作用的促進效果最好，綠光次之。照度是影響藻類生長、生化組成和物質(zhì)積累的重要環(huán)境因子，主要通過影響藻細胞的光合作用來調(diào)控對離子的富集作用［27］。黑暗或低光照均能降低藻細胞光合作用，從而降低細胞新陳代謝，使細胞表面大分子物質(zhì)發(fā)生改變，從而影響藻細胞對離子的富集；隨著照度的增加，藻細胞恢復光合作用，從而使細胞富集量增加［28］；而照度太高則不利于藻類的生長以及對營養(yǎng)鹽的吸收利用［29］。本實驗的結果顯示，照度為0～8 000 lx范圍內(nèi)，螺旋藻細胞對鋅的富集量隨著光照度的增加而增大，而10 000 lx在培養(yǎng)6 d前鋅的富集量最大，第6 d后富集速度減緩，低于6 000 lx和4 000 lx，證明了照度太大時會影響螺旋藻細胞鋅的富集。

LED光照時間對藻生長和鋅富集作用的影響具有同步增長的態(tài)勢，在一定范圍內(nèi)，光照時間越長，照度越大，越能促進螺旋藻的生長，也越有利于螺旋藻對鋅的富集。

4 結 論

1）不同波長LED光照對富鋅螺旋藻生長的影響順序為：紅光＞藍光＞綠光＞對照組＞黃光，對螺旋藻鋅富集作用的影響順序為：黃光＞綠光＞藍光＞紅光＞對照組。

2）以LED紅光做光源，在光照強度0～10 000 lx范圍內(nèi)，螺旋藻生物量與光照強度成正相關關系；在光照強度0～8 000 lx范圍內(nèi)，螺旋藻鋅含量與光照強度成正相關。

3）在光照時間0～6 h范圍內(nèi)，螺旋藻生物量和鋅含量均隨LED紅光光照時間增加而增大。

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（責任編輯：任萬森）

Effect of LED on Growth and Zinc Enrichment of Spirulina

GAO Hai-yang1，LI Gao-rong1，SHI Wen-qing2，LING Xu-wei3，LI Si-dong2
（1.College of Ocean and Meteorology，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China；2.College of Science，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China；3.Wuchuan Biological Breeding Base，Guangzhou City Green Biotechnology Development Co.，Ltd.，Wuchuan 524000，China）

Effects of light wavelength，light intensity and illumination time on the growth of spirulina and the biological enrichment of zinc in spirulina were studied using the LED technology.The results showed that the effect of different LED light wavelengths on the growth of spirulina was red light（655-665 nm） ＞ blue light（465-475 nm） ＞ green light（522-532 nm） ＞ yellow light（570-580 nm）.Compared with the control group，the final biomasses for red light，blue light，green light and yellow light were increased respectively by about 13.97%，10.12%，1.44% and -2.88%.The effect of different LED light wavelengths on the growth of zinc enrichment in spirulina was yellow light ＞ green light ＞blue light ＞ red light.Compared with that of the control group，the zinc contents of spirulina for yellow light，green light，blue light and red light after the 8 days were increased respectively by about 43.73%，23.98%，14.29% and 9.04%.Using LED red light as a light source，in the range of light intensity of 0-10 000 lx，the biomasses of spirulina were directly proportional to the intensity of red light；in the range of light intensity of 0～8 000 lx，the zinc content of spirulina was directly proportional to the intensity of red light.In the range of illumination time of 0～6 h，the effect of LED red light on the growth and zinccontent of spirulina had the synchronous trend with that of growth，which increased with the increase of the illumination time.

spirulina； growth； zinc； bioenrichment； LED

P745

A

1673-9159（2016）03-0065-06

10.3969/j.issn.1673-9159.2016.03.011

2015-11-20

廣東省科技計劃項目（2011B020415004）；湛江市科技專項（A14029）

高海洋（1988—），男，碩士，研究方向為海洋生物資源利用化學。E-mail： gaohaiyang2016@163.com

李思東（1960—），男，教授，研究方向為海洋應用化學，E-mail： lisidong2210491@163.com