陳樹河，常云勝，劉暉暉，周 維，丁 燏

（廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 // 廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088）

溶藻弧菌胱硫醚-β-合成酶基因cbs的克隆、生物學(xué)信息分析及原核表達(dá)

陳樹河，常云勝，劉暉暉，周 維，丁 燏

（廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 // 廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088）

提取溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）的總DNA，克隆溶藻弧菌胱硫醚-β-合成酶基因cbs，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，所克隆溶藻弧菌cbs基因的開放閱讀框?yàn)? 095 bp，編碼364個(gè)氨基酸。氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，溶藻弧菌的CBS蛋白與其他弧菌的CBS相似性極高，與副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）CBS氨基酸序列相似性達(dá)98%；CBS蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)為典型的“α+β”折疊模式，無跨膜結(jié)構(gòu)及信號(hào)肽。構(gòu)建cbs基因表達(dá)載體（pGEX-cbs）以表達(dá)重組蛋白，結(jié)果顯示，cbs基因在大腸桿菌BL21中高效表達(dá)，可表達(dá)出分子質(zhì)量約為66.4 ku的融合蛋白。對(duì)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)在37℃、IPTG濃度0.6mmol/L的條件下誘導(dǎo)5 h后，CBS蛋白的表達(dá)量較多，該蛋白主要以包涵體形式存在。

溶藻弧菌；胱硫醚-β-合成酶；基因克??；生物學(xué)信息分析；原核表達(dá)

溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）隸屬于弧菌科弧菌屬，可引起人類和水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物患?。?-2］。溶藻弧菌病的暴發(fā)對(duì)魚、蝦及貝類等水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物危害極大［3-5］，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)所造成的損失難以估量。目前，水產(chǎn)養(yǎng)殖上主要使用抗生素防治溶藻弧菌病。然而，抗生素的長期使用可增加耐藥菌的出現(xiàn)頻率，導(dǎo)致抗生素抑菌效果明顯下降甚至消失［6］。在弧菌對(duì)抗抗生素的過程中，抗氧化系統(tǒng)發(fā)揮著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，H2S作為信號(hào)分子，在植物抗環(huán)境脅迫［7］、動(dòng)物促炎［8］等方面有獨(dú)特功能，在細(xì)菌抗氧化過程中有重要作用［9］。Qabazard等［10］研究發(fā)現(xiàn)，H2S在上調(diào)秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）抗氧化基因表達(dá)的同時(shí)，亦可能維持其呼吸鏈復(fù)合體Ⅱ的活性，從而調(diào)節(jié)其氧化系統(tǒng)以對(duì)抗農(nóng)藥的毒害，延長壽命。對(duì)細(xì)菌而言，內(nèi)源性H2S亦可提高超氧物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）等抗氧化酶活力，從而提高其抗氧化能力，減輕抗生素的毒害［9］。

除植物外，在生物細(xì)胞中內(nèi)源性H2S的生成有兩支途徑。一支是由胱硫醚-β-合成酶（cystathionine-β-synthase，CBS）和胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine-γ-lyase，CSE）直接以半胱氨酸等含硫氨基酸為底物生成 H2S，另一支則是半胱氨酸經(jīng)半胱氨酸轉(zhuǎn)氨酶轉(zhuǎn)氨作用生成 3-巰基丙酮酸后，再由 3-巰基丙酮酸硫基轉(zhuǎn)移酶（3-MST）進(jìn)一步催化生成H2S。CBS、CSE和3-MST均為磷酸吡哆醛依賴酶，在動(dòng)物體內(nèi)的分布具有組織特異性［11-16］，在細(xì)菌中也不同時(shí)存在［9］。CBS在微生物細(xì)胞中可參與含硫氨基酸的生理代謝［17］和H2S的生物合成，提高微生物抗環(huán)境脅迫能力。目前在溶藻弧菌中僅發(fā)現(xiàn)編碼CBS蛋白的基因，推斷該酶在弧菌抵抗抗生素過程中發(fā)揮著不可替代的作用。因此，分析溶藻弧菌的CBS蛋白，對(duì)進(jìn)一步闡明H2S在溶藻弧菌抗氧化系統(tǒng)中的作用與地位有重要意義。

本研究克隆溶藻弧菌 cbs基因，并運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)其所編碼的蛋白進(jìn)行序列分析和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，同時(shí)構(gòu)建cbs基因大腸桿菌BL21重組表達(dá)菌株，對(duì)CBS蛋白的表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，這將有助于了解弧菌的抗氧化機(jī)制，為水產(chǎn)病害的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus HY9901）強(qiáng)毒株分離自湛江市海域的患病紅笛鯛傷口處，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定后由廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（下稱“本實(shí)驗(yàn)室”）保存［18］，Escherichia coli DH5α和E.coli BL21購自全式金公司。

1.1.2 質(zhì)粒 克隆質(zhì)粒pMD18-T購自TaKaRa公司，表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6p-1由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 主要試劑 細(xì)菌基因組取試劑盒購自全式金公司，DNA凝膠回收純化試劑盒購自Thermo公司，PCR引物由上海生工合成，T4連接酶、BamHI和XhoI購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 溶藻弧菌總DNA的提取 溶藻弧菌在TSA培養(yǎng)基于28℃的搖床中培養(yǎng)10 h，按照細(xì)菌基因組提取試劑盒說明書提取溶藻弧菌的總 DNA，于- 20℃條件下保存。

1.2.2 cbs基因的克隆 從GenBank中下載溶藻弧菌cbs基因序列（登錄號(hào)WP_005389952.1），設(shè)計(jì)引物cbs（s）（5' -CGGGATCCATGTGTACTGACC ACAATTG-3'）和cbs（a）（5' -CCGCTCGAGTTA AGCGTTAGTTGAGCCGC-3'），下劃線部分分別為BamHI和XhoI酶切位點(diǎn)。以溶藻弧菌總DNA為模板擴(kuò)增cbs基因，擴(kuò)增程序：94℃ 4 min；94℃ 40 s，56℃ 40 s，72℃ 1.5 min，35循環(huán)；72℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 mg/mL的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，回收，于- 20℃條件下保存。

1.2.3 pMD18-cbs克隆載體的構(gòu)建 連接成功后轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于Amp+的LB瓊脂平板，37℃條件下培養(yǎng)8 h。挑單菌落，接種于Amp+的LB液體培養(yǎng)基中，于搖床中以37℃、200 r/min條件培養(yǎng)0.5～1.0 h，經(jīng)菌落PCR檢測(cè)，將陽性菌送生工生物工程股份有限公司廣州分公司測(cè)序。

1.2.4 pGEX-cbs表達(dá)載體的構(gòu)建 經(jīng)測(cè)序確認(rèn)序列正確后，分別提取質(zhì)粒pGEX-6p-1和pMD18-cbs，經(jīng)BamHI和XhoI雙酶切后用T4DNA連接酶將酶切的 pGEX-6p-1和目的片段重組，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-cbs，轉(zhuǎn)化至E.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞，參照1.2.3的步驟，將陽性菌送測(cè)。

1.2.5 pGEX-cbs重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá) 將含有pGEX-cbs表達(dá)載體的大腸桿菌 BL21接種于Amp+的LB液體培養(yǎng)基中，在37℃的搖床200 r/min擴(kuò)培至D（600 nm）值達(dá)0.4～0.6時(shí)加入IPTG，使其終濃度為1mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。菌體預(yù)處理后全菌蛋白后經(jīng) SDS-PAGE分析。以含空載質(zhì)粒pGEX-6p-1的 E.coli BL21作為空白組，同時(shí)從IPTG濃度、時(shí)間和溫度3個(gè)方面優(yōu)化胱硫醚-β-合成酶的表達(dá)條件。

1.2.5.1 最佳誘導(dǎo)濃度的確定 在其他培養(yǎng)條件一致的前提下，IPTG誘導(dǎo)濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mmol/L，菌體預(yù)處理后進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.5.2 最佳誘導(dǎo)時(shí)間的確定 在最佳誘導(dǎo)濃度條件下，其他培養(yǎng)條件保持一致，分別誘導(dǎo)1、2、3、4、5、6、7 h，菌體預(yù)處理后進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.5.3 最佳誘導(dǎo)溫度的確定 在最佳誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)時(shí)間條件下，分別在 16、29、37℃下誘導(dǎo)培養(yǎng)，收集菌體后超聲波破碎至菌液澄清，離心收集上清和沉淀采用SDS-PAGE進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 cbs基因的克隆

PCR擴(kuò)增后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)出約1 200 bp的條帶（圖1：A），連接pMD18-T克隆載體后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)中，挑單菌落進(jìn)行菌落PCR得到與其大小一致的條帶（圖1：B）。

2.2 CBS蛋白的生物信息學(xué)分析

2.2.1 CBS蛋白的理化性質(zhì) 用 NCBⅠ上的 ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.Gov/gorf/gorf.html）分析cbs基因序列，發(fā)現(xiàn)該基因包含長度為1 095 bp的開放閱讀框（ORF），可編碼364個(gè)氨基酸（圖2）。在ExPASy（http：//web.expasy.Org/compute_pi/）網(wǎng)站上對(duì)溶藻弧菌HY9901的CBS蛋白進(jìn)行分析，顯示原子總數(shù)為5 629，理論分子質(zhì)量為40.410 ku，蛋白質(zhì)分子式為C1788H2787N491O548S15，理論等電點(diǎn)為 5.65，在大腸桿菌中表達(dá)的半衰期大于 10 h，脂肪指數(shù)（Aliphatic index）為81.76，親水性平均值（GRAVY）為-0.304，不穩(wěn)定指數(shù) ［instability index（ⅠⅠ） ］為39.63。此外，該蛋白中正（Arg+Lys）、負(fù)（Asp+Glu）電荷氨基酸殘基數(shù)分別為37 和 45，使得整個(gè)蛋白分子對(duì)外呈酸性。

圖1 cbs基因克隆及菌落PCR產(chǎn)物Fig.1 Cloning and identification PCR of cbs gene

2.2.2 與其他弧菌的CBS蛋白序列同源性分析通過 Blast（http://blast.ncbi.nlm.nih.Gov/Blast.cgi）對(duì)溶藻弧菌的 CBS蛋白序列與副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）、哈維氏弧菌（V.harveyi）、創(chuàng)傷弧菌（V.vulnificus）、燦爛弧菌（V.splendidus）、霍亂弧菌（V.cholerae）等進(jìn)行同源性對(duì)比，結(jié)果顯示，其同源性分別為98%、94%、89%、83%、80%，表明 CBS蛋白在弧菌中高度保守（圖 3）。運(yùn)用MEGA 6.0軟件將各弧菌及其他細(xì)菌的CBS蛋白氨基酸序列以NJ法構(gòu)建的構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示果溶藻弧菌 HY9901與副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）聚為一支，表明兩種弧菌間的親緣關(guān)系最為接近（圖4）。

圖3 藻弧菌CBS氨基酸序列與其他細(xì)菌的同源性比較Fig.3 Homology comparing of amino acid sequences of CBS protein among the bacteria

2.2.3 CBS蛋白的功能位點(diǎn)、親疏水性、跨膜區(qū)和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè) 經(jīng) SoftBerry-Psite（http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=psite&group=programs&subgroup=proloc）預(yù)測(cè)，CBS蛋白含有4個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、5個(gè)酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)和1個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)等10個(gè)磷酸化位點(diǎn)，此外還具有N-糖基化位點(diǎn)、酰胺化位點(diǎn)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶信號(hào)位點(diǎn)和Prenyl group binding site（CAAX box）各1個(gè)（圖2）。由ProtScale（http://web.expasy.org/protscale/）預(yù)測(cè)的CBS蛋白親疏水性結(jié)果（圖5）可知，CBS蛋白質(zhì)序列的第99個(gè)氨基酸分值最高達(dá)2.522，表明該處疏水性最強(qiáng)，第304個(gè)氨基酸分值最低達(dá) - 2.411，表明該處親水性最強(qiáng)。由圖5可知，整個(gè)CBS蛋白序列的親水氨基酸殘基數(shù)目從整體上大于疏水氨基酸殘基數(shù)目，且該蛋白的親水區(qū)集中分布在第106～337位氨基酸間，表明CBS蛋白為可溶性蛋白，與ExPASy的親水性預(yù)測(cè)一致。經(jīng) TMHMM Server 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，該蛋白不存在跨膜區(qū)（圖6）。利用SignalP 4.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/）對(duì)CBS蛋白進(jìn)行信號(hào)肽序列預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)剪切位置分值C、信號(hào)肽分值S和綜合值Y均在0～0.2之間，大大低于0.5的閾值，說明其無明顯的信號(hào)肽切割位點(diǎn)，表明該蛋白不屬于分泌型蛋白（圖 7）。用 PSORT II Prediction（http://psort.hgc.jp/form.html）對(duì)CBS蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，該蛋白僅分布于細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)中，可能性為38.1%，這與該蛋白不存在跨膜區(qū)和不屬于分泌型蛋白的預(yù)測(cè)結(jié)果相互印證。

圖4 鄰接法構(gòu)建的CBS氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Hylogenetic tree of amino acid sequence of CBS protein by neighbour-joining method

2.2.4 CBS蛋白質(zhì)的功能域及高級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)在NCBI保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫CDD（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/lexington/lexington.cgi）網(wǎng)站上分析該蛋白序列中的功能結(jié)構(gòu)域（圖8），結(jié)果均發(fā)現(xiàn)第23～336位存在Trp-synth-beta-II superfamily的保守結(jié)構(gòu)域。經(jīng)SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html）預(yù)測(cè)，CBS蛋白中的二級(jí)結(jié)構(gòu)中存在由140個(gè)氨基酸組成α螺旋（Alpha helix）、66個(gè) 氨 基 酸組成伸展片段（Extended strand）、40個(gè)氨基酸組成β轉(zhuǎn)角（Beta turn）、118個(gè)氨基酸組成無規(guī)則卷曲（Random coil），分別占CBS蛋白序列的 38.46%、18.13%、10.99%、32.42%（圖9）。以SWISS-MODEL網(wǎng)站（http://swissmodel.expasy.org/）對(duì)CBS蛋白進(jìn)行同源建模后，得到 CBS三級(jí)結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，CBS結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，且與果蠅（Drosophila）的CBS蛋白A鏈有著極其相似的構(gòu)型（圖10）。

2.3 原核表達(dá)

cbs基因在IPTG誘導(dǎo)下，表達(dá)出約66.4 ku的融合蛋白，其中 pGEX-6p-1表達(dá)的標(biāo)簽蛋白約為26 ku，則CBS蛋白的分子質(zhì)量為40.4 ku，與所預(yù)測(cè)的分子質(zhì)量相一致?？瞻捉M未發(fā)現(xiàn)融合蛋白的條帶，說明表達(dá)載體的構(gòu)建及原核表達(dá)成功（圖11）。

圖5 CBS蛋白親疏水性預(yù)測(cè)Fig.5 Predicted hydrophobicity of CBS protein

圖6 溶藻弧菌CBS蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.6 TMHs prediction of CBS protein in Vibrio alginolyticus HY9901

圖7 溶藻弧菌CBS蛋白質(zhì)的信號(hào)肽/序列預(yù)測(cè)Fig.7 TMHs prediction of CBS protein in V.alginolyticus

圖8 預(yù)測(cè)的CBS蛋白保守結(jié)構(gòu)域Fig.8 Conserved domain prediction of CBS protein

圖9 溶藻弧菌CBS蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)的二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.9 Secondary structure prediction domains of CBS protein in Vibrio alginolyticus HY9901

圖10 溶藻弧菌（A）、果蠅（B） CBS的三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.10 Three-dimensional structure of CBS in Vibrio alginolyticus（A） and Drosophila（B）

圖12可知，IPTG濃度0～1.0mmol/L時(shí)，cbs表達(dá)量先增加后回落，0.6mmol/L時(shí)表達(dá)量最高（圖12）；在最佳誘導(dǎo)濃度條件下，誘導(dǎo)5 h后CBS的表達(dá)量達(dá)到最大（圖 13）；在最佳誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)時(shí)間條件下，CBS的最適誘導(dǎo)溫度為37℃（圖14）。

在最佳的IPTG濃度、時(shí)間條件下誘導(dǎo)CBS表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在 16、29、37℃誘導(dǎo)時(shí)沉淀和上清中均有融合蛋白條帶，但在3個(gè)溫度下上清液的融合蛋白條帶均不明顯，在 29、37℃條件下誘導(dǎo)時(shí)沉淀中有較明顯蛋白條帶，且 37℃條件下誘導(dǎo)時(shí)沉淀中蛋白條帶最亮，說明CBS蛋白在這2個(gè)溫度下表達(dá)時(shí)以包涵體形式存在于E.coli 中（圖14）。

圖11 CBS原核表達(dá)分析Fig.11 Analysis of CBS prokaryotic expression

圖12 IPTG誘導(dǎo)濃度的優(yōu)化Fig.12 Optimization of induction concentration

圖13 IPTG誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化Fig.13 The optimization of induction time

圖14 IPTG誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化以及沉淀和上清中蛋白含量的比較Fig.14 Optimization of induction temperature and comparison of protein concentration between the precipitation and the supernatant

3 討論

3.1 溶藻弧菌CBS蛋白的生物信息學(xué)分析

CBS蛋白作為合成H2S的酶類，可催化信號(hào)分子的形成，在生物機(jī)體的硫代謝過程中扮演著重要的角色。本研究以NCBI 網(wǎng)站上所公布的cbs基因序列為模版設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增得1 095 bp的cbs基因序列，可編碼含364個(gè)氨基酸的CBS蛋白。比對(duì)各弧菌CBS蛋白的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)CBS蛋白在弧菌中高度相似，說明該蛋白在弧菌進(jìn)化歷程中比較穩(wěn)定，可能與弧菌適應(yīng)環(huán)境有關(guān)?；?CBS的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹表明，各弧菌聚為一大族，其中溶藻弧菌HY9901與副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）聚為同一亞族，表明它們之間親緣關(guān)系較近，這與形態(tài)學(xué)和生化特征分類結(jié)果基本一致。根據(jù)氨基酸序列比對(duì)結(jié)果，推測(cè)CBS蛋白可能作為弧菌屬的共同抗原，在弧菌致病過程中發(fā)揮著作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，CBS蛋白含有4個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、5個(gè)酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)和1個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)等多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，此外還具有N-糖基化位點(diǎn)、酰胺化位點(diǎn)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶信號(hào)位點(diǎn)和Prenyl group binding site（CAAX box） 各1個(gè)。磷酸化是生物最為常見的蛋白翻譯后修飾［19-20］，可提高蛋白作用的專一性的效率。雖然溶藻弧菌中缺乏對(duì)翻譯后蛋白深加工的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，無法進(jìn)行翻譯后糖基化位或酰胺化等修飾，但其蛋白質(zhì)的磷酸化修飾并不受此影響［21］，這為CBS在合成內(nèi)源性H2S的生理過程中提供精確的調(diào)控。在后續(xù)的研究中，可以通過構(gòu)建磷酸化位點(diǎn)缺失的突變株來對(duì)CBS蛋白進(jìn)行更為詳盡的功能分析。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白為可溶性蛋白，不存在跨膜區(qū)，亦無明顯的信號(hào)肽切割位點(diǎn)，說明該蛋白僅在細(xì)胞周質(zhì)中發(fā)揮生理作用，這與亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果相吻合，但目前并無直接證據(jù)表明CBS蛋白與溶藻弧菌的致病性無關(guān)。

本研究預(yù)測(cè)，CBS蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)含有由140個(gè)氨基酸組成的α螺旋（Alpha helix）和40個(gè)氨基酸組成的β轉(zhuǎn)角（Beta turn），這符合“α+β”的折疊模式［22］。該二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)一步折疊成介于二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的Trp-synth-beta-II superfamily（色氨酸合成酶β-II超家族）的保守結(jié)構(gòu)域。色氨酸合成酶可以L-半胱氨酸和吲哚為原料合成L-色氨酸［23］，這表明CBS蛋白可作為多功能酶在H2S生成量過高時(shí)通過消耗L-半胱氨酸含量以下調(diào)H2S的生物合成，從而防止細(xì)胞過度抗氧化。從CBS的三級(jí)結(jié)構(gòu)可發(fā)現(xiàn)，該蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)與果蠅的CBS蛋白A鏈極為相似，說明其在微生物和動(dòng)物的進(jìn)化歷程中極其保守，推測(cè)溶藻弧菌與果蠅的CBS蛋白可能來自相同的遠(yuǎn)古基因。

3.2 溶藻弧菌cbs 基因的原核表達(dá)

目的基因在大腸桿菌中的表達(dá)主要受誘導(dǎo)物濃度、誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)溫度等因素影響。IPTG雖可誘導(dǎo)CBS蛋白的表達(dá)，但其本身有一定毒性［24］，誘導(dǎo)物濃度過高反而抑制蛋白的表達(dá)，使目的蛋白的表達(dá)水平隨誘導(dǎo)物濃度增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在誘導(dǎo)物濃度0.6mmol/L時(shí)CBS蛋白表達(dá)量最大。雖然IPTG可在菌體中穩(wěn)定存在并持續(xù)誘導(dǎo)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，但基因表達(dá)水平存在相應(yīng)的閾值，到達(dá)這一閾值后，基因轉(zhuǎn)錄會(huì)受到負(fù)反饋調(diào)節(jié)［25］。隨著表達(dá)蛋白的積累，蛋白的表達(dá)水平受到調(diào)控［26］，誘導(dǎo)5 h后CBS蛋白表達(dá)量不再增加。對(duì)大腸桿菌而言，其最適生長溫度接近37℃［27］。本研究中，在該溫度下CBS蛋白表達(dá)量最大，且以包涵體形式存在。王利群等［28］研究表明，較低溫度更利于大腸桿菌（DE3）增加目的蛋白的可溶性，可能與低溫環(huán)境下可增加蛋白構(gòu)象的準(zhǔn)確性［29］、促使其疏水和親水側(cè)鏈基團(tuán)正確排布有關(guān)，但本研究顯示，較低溫度下（16、29℃）上清液中目的蛋白含量并不顯著增加，說明通過降低溫度而增加可溶性蛋白的方法并不適用于所有大腸桿菌。因此，可通過在原核表達(dá)過程中使用融合標(biāo)簽［30］、目的蛋白與分子伴侶共表達(dá)［31］以及在培養(yǎng)基中加入山梨醇等穩(wěn)定蛋白三維構(gòu)象的物質(zhì)［32］等方法提高可溶性蛋白產(chǎn)量，便于后續(xù)的回收和純化。

4 小 結(jié)

本研究克隆出溶藻弧菌cbs基因。生物信息學(xué)分析顯示，溶藻弧菌的 CBS 蛋白序列與各種細(xì)菌的相似性較高，其三級(jí)結(jié)構(gòu)與果蠅的CBS蛋白A鏈相似性極高，表明CBS蛋白在生物的進(jìn)化歷程中極其保守。原核表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在37℃、IPTG 濃度0.6mmol/L的條件下誘導(dǎo)5 h目的蛋白的表達(dá)量最高，主要以包涵體形式存在。在純化蛋白時(shí)，應(yīng)注意在溶解包涵體的過程中保持蛋白的生物活性。今后可利用純化的 CBS蛋白開展相關(guān)的免疫抗原研究，以制備高效的弧菌疫苗。

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（責(zé)任編輯：劉慶穎）

Cloning，Bioinformatics Analysis and Prokaryotic Expression of Cystathionine-β-Synthase Gene cbs from Vibrio alginolyticus

CHEN Shu-he，CHANG Yun-sheng，LIU Hui-hui，ZHOU Wei，DING Yu
（Fisheries College of Guangdong Ocean University // Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemilogy for Aquatic Economic Animals，Zhanjiang 524088，China）

The cystathionine-β-synthase gene cbs from Vibrio alginolyticus was cloned，and then the CBS protein was analyzed by bioinformatics method.The result shows that the open reading frame（ORF） of gene cbs is 1 095 bp and encodes 364 amino acids.The amino acid sequence alignment shows that there exists the higher homology of the CBS between V.alginolyticus and other Vibrios，with close relations to those of V.parahaemolyticus with about 98% homology.The secondary structure of CBS protein is a typical fold of “α + β” without signal peptide and transmembrane.A prokaryotic expression vector（pGEX-cbs） is constructed to express recombinant protein，and then the gene cbs is expressed highly in the recombinant E.coli BL21，with approximately 66.4 ku exogenous proteins in SDS-PAGE.The optimal induction conditions shows that it can achieve higher protein expressions when induced by 0.6mmol/L of IPTG at 37℃ for 5 h.

Vibrio alginolyticus； cystathionine-β-synthase； gene cloning； bioinformatics analysis；prokaryotic expression

Q75

A

1673-9159（2016）03-0020-09

10.3969/j.issn.1673-9159.2016.03.004

2015-01-08

廣東省自然科學(xué)基金（2014A030313604）；廣東海洋大學(xué)“創(chuàng)新強(qiáng)校工程”項(xiàng)目［Q14196（2013050207）］

陳樹河，男，碩士研究生，研究方向?yàn)楹Ｑ笊飳W(xué)。E-mail：cshgdou@163.com

丁 燏（1971-），男，博士，教授，研究方向?yàn)楹Ｑ笪⑸锱c水產(chǎn)病害，E-mail：dingy@gdou.edu.cn